Name: a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von der Universität La Sapienza und der italienischen Mukoviszidose Research Foundation (Projekt FFC #11/2014 verabschiedeten FFC Delegationen aus Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny und Pavia). Teil dieser Arbeit wurde auch von FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020 unterstützt.
Wir sind dankbar, dass Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genua, Italien) für die Bereitstellung der bronchialen Epithelzellen.

1. Zelle-Vorbereitung
<ol><li>Samen 2.5x106 Zellen in 10 mL von Minimum wesentliches Medium (MEM) ergänzt mit 2 mM Glutamin (MEMg), plus 10 % fetalen bovine Serum (FBS), Antibiotika (0,1 mg/mL Penicillin und Streptomycin) und Puromycin (0,5 µg/mL für die Auswahl und Pflege der Zelllinie) in einem Kolben T75. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C und 5 % CO2 , für 2 Tage. Überprüfen Sie vor Beginn des Experiments, Zusammenfluss von Zellen unter einem inversen Mikroskop. Hinweis: Für das ...

<ol>
	<li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+epithelial+wound+detection.">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li><li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complicated+skin,+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens?.">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?.</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. 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Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li><li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37.">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li><li>Tjabringa, G. 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Zellmigration ist ein wesentlicher Prozess in vielen physiologischen und pathologischen Veranstaltungen einschließlich der Wundheilung, Embryonalentwicklung und Krebsmetastasen. Das grundlegende Verfahren zur Zelle Migration in-vitro- Studie beinhaltet: (i) die Schaffung einer Zelle Monolage, (Ii) die Produktion einer Pseudo-Wunde in der konfluierende Schicht von Zellen, (Iii) die Erfassung der Bilder in unterschiedlichen Zeitabständen bis Wunde Schließung erreicht ist , und (iv) die Analyse der Bildfolge um ...

Es ist weitgehend bekannt, dass die Wundheilung bei Tieren ist ein fundamentaler Prozess die Integrität und die normale Funktion der Gewebeschichten nach Verletzung1wieder herzustellen. Trotz epithelialen Oberflächen der äußeren Umgebung (z. B. der Atemwege, Haut und Magen-Darm-Trakte) bilden eine schützende Barriere von physikalischen und chemischen Beleidigungen, die Bildung von Wunden kann leicht auftreten, vor allem nach Chirurgie oder mikrobielle Infektionen2. Wie beispielsweise Besiedlung des Lungengewebes durch opportunistische bakterielle Erreger Pseudomonas Aeruginosa, vor allem bei zystischer Fibrose (CF) erkrankten führt um zu Schädigungen der Atemwege Epithel mit daraus resultierenden Atemstillstand3, 4. Wundheilung ist eine komplexe Host-Repair-Mechanismus zur Wiederherstellung der normalen Architektur von einem verletzten Gewebe5. Es zeichnet sich durch eine anfängliche Entzündung, gefolgt von einer Regenerierung umfasst Epithelisierung, Angiogenese und Gewebe Umbau mit Produktion von Kollagen und Zelle Differenzierung6,7,8 . Epitheliale Integrität sicherzustellen und mikrobieller Vermehrung kontrollieren, produzieren alle lebenden Organismen Verteidigung Moleküle, einschließlich antimikrobielle Peptide (AMPs)9,10. Die Wundheilung ist sehr schwierig, in-vitro- aufgrund des Fehlens von Zellenrückstand und komplexen Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen zu simulieren. Aber die in-vitro- Fähigkeit eines Peptids durch die Stimulierung die Schließung einer Pseudo-Wunde beschleunigen Migration von Epithelzellen ist bezeichnend für seine Fähigkeit zu heilen eine kompromittierte Epithel. In der Tat Zellwanderung ist eine Bandbreitenbegrenzung Veranstaltung bei der Wundheilung, und Studium der Faktoren, die Zellwanderung beeinflussen können Ziel Therapien für eine verbesserte Wundheilung hilft.
Hierbei ist ein hoch reproduzierbarer experimentelle Assay vorgesehen, basierend auf Spezialsilikon Kultur Einsätze, Zelle Migration in Vitrozu bewerten. Es basiert auf der Schaffung einer 500 μm Lücke (Pseudo-Wunde) auf einer Monoschicht konfluierende Zelle. Die Zellen am Rand des Feldes künstliche "verletzten" startet in den zellfreien Bereich Migration, bilden neue Zell-Zell-Kontakte. Die Kultur einfügen stellt ein neues Tool für schnelle Wundheilung Experimente. Zwei Stauseen, die durch eine 500 μm Wand getrennt werden, und sie können richtig platziert werden, in einem 3 cm Schüssel Teller oder in den Brunnen von einem 12-Well-Platte. Jedes Fach des Einsatzes mit einer Zellsuspension füllen kann Zellen wachsen in jedem ausgewiesenen Bereich bis zum Zusammenfluss, während Entfernung des Einsatzes eine saubere zellfreie Lücke von etwa 500 μm (die gleiche Breite wie die Trennmauer) zu erzeugen. Eine ordnungsgemäße Zellkulturmedium, ergänzt mit einer Testverbindung können dann hinzugefügt werden, in die Schüssel Teller/gut. Danach kann der Lückenschluss in unterschiedlichen Zeitabständen unter einem inversen Mikroskop, vorzugsweise eine, die mit einer Videokamera ausgestattet, für die Bildaufnahme visualisiert werden. Schließlich ermöglicht die Messung von Veränderungen im Bereich Zelle abgedeckt durch die Web-basierte automatische Bild-Analyse-Programm die Quantifizierung der Geschwindigkeit der Wunde Schließung und Zelle Migration. Insgesamt ist diese Methode ein Schritt nach vorn in Bezug auf die klassische Assay, wo ein Kratzer erfolgt manuell durch Eingrabung konfluierende Zelle Monolagen mit einer sterilen Nadel oder eine Pipette Tipp11. In der Tat das letzte Verfahren zu zerstören die Kunststoff Boden der Schale Platte/gut und die Oberflächenbeschichtung, Falten zu schaffen. Darüber hinaus muss die "Verletzte" Bereich keine klar definierte Breite über die gesamte Länge der Lücke, da dies stark von den Forschern auf die Nadelspitze ausgeübte Druck abhängig. Darüber hinaus können die verdrängt Zellen an den Rändern des Kratzers Klumpen von lebenden und toten Zellen bilden; Darüber hinaus kann die Verbreitung von lebenden Zellen in den "verletzten" Bereich mit einer Geschwindigkeit von Zellwanderung, Generierung von nicht reproduzierbaren Ergebnisse12stören.
Darüber hinaus durch ein Rubbellos Bild-Analyse-Plattform erhalten schnell (innerhalb von Minuten) quantitative Daten über das Wanderungsverhalten der markierten Zellen ohne die Notwendigkeit, zusätzlichen Software zu erwerben Anwender. Diese Plattform ist geeignet zur Analyse von Kontrast Mikroskopie Phasenbilder niedrig (~ 5 X), Medium (~ 10 X) und hoch (~ 20 X) Vergrößerung. Nach dem Hochladen einer Zip-Datei von Bildern (in *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.GIF, *.tiff Format) wird automatisch die Analyse durchgeführt, um eine Übersichtsdatei zu generieren, die den Prozentsatz der Zelle bedeckten Gebiete und Kratzer Gebiete sowie die Geschwindigkeit der Zelle zeigt Migration, in unterschiedlichen Zeitabständen.
In dieser Arbeit mithilfe ein Frosch-Haut AMP-Derivat, d. h. Esc(1-21) und seine Diastereomer Esc(1-21) - 1 c-13und eine bronchiale Zell-Linie mit dem Ausdruck der funktionalen CF transmembranen Leitwert Regulator (CFTR)14,15, ein Beispiel für Peptid-induzierte Zellwanderung im Vergleich zu unbehandelten (Kontrollproben) wird zur Verfügung gestellt. Beachten Sie, dass die Atemwege Epithel und CFTR eine entscheidende Rolle spielen bei der Aufrechterhaltung der Lungenfunktion und Wunde Reparatur16. Darüber hinaus beinhaltet ein Beweis, dass die vorgenannten Peptide Migration bronchiale Zellen verursacht durch selektive Inhibitoren (z. B. AG1478)17 der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), Aktivierung des EGFR12, 18 berichtet.
Zusammenfassend lässt sich sagen soll das Ziel dieses Verfahrens zeigen, wie die Verwendung von solchen Silikon-Kultur-Einsätze stellt eine schnelle und leicht erreichbare-Assay, Migration von adhärenten Zellen (z. B. bronchialen Epithelzellen) und der molekularen genau zu bestimmen Mechanismen, die solche Ereignisse zu kontrollieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="852">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Minimal essential medium (MEM)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB2071L</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECS0180DH&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Puromycin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypsin/EDTA 1X in PBS</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB3052D</td>
			<td>Warm at room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DPBS with calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ibidi Culture-Insert 2 well</td>
			<td style="width:179px;">Ibidi&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Wimasis Image Analysis</td>
			<td style="width:179px;">Ibidi&#160;</td>
			<td style="width:119px;">30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PRISM software&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration

