Name: development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos
Uploaded: 2017-11-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos at JoVE.com

건강의 국가 학회에 의해 제공 된 자금 (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S.에), 생명 공학에서 연구 및 교육을 위한 캘리포니아 주립 대학 프로그램 (CSUPERB: D.L.S. 척추 조 혈 틈새의 분자 제어) 캘리포니아 주립 대학 치 코 (A.C.B.) 하에서 대학원 사무실에서.

캘리포니아 주립 대학, 치 코, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 자문 위원회는 모든 방법을 아래에 설명 된 승인.
1. 블리치 48 hpf Zebrafish 태아
<ol><li>와 함께 15 cm (w) x 15 c m (l) x 7 cm (h) 플라스틱 용기 3 세척 스테이션 만들기: 1) 1000 mL 배아 매체 (E3, 표 1참조) 표 백제 5%의 1 mL, 2)와 함께 살 균 E3와 함께 3) 살 균 E3. 각 컨테이너에 배아 잠수함 솔루션의 500 mL 있는?...

<ol>
	<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Bertrand, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis.">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li><li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tools+for+the+clonal+analysis+of+zebrafish+hematopoiesis.">Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis.</a> Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+erythropoietin+signaling+in+zebrafish.">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110, 2718-2726 (2007).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+localization+of+side+population+(SP)+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue.">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111, 1131-1137 (2008).</li><li>Henninger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+fate+mapping+quantifies+the+number+of+haematopoietic+stem+cells+that+arise+during+development.">Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development.</a> Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche.">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160, 241-252 (2015).</li></ol>

Zebrafish 모델 시스템은 원시적이 고 확실 한 척추 조 공부, 효과적, 효율적이 고 저렴 한 모델이 되었다. 빠르고, 저렴 한, 그리고 몇 가지 기술적인 어려움을 제시 하는 분석 실험의 세대는 작은 분자를 테스트, 돌연변이 배아를 분석 하 고 분자 경로 HSPC 생물학에 대 한 중요 한 elucidating 활용할 수 있습니다. 생체 외에서 도금 HSPCs의 성인 제 브라에서 mutagenesis, cytokines, 그리고 조 혈 결함을 공...

