Name: development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos
Uploaded: 2017-11-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos at JoVE.com

国立衛生研究所によって提供された資金 (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S. に)、バイオ テクノロジーにおける教育研究のカリフォルニア州立大学プログラム (CSUPERB: D.L.S. 脊椎動物の造血ニッチの分子制御)大学院の研究室 (A.C.B.)、カリフォルニア州立大学チコ校でから。

カリフォルニア州立大学、Chico、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 諮問委員会は、以下に述べるすべての方法を承認しました。
1. 漂白剤 48 hpf ゼブラフィッシュ胚
<ol><li>15 cm (w) x 15 cm (l) 7 cm (h) プラスチック容器 × 3 の洗い場を作成: 1000 mL 胚中 (E3;表 1参照) で 5% の漂白剤の 1 mL と 1)、2) 滅菌 E3 と 3) 滅菌 E3。胚が水没する溶液 500 mL を各コンテナーにい?...

<ol>
	<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li><li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition.">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li><li>Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD41++cmyb++precursors+colonize+the+zebrafish+pronephros+by+a+novel+migration+route+to+initiate+adult+hematopoiesis.">CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis.</a> Development. 135, 1853-1862 (2008).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+initiates+through+a+committed+erythromyeloid+progenitor+in+the+zebrafish+embryo.">Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo.</a> Development. 134, 4147-4156 (2007).</li><li>Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+characterization+of+zebrafish+hematopoietic+stem+cells.">The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells.</a> Blood. 118, 289-297 (2011).</li><li>Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Runx1+expression+in+the+dorsal+aorta+tracks+the+emergence+of+blood+progenitors+from+endothelial+cells.">Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells.</a> Blood. 116, 909-914 (2010).</li><li>Lam, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+runx1+promoter-EGFP+transgenics+mark+discrete+sites+of+definitive+blood+progenitors.">Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors.</a> Blood. 113, 1241-1249 (2009).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. 123, 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li><li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li><li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype.">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1, 661-673 (1994).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Gansner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+zebrafish+thrombocyte+lineage+cells+with+a+Cd41+monoclonal+antibody+enriches+hematopoietic+stem+cell+activity.">Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity.</a> Blood. 129, 1394-1397 (2017).</li><li>Smith, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).</li><li>de Jong, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune-matched+hematopoietic+transplantation+in+zebrafish.">Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish.</a> Blood. 117, 4234-4242 (2011).</li><li>Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Caudal+Haematopoietic+Embryonic+Stromal+Tissue+(CHEST)+Cells+Support+Haematopoiesis.">Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis.</a> Sci Rep. 7, 44644 (2017).</li><li>Campbell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryonic+stromal+trunk+(ZEST)+cells+support+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+(HSPC)+proliferation,+survival,+and+differentiation.">Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation.</a> Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).</li><li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+vertebrate+hematopoiesis+using+zebrafish+thrombopoietin.">Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin.</a> Blood. 124, 220-228 (2014).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+granulocyte+colony-stimulating+factors+(Gcsfs):+2+paralogous+cytokines+and+their+roles+in+hematopoietic+development+and+maintenance.">The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance.</a> Blood. 122, 3918-3928 (2013).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118, 1274-1282 (2011).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis.">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li><li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tools+for+the+clonal+analysis+of+zebrafish+hematopoiesis.">Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis.</a> Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+erythropoietin+signaling+in+zebrafish.">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110, 2718-2726 (2007).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+localization+of+side+population+(SP)+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue.">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111, 1131-1137 (2008).</li><li>Henninger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+fate+mapping+quantifies+the+number+of+haematopoietic+stem+cells+that+arise+during+development.">Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development.</a> Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche.">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160, 241-252 (2015).</li></ol>

ゼブラフィッシュ モデル システムかつ決定的に原始的な脊椎動物の造血を勉強するための効率的で効果的かつ安価なモデルとなっています。高速で安価なといくつかの技術的な困難の試金の世代は、小分子をテスト、突然変異体の胚を分析、HSPC 生物学の重要な分子経路の解明に利用できます。体外メッキ HSPCs のアダルト ゼブラフィッシュからは突然変異誘発、サイトカイン、造血?...

