Name: a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00
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Este trabalho foi financiado por fundos da Universidade Sapienza de Roma e da Fundação de pesquisa de fibrose cística italiano (projeto FFC #11/2014 adoptada pelo FFC delegações de Pavia, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny e Siena). Parte deste trabalho também foi apoiado por FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Nós estamos gratos ao Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Itália) para fornecer as células epiteliais brônquicas.

1. preparação da pilha
<ol><li>Sementes 2.5x106 células em 10 mL de mínimo essencial médio (MEM) suplementada com glutamina 2mm (MEMg), e mais 10% de soro fetal bovino (FBS), antibióticos (0,1 mg/mL de penicilina e estreptomicina) e puromicina (0,5 µ g/mL para a seleção e manutenção da linha de células) em um balão de T75. Incube o frasco a 37 ° C e 5% de CO2 por 2 dias. Antes de iniciar o experimento, verificar a confluência das células sob um microscópio invertido. Nota: As c...

<ol>
	<li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+epithelial+wound+detection.">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li><li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complicated+skin,+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens?.">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?.</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+defective+cystic+fibrosis+airway+epithelial+wound+repair+after+CFTR+rescue.">Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue.</a> Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).</li><li>Gan, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+tyrosine+kinase+inhibitor+AG1478+increases+the+formation+of+inactive+untethered+EGFR+dimers.+Implications+for+combination+therapy+with+monoclonal+antibody+806.">The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li><li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37.">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li><li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li><li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus.">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li></ol>

Migração celular é um processo essencial em muitos eventos fisiológicos e patológicos, incluindo a cicatrização de feridas, desenvolvimento embrionário e metástases. O procedimento básico para estudar célula migração em vitro envolve: (i) a criação de uma monocamada de células, (ii) a produção de uma pseudo ferida na camada confluente das células, (iii) a captura de imagens em intervalos de tempo diferentes até ferida encerramento é alcançado. e (iv) a análise da sequência de imagem de fo...