조는 다양 한 생명체의 생존에 필요한 성숙한 혈액 세포를 만드는 과정입니다. 성숙한 혈액을 구성 하는 발달 제한 된 세포 유형의 다양 한으로 조 혈 줄기 세포 (HSCs)의 분화에 관련 된 주요 발달 과정 이다. 이러한 HSCs 시스템은 결코 소진 하 고 그들은 죽을 때까지 초기 배아 개발에서 유지 해야 갱신 자가 해야 합니다. 척추 동물, 지속적인 차별화 및 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs)의 확산 하는 데 필요한 포스트 mitotic 혈액 세포의 대부분을 보충 적절 하 게 매일 재활용 되 고. HSCs 제한 조상 세포;의 하위 집합에 첫 번째 차별화 하 여 성숙한 혈액 세포 생성 일반적인 림프 창시자 (CLPs)1, 결국 T, B, NK 세포를 생산, 그리고 granulocytes, 적혈구, macrophages, 및 없으며 생성 하는 일반적인 골수성 창시자 (CMPs)2 . 이러한 창시자 특정 세포 계보를 생성 하는 최선을 다하고 있습니다 및 추가 골수성 erythroid 창시자 (Mep) 적혈구와 혈소판, 또는 granulocyte 생성 하는 등 더 발달 제한 조상 세포로 분화 대 식 세포 창시자 (GMPs) basophils, 호 산 구는 고 대 식 세포, 호 중구,2를 생성 하는. 식별 하 고 이러한 창시자 분리 중요 한 분자 경로 식별 조 혈 분화에 관련 된 있으며이 조상 세포를 제대로 하지 못할 때 발생 하는 백혈병 등 많은 조 혈 질환 차별화.
지난 몇 년간 zebrafish (Danio rerio) 모델 시스템 배아 및 성인 조 혈 연구에 대 한 주요 연구 도구 되고있다. Zebrafish 순종 유전자 분석 하 고 비슷한 맥 관 구조와 인 간에 게 조 혈 시스템 phylogenetically 낮은 척추 모델 종. Zebrafish 태아 전 utero, 개발 하 고 48 시간 게시물 내 수정 (hpf) 생성 HSPCs3,,45,6,,78. Zebrafish는 또한 높은 다 산, 여 성과 단일 클러치에 100 달걀에 누워 큰 샘플 크기와 실험적인 복제 허용. Zebrafish 태아는 광학 투명, 조 혈 시스템의 미세한 시각화에 대 한 허용 합니다. HSCs runx1같은 표시 zebrafish의 여러 형광 유전자 변형 라인: EGFP 물고기9, cd41: EGFP 물고기10및 kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 더블 양성 동물, HSC 출현과 확장 vivo에서3,4,7,8,의 라이브, 실시간 시각화를 위한 허용 9. Zebrafish의 빠른 생성 시간 및 개발 utero 전 을 주도하 고 있다 mutagenesis 연구11,12,13,,1415 에 약물의 사용 16,17,18,,1920 인간의 혈액 질환에 대 한 치료 약속을 잡고 화합물에 대 한 검사. 전반적으로, 조 혈 시스템, 존재의 유전자 변형, 선과 빠른 재생 시간을 쉽게 개발의 보존이 했다는 제 브라는 저렴, 신속 하 고, 유연 하 고 이상적인 조 혈 연구에 대 한 모델을.
포유류 조 혈 시스템에서 분리 하 고 테스트 HSCs의 수많은 방법이 개발 되었습니다. 수사 경과 염료25,26에 HSCs의 능력을 악용 뿐만 아니라 마크 HSCs21,22,,2324, 세포 표면 수용 체의 결합을 이용할 수 있다. 후에 그들은 분류는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 그들의 물리적 분리 수 있습니다. 셀은 HSC 임을 증명 해 내 생 HSPCs, 상 상속 HSCs, 이식 장기, 다중 계보 재구성 모든 혈액 세포 유형 성숙 관찰 하 고 파괴 하는 호스트 동물 필요 합니다. 조 혈 모 세포 및 면역 이식에 대 한 일치를 촉진 하는 타고 난된 마우스 긴장에 대하여 수많은 세포 표면 항 체는이 분석 실험 쥐에서 잘 작동 합니다. 그러나, 몇 가지 zebrafish 조 혈 모 세포 표면 항 체 생성 된27, 식별 및 격리 HSCs의 방해 되었습니다. Zebrafish HSCs를 분리 하 고 하는 가장 일반적인 방법은 유전자 변형 동물, 그것에 의하여 셀 특정 발기인 순서 운전 형광 단백질의 표정은. 연구 시각 있고이 기술을3,4,,89를 이용 하 여 현미경으로 등 쪽 대동맥의 복 부 벽에 HSCs를 열거. 다른 실험실 zebrafish28,29 의 클론 변종 생성 하 고 일치 하는 MHC 동물30성공적인 이주를 수행 했습니다. 그러나, 이러한 기술은 비용 많은 실험실에 금지, 기술적으로 어려운 이며 시간이 소요. 이러한 문제를 해결 하기 위해 실험실 여러 생체 외에서 분석 실험을 존재, 확산 속도, 그리고 HSPCs31,,3233의 분화 능력에 대 한 테스트 생성 34,,3536. 이 분석 실험 쇼 확산 및 HSPCs 시험관에31,32,33,,3435,36의 구조의 차별화 조 혈 결함36, 그리고 발견 하 고 cytokines33,,3435테스트는 효율적인 방법. 그들은 또한 유전자 HSPC 생물학31,32에 대 한 책임을 식별 하기 위해 활용 되었습니다. 이 연구에서 우리 걸릴이 분석 한 단계 더 나아가, 발전 zebrafish 태아에 있는 HSPCs의 정량 수 있도록. 이 분석 실험 또한 돌연변이 동물에 HSPCs의 수를 quantitate에 이용 될 수 있다 고 동물 조 혈 파괴 약물 치료. 본질적으로,이 분석 실험은 빠르고, 현재 몇 가지 기술 과제, 되며 quantitate HSPC 숫자, 그들의 확산을 시험 하 고 차별화에 블록을 조사 하는 저렴 한 방법.