増結は、生物の生存に必要な成熟した血液細胞の多数を作るプロセスです。成熟した血液を構成する発達制限携帯各種に造血幹細胞 (造血) の分化を含むキーの発達プロセスです。これらの造血システムが枯渇しないように、初期胚から死に至るまで維持されている必要があります更新する必要があります。ポスト mitotic の血液細胞の大半を十分に補充するために、脊椎動物の造血幹・前駆細胞 (HSPCs) の定数の分化・増殖を必要な毎日がリサイクルされていると。HSCs は制限された幹細胞のサブセットに最初の差別化によって成熟した血液細胞を生成します。一般的なリンパ球前駆細胞 (CLPs)1、最終的に T、B、NK 細胞を作り出す、および一般的な骨髄前駆細胞 (Cmp)2顆粒球、赤血球、巨核球マクロファージを生成します。これらの前駆細胞が特定の細胞系譜を生成するのにコミットしているし、骨髄赤芽球系前駆細胞 (Mep) 顆粒球や血小板、赤血球を生成するなどの詳細の発達制限前駆細胞へと分化好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージの2を生成するマクロファージ前駆細胞 (省)。識別し、これらの前駆細胞を分離することにより重要な分子経路の同定、造血分化に関与して白血病などの多くの造血器疾患発生これらの前駆細胞が正常に失敗するとき区別します。
過去数十年間、ゼブラフィッシュ (動脈分布) モデル システム胎児および成体造血研究重要な研究ツールとなっています。ゼブラフィッシュ遺伝子解析に適しているで、系統発生的に最も低い脊椎動物のモデル種と同様血管と人間に造血システムを持つ。Zebrafish の胚が子宮、ex開発し、48 時間ポスト内受精 (hpf) は HSPCs3,4,5,6,7、8を生成します。ゼブラフィッシュは、また非常に肥沃な女性シングル クラッチで 100 個の卵を産卵大きいサンプルの大きさおよび実験的レプリケーションを可能にします。Zebrafish の胚が光学的に透明な造血系の顕微可視化を可能にします。蛍光遺伝子組換え数行ゼブラフィッシュrunx1など HSCs をマーキング: EGFP 魚9、 cd41: EGFP 魚10、およびkdrl:mCherry;cmyb: GFP3二重肯定的な動物、HSC の出現と拡大生体内で3,4,7,8、ライブ、リアルタイムの可視化を可能にします。 9。ゼブラフィッシュの速い世代時間と開発子宮 exにおける突然変異誘発の研究11,12,13,14,15と薬物使用につながっています。16,17,18,19、20人の血液疾患の治療の約束を保持する化合物をスクリーニングします。全体的にみて、造血系、存在と形質転換線、および迅速な再生時間を容易に開発の保全したゼブラフィッシュ造血の研究のための安価な迅速、柔軟、かつ理想的なモデル。
分離して造血をテストの多数の方法は、哺乳類の造血システムで開発されています。調査官は、流出色素25,26HSCs の能力を悪用すると同様、HSCs21,22,23,24をマークに細胞表面受容体の組み合わせを利用できます。彼らにラベルを付ける蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの物理的な分離ができます。セルが、HSC であることを証明するには、内因性 HSPCs、推定 HSCs 移植と成熟した血液細胞の種類すべての長期的な多系統の再構成を観察することを破壊するホスト動物を照射する必要があります。これらのアッセイは、造血細胞移植免疫のマッチングを容易にする近交系マウス系統と多数細胞表面の抗体があるのでマウスでよくはたらきます。ただし、いくつかのゼブラフィッシュ造血細胞表面の抗体は、生成された27, 同定と HSCs の分離を妨げることをされています。マークし、ゼブラフィッシュ HSCs を分離する最も一般的な方法は、トランスジェニック動物、セル固有のプロモーターは、蛍光タンパク質の発現を運転するという。研究は可視化して、背側大動脈の腹側の壁の HSCs の列挙にはこのテクニック3,4,8,9を利用した顕微鏡。他の研究室は、ゼブラフィッシュ28,29系統のクローンを生成しているし、MHC 一致動物30の成功移植を実行しています。ただし、これらのテクニックは、多くの実験室は膨大なコスト、技術的に困難でありは時間がかかる。これらの問題に対処するため研究所は存在、増殖率と HSPCs31,32,33、分化能力をテストするためのいくつかの in vitroアッセイを生成しています。 34,35,36。これらの試 HSPCs体外31,32,33,34,35,36, の救助の増殖・分化を示す造血障害36と発見とサイトカイン33,34,35のテストのための効率的な方法です。彼らはまた、HSPC 生物学31,32の遺伝子を識別するために利用されています。この研究では、私たちが一歩これらの試さらに、ゼブラフィッシュの胚の HSPCs の定量を可能します。これらの試また変異動物の HSPCs の数を量的に利用することができ、動物が破壊的造血薬で治療します。本質的に、これらの試金は高速、現在のいくつかの技術的な課題、HSPC 数字を量的に表わす、彼らの増殖を調べるし、分化におけるブロックを調査する安価な方法をあります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:741px;" width="741">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">10% Bovine Serum Albumin in Iscove&#39;s MDM</td>
			<td style="width:115px;">StemCell Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">9300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+</td>
			<td style="width:115px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">HyClone PBS (1x)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">&#160;DMEM 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Corning CellGrow</td>
			<td style="width:119px;">10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">&#160;Ham&#39;s F12 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Corning CellGrow</td>
			<td style="width:119px;">10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">FBS 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">HEPES 100 mL (1 M)</td>
			<td style="width:115px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Penicillin/streptomycin (5000 U/mL 
			and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:115px;">Corning Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-009-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:115px;">Corning Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-005-CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">1.5 mL MCF tube</td>
			<td style="width:115px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock</td>
			<td style="width:115px;">BD Safety Glide</td>
			<td style="width:119px;">305905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Methocel MC</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">14 mL Polystyrene round bottom tube</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">10 mm polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Librease TM</td>
			<td style="width:115px;">Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Pronase</td>
			<td style="width:115px;">Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">15 cm Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:341px;">AB</td>
			<td style="width:115px;">Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td>
			<td style="width:119px;">ZL1</td>
			<td>zebrafish strain used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos

造血は造血幹・前駆細胞 (HSPCs) が分化成熟した血液を構成する異なる細胞系譜の多数、重要な細胞プロセスです。これらの HSPCs の分離・同定は難しいので定義された事後彼らは、特定のセルにその分化後だけ定義できます。過去数十年間、ゼブラフィッシュ (動脈分布) 造血を調査するモデル有機体となっています。ゼブラフィッシュ胚の子宮 ex、開発し、48 時間後受精 (hpf) によって HSPC 分化を評価するために決定的な HSPCs アッセイを生成していると移植を利用した増殖機能が開発されているとそれ以降。共焦点顕微鏡を用いた特殊な形質転換線の可視化に加えて造血システムの再構成。ただし、これらの試金はコストが法外な技術的に困難で、多くの実験室では時間がかかるです。HSPCs を評価するための in vitroモデルの開発はより速く、費用対効果になるし、以前に比べて現在の少ない困難に HSPC 生物学に影響を与える突然変異や薬物の画面をすばやく評価する所を可能にするメソッドが記述されています。HSPCs を評価するためにこの小説の in vitroアッセイは、めっき解離全体ゼブラフィッシュ胚とだけ HSPC の分化と増殖を促進する追加の外因性の要因によって実行されます。胚が単一のセルに分離される、単一の前駆細胞から生じるコロニー形成単位 (CFUs) を生成させる HSPC 支持のコロニー刺激因子とメッキします。これらの試金からの分子経路のより注意深い検査ように HSPC 増殖、分化および脊椎動物の造血の基盤とその調節不全を理解する研究者を可能にする規制を担当中に病。

HSPC ゼブラフィッシュ胚の数を評価するために 48 の hpf 胚消化、造血支持の外因性の成長因子とセルロースでメッキされ (図 1A) の 7 日間の培養します。7 日後、コロニー形成単位 (CFUs) が列挙 (図 1B) とイメージ (図 1C)。追加別のサイトカインを制御することによ?...

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Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

造血幹・前駆細胞 (HSPCs) ゼブラフィッシュ胚を量的に簡単な方法を紹介します。成熟した血液へと分化支持の要因とセルロースでめっき解離ゼブラフィッシュから HSPCs います。これにより血液の検出欠陥や薬剤のスクリーニングを簡単に行なうことができます。

ゼブラフィッシュ初期胚細胞 (HSPCs) を造血幹・前駆細胞の量的にIn Vitroアッセイの開発

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の生成

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

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紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

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