Isso é amplamente conhecido que a cicatrização de feridas em animais é um processo fundamental para restabelecer a integridade e a função normal das camadas de tecido após lesão1. Apesar de superfícies epithelial expostas ao ambiente externo (por exemplo, a pele, respiratória e trato gastrointestinal) formam uma barreira protetora de insultos físicos e químicos, a formação de feridas pode ocorrer facilmente, especialmente depois cirurgia ou infecções microbianas2. Como exemplo, a colonização do tecido pulmonar pelo patógeno oportunista bacteriano Pseudomonas aeruginosa, especialmente em pessoas com fibrose cística (CF), leva a dano do epitélio de vias aéreas, com consequente insuficiência respiratória3, 4. Cicatrização de feridas é um mecanismo de reparação do complexo hospedeiro para restaurar a arquitetura normal de um tecido lesado5. É caracterizada por inflamação inicial, seguida de um período de regeneração, englobando epitelização, angiogênese e remodela o tecido com a produção de colágeno e células diferenciação6,7,8 . Para garantir a integridade epitelial e para controlar a proliferação microbiana, todos os organismos vivos produzem moléculas de defesa, incluindo peptídeos antimicrobianos (AMPs)9,10. A processo de cicatrização de feridas é muito difícil simular em vitro devido à falta de restos celulares e interações complexas entre diferentes tipos de células. No entanto, a em vitro capacidade de um peptídeo para acelerar o encerramento de uma pseudo ferida, estimulando a migração de células epiteliais é indicativa de sua capacidade de curar um epitélio comprometido. Com efeito, migração celular é um evento limitante na cicatrização de feridas, e estudar os fatores que podem afetar a migração celular ajudará a terapias de alvo para melhor cicatrização.
Aqui, um ensaio experimental altamente reprodutível é fornecido com base em inserções de cultura do silicone especiais para avaliar a migração de células in vitro. É baseado na criação de um 500 μm gap (pseudo ferida) em uma monocamada confluente célula. As células na borda do campo "ferido" artificial começará migrando para a área livre de células, formando novos contatos do celular. A inserção da cultura representa uma nova ferramenta para rápida ferida experiências de cura. São fornecidos dois reservatórios separados por uma parede de 500 μm, e podem ser devidamente colocados em um prato prato 3 cm ou no bem de uma placa de 12. Cada compartimento da inserção de enchimento com uma suspensão de células permite que as células a crescer em cada área designada até confluência, enquanto a remoção da inserção criará uma abertura limpa livre de célula de aproximadamente 500 μm (a mesma largura que o muro de separação). Um meio de cultura celular adequada complementado com um composto de teste pode ser adicionado no prato prato/bem. Depois, o fechamento de espaço pode ser visualizado em intervalos de tempo diferentes sob um microscópio invertido, de preferência um equipado com uma câmera de vídeo para aquisição de imagens. Finalmente, medição de mudanças na área celular coberto pelo programa de análise de imagem automatizado baseado na web irá permitir a quantificação da velocidade da migração de encerramento e célula de ferida. Em geral, esse método é um passo em frente no que diz respeito o ensaio clássico, onde um arranhão é feito manualmente por incisão duas monocamadas de células confluente com uma agulha estéril ou uma pipeta dica11. Com efeito, o último procedimento pode destruir o fundo plástico do prato prato/poço e o revestimento de superfície, criando rugas. Além disso, a área de "ferida" não tem uma largura bem definida ao longo de todo o comprimento do gap, como altamente depende da pressão aplicada por pesquisadores a ponta da agulha. Além disso, as células soltas podem formar aglomerados de células vivas e mortas nas bordas da risque; Além disso, a disseminação de células vivas para a área de "ferida" pode interferir com a velocidade de migração celular, gerando resultados não reproduzíveis12.
Além disso, graças a uma plataforma de análise de risco de imagem, os usuários podem rapidamente receber (em minutos) dados quantitativos sobre o comportamento migratório das células selecionadas sem a necessidade de aquisição de software adicional. Esta plataforma é capaz de analisar imagens de microscopia de contraste de fase de baixa (~ 5. X), médio (~ 10 X) e ampliação de alta (~ 20 X). Após o upload de um arquivo zip de imagens (em *. jpg, *. jpeg, *.jp2, *. png, *. gif, formato *.tiff) a análise é automaticamente realizada para gerar um arquivo de resumo que mostra a porcentagem de áreas cobertas de célula e de áreas de risco, bem como a velocidade da célula migração, em intervalos de tempo distintos.
Neste trabalho, por meio de um AMP-derivado de pele de sapo, ou seja, Esc(1-21) e seu Diastereoisômero Esc(1-21) - 1 c13e uma linhagem de células brônquicas expressando o funcional CF condutância transmembrana regulador (CFTR)14,15, é fornecido um exemplo de migração celular induzida por peptídeo em comparação com amostras não tratadas (controle). Observe que o epitélio das vias respiratórias e CFTR desempenham um papel crucial na manutenção da função pulmonar e ferida reparo16. Além disso, por meio de inibidores seletivos (por exemplo, AG1478)17 do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), provas de que a migração de células brônquicas induzidas pelos peptídeos acima mencionados envolve ativação do EGFR12, 18 é relatado.
Em resumo, o objetivo deste procedimento é mostrar como o uso de tais inserções de cultura do silicone representa um ensaio rápido e facilmente acessível para determinar com precisão a migração de células aderentes (por exemplo, células epiteliais brônquicas) e o molecular mecanismos de controle de tais eventos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="852">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Minimal essential medium (MEM)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB2071L</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB3000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECS0180DH&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB3001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Puromycin</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypsin/EDTA 1X in PBS</td>
			<td style="width:179px;">Euroclone</td>
			<td style="width:119px;">ECB3052D</td>
			<td>Warm at room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DPBS with calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ibidi Culture-Insert 2 well</td>
			<td style="width:179px;">Ibidi&#160;</td>
			<td style="width:119px;">80209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Wimasis Image Analysis</td>
			<td style="width:179px;">Ibidi&#160;</td>
			<td style="width:119px;">30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PRISM software&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration

O objetivo deste trabalho é apresentar um novo método para avaliar a capacidade de algumas moléculas de imunomoduladores, como peptídeos antimicrobianos (AMPs), para estimular a migração celular. Importante, migração celular é um evento limitante durante o processo de cicatrização de feridas para re-estabelecer a integridade e a função normal das camadas de tecido após a lesão. A vantagem deste método sobre o ensaio clássico, que é baseado em um arranhão feito manualmente em uma monocamada de células, é que o uso da cultura de silicone especial insere fornecendo dois compartimentos para criar um campo de pseudo ferido sem célula com uma largura bem definida (500 μm ). Além disso, devido a uma plataforma de análise automatizada de imagem, é possível obter rapidamente dados quantitativos sobre a velocidade da migração de encerramento e célula de ferida. Mais precisamente, será mostrado o efeito de duas ampolas de pele de sapo sobre a migração de células epiteliais brônquicas. Além disso, tratamento prévio destas células com inibidores específicos irá fornecer informações sobre os mecanismos moleculares subjacentes a tais eventos.

Este protocolo foi utilizado para determinar a efeito de Esc(1-21) e Esc(1-21) - 1 c em termos de actividade de migração celular induzida em células epiteliais brônquicas expressando a CFTR funcional de cicatrização de feridas. Neste ensaio, inserções de cultura foram colocadas em poços de uma placa de 12, e cada compartimento foi inoculado com 35.000 células em MEMg suplementado com 10% FBS. As células atingiu completa confluência dentro de 24 h. depois, uma lacuna de 500 μm...

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A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o efeito dos peptídeos na migração das células epiteliais brônquicas. Este método permite a obtenção rápida e altamente reprodutível de dados quantitativos sobre a velocidade de fechamento de migração e ferida de célula.

Um romance em Vitro ferida cura ensaio para avaliar a migração celular

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

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