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	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">10% Bovine Serum Albumin in Iscove&#39;s MDM</td>
			<td style="width:115px;">StemCell Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">9300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+</td>
			<td style="width:115px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">HyClone PBS (1x)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">&#160;DMEM 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Corning CellGrow</td>
			<td style="width:119px;">10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">&#160;Ham&#39;s F12 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Corning CellGrow</td>
			<td style="width:119px;">10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">FBS 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">HEPES 100 mL (1 M)</td>
			<td style="width:115px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Penicillin/streptomycin (5000 U/mL 
			and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:115px;">Corning Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-009-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:115px;">Corning Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-005-CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">1.5 mL MCF tube</td>
			<td style="width:115px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock</td>
			<td style="width:115px;">BD Safety Glide</td>
			<td style="width:119px;">305905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Methocel MC</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">14 mL Polystyrene round bottom tube</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">10 mm polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Librease TM</td>
			<td style="width:115px;">Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Pronase</td>
			<td style="width:115px;">Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">15 cm Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:341px;">AB</td>
			<td style="width:115px;">Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td>
			<td style="width:119px;">ZL1</td>
			<td>zebrafish strain used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos

조는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 성숙한 혈액을 구성 하는 다른 세포 계보의 무리로 분화 하는 필수적인 세포 프로세스입니다. 격리 및 식별이이 HSPCs의 어렵습니다 때문에 정의 된 전 게시물 사실상; 그들은 특정 세포 계보에 그들의 감 별 법 후만 정의할 수 있습니다. 지난 몇 년간 제 브라 (Danio rerio) 조 연구에 모델 생물 되고있다. Zebrafish 태아 utero 전, 개발 하 고 48 h 후 수정 (hpf)에 의해 확실 한 HSPCs. 분석 HSPC 차별화를 평가 하기 위해 생성 된 이식 활용 확산 기능 개발 된 이후 confocal 현미경 검사 법으로 특수 유전자 변형 라인 시각화 뿐만 아니라 조 혈 시스템의 재구성. 그러나, 이러한 분석 비용 금지, 기술적으로, 어렵고 많은 실험실에 대 한 시간이 소모 되는. HSPCs를 평가 하기 위해 생체 외에서 모델의 개발 비용 효과적이 고, 빨리, 그리고 이전에 비해 적은 어려움 설명 방법, 신속 하 게 HSPC 생물학에 영향을 주는 mutagenesis와 약 스크린을 평가 하기 위해 실험실을 수 있도록. 이 소설 체 외에서 분석 결과 HSPCs를 평가 하는 도금 해리 전체 zebrafish 태아 및 HSPC 차별화 및 확산 촉진 추가 외 인 요인에 의해 수행 됩니다. 배아는 단일 세포로 해리 하 고 단일 조상 세포에서 발생 하는 콜로 니 형성 단위 (CFUs)을 생성 하는 그들을 원인이 HSPC 지원 식민지 자극 요인으로 도금. 이 분석 실험 분자 통로의 더 주의 깊은 검사 HSPC 확산, 차별화, 및 그것의 dysregulation 척추 조의 토대를 이해 하는 연구자 수 있도록 규칙에 대 한 책임을 허용 해야 동안에 질병.

배아 zebrafish에 HSPC 숫자를 평가 하기 위해 48 hpf 배아 소화, exogenous 지원 조 혈 성장 인자, 스에 도금 되었고 7 일 (그림 1A)에 대 한 인 큐베이 팅. 7 일 후, 콜로 니 형성 단위 (CFUs) 열거 (그림 1B)과 이미지 (그림 1C) 했다. 제어 함으로써 추가 다른 cytokines, 한 식민지 생산?...

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Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

여기, 우리는 조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPCs) 배아 zebrafish quantitate 간단한 방법을 제시. 천연된 제 브라에서 HSPCs는 지원 요소, 성숙한 혈액으로 차별화와 스에 도금. 혈액의 검출 결함 및 심사 실시 쉽게 마약을 수 수 있습니다.

조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

연구

발생학

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

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Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

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Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...