Das Ziel dieser Arbeit soll eine neuartige Methode, um die Fähigkeit von einigen immunmodulatorischen Molekülen wie antimikrobielle Peptide (AMPs), Förderung der Zellwanderung bewerten zu zeigen. Wichtiger ist die Zellwanderung eine Bandbreitenbegrenzung Veranstaltung bei der Heilung von Wunden, die Integrität und die normale Funktion der Gewebeschichten nach Verletzung wieder herzustellen. Der Vorteil dieser Methode gegenüber der klassischen Test, basiert auf einen manuell gemacht Kratzer in einer Zelle monomolekularen Film, ist, dass die Verwendung von speziellen Silikon Kultur fügt mit zwei Fächern um eine zellfreie Pseudo-Wunde Feld mit einer klar definierten Breite (500 μm zu erstellen ). Durch eine automatisierte Analyseplattform ist es darüber hinaus möglich, quantitative Daten über die Geschwindigkeit der Wunde Schließung und Zelle Migration schnell zu erhalten. Genauer gesagt, wird die Wirkung von zwei Frosch-Haut-AMPs auf die Migration der bronchialen Epithelzellen angezeigt. Darüber hinaus wird Vorbehandlung dieser Zellen mit spezifischen Inhibitoren auf die molekularen Mechanismen, die solche Ereignisse informieren.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die heilende Wirkung von Esc(1-21) und Esc(1-21) - 1 c in Bezug auf die Zellaktivität Migration induzierten auf bronchialen Epithelzellen, die mit dem Ausdruck der funktionellen CFTR Wunde zu bestimmen. In diesem Test wurden Kultur Einsätze in Vertiefungen der 12-Well-Platte gegeben und jedes Fach war ausgesät mit 35.000 Zellen in MEMg ergänzt mit 10 % FBS. Die Zellen erreicht komplette Zusammenfluss innerhalb 24 Std. danach, eine 500 μm Lücke wu...

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A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bewertung der Wirkung der Peptide auf die Migration von bronchialen Epithelzellen. Diese Methode ermöglicht die schnelle und hoch reproduzierbare Einholung der quantitativen Daten über die Geschwindigkeit der Zelle Migration und Wunde Schließung.

Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

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