Name: development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos
Uploaded: 2017-11-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos at JoVE.com

Financiamento foi fornecido pela National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 para D.L.S.), o programa de Universidade de estado de Califórnia para Educação & pesquisa em biotecnologia (CSUPERB: controle Molecular do nicho Hematopoietic vertebrados para D.L.S.) e da Secretaria de pós-graduação na Universidade do estado da Califórnia Chico (a A.C.B).

Conselho Consultivo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) Universidade Estadual da Califórnia, Chico, aprovou todos os métodos descritos abaixo.
1. bleach 48 hpf Zebrafish embriões
<ol><li>Com 15 cm (w) x 15 cm (l) x recipientes plásticos de 7cm (h) criar 3 estações de lavagem: 1) com 1 mL de água sanitária de 5% em 1000 mL de meio de embrião (E3; ver tabela 1), 2) com E3 estéril e 3) com E3 estéril. Certifique-se de que cada contêiner ...

<ol>
	<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li><li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition.">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li><li>Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD41++cmyb++precursors+colonize+the+zebrafish+pronephros+by+a+novel+migration+route+to+initiate+adult+hematopoiesis.">CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis.</a> Development. 135, 1853-1862 (2008).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+initiates+through+a+committed+erythromyeloid+progenitor+in+the+zebrafish+embryo.">Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo.</a> Development. 134, 4147-4156 (2007).</li><li>Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+characterization+of+zebrafish+hematopoietic+stem+cells.">The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells.</a> Blood. 118, 289-297 (2011).</li><li>Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Runx1+expression+in+the+dorsal+aorta+tracks+the+emergence+of+blood+progenitors+from+endothelial+cells.">Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells.</a> Blood. 116, 909-914 (2010).</li><li>Lam, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+runx1+promoter-EGFP+transgenics+mark+discrete+sites+of+definitive+blood+progenitors.">Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors.</a> Blood. 113, 1241-1249 (2009).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. 123, 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li><li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li><li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype.">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1, 661-673 (1994).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Gansner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+zebrafish+thrombocyte+lineage+cells+with+a+Cd41+monoclonal+antibody+enriches+hematopoietic+stem+cell+activity.">Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity.</a> Blood. 129, 1394-1397 (2017).</li><li>Smith, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).</li><li>de Jong, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune-matched+hematopoietic+transplantation+in+zebrafish.">Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish.</a> Blood. 117, 4234-4242 (2011).</li><li>Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Caudal+Haematopoietic+Embryonic+Stromal+Tissue+(CHEST)+Cells+Support+Haematopoiesis.">Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis.</a> Sci Rep. 7, 44644 (2017).</li><li>Campbell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryonic+stromal+trunk+(ZEST)+cells+support+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+(HSPC)+proliferation,+survival,+and+differentiation.">Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation.</a> Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).</li><li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+vertebrate+hematopoiesis+using+zebrafish+thrombopoietin.">Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin.</a> Blood. 124, 220-228 (2014).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+granulocyte+colony-stimulating+factors+(Gcsfs):+2+paralogous+cytokines+and+their+roles+in+hematopoietic+development+and+maintenance.">The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance.</a> Blood. 122, 3918-3928 (2013).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118, 1274-1282 (2011).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis.">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li><li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tools+for+the+clonal+analysis+of+zebrafish+hematopoiesis.">Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis.</a> Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+erythropoietin+signaling+in+zebrafish.">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110, 2718-2726 (2007).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+localization+of+side+population+(SP)+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue.">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111, 1131-1137 (2008).</li><li>Henninger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+fate+mapping+quantifies+the+number+of+haematopoietic+stem+cells+that+arise+during+development.">Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development.</a> Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche.">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160, 241-252 (2015).</li></ol>

O modelo de sistema de zebrafish tornou-se um modelo eficiente, eficaz e barato para o estudo de hematopoiese vertebrado primitivo e definitivo. Geração de ensaios que são rápidos, baratos e apresentar algumas dificuldades técnicas pode ser utilizada para teste de pequenas moléculas, analisando os embriões mutantes e elucidação moleculares vias importantes para a biologia HSPC. Em vitro chapeamento de HSPCs de zebrafish adulto é um método eficaz para estudar mutagênese e citocinas hematopoiéticos de...

Hematopoiese é o processo de fazer a multidão de células maduras do sangue necessário para a sobrevivência do organismo. É uma chave no desenvolvimento do processo que envolve a diferenciação de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) em uma variedade de tipos de células desenvolvente restrito que compõem o sangue maduro. Estes linfócitos auto devem renovar para que o sistema nunca está esgotado e eles devem persistir de desenvolvimento embrionário precoce até à morte. Nos vertebrados, constante diferenciação e proliferação de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são necessários para repor adequadamente a maioria das células do sangue que são pós mitóticas e sendo reciclados todos os dias. Linfócitos geram células maduras do sangue por primeira diferenciação em subconjuntos de células progenitoras restrito; comum progenitores linfoides (CLPs)1, que eventualmente produzir células T, B e NK e comum progenitores mieloides (CMPs)2 que geram granulócitos, eritrócitos, macrófagos e megacariócitos. Estes progenitores estão empenhados em gerar linhagens de células específicas e diferenciarem ainda mais em mais células progenitoras desenvolvente restrito como progenitores mieloide eritroide (MEPs) que geram eritrócitos e plaquetas ou granulócitos progenitores do macrófago (GMPs) que geram basófilos, eosinófilos, neutrófilos e macrófagos2. Identificando e isolando esses progenitores permitem a identificação de importantes vias moleculares envolvidos na diferenciação hematopoiética e muitas doenças hematopoiéticas, como a leucemia surgem quando essas células progenitoras não corretamente Diferencie-se.
Ao longo das últimas décadas, o modelo de sistema de peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se uma ferramenta chave de pesquisa para estudos hematopoiéticas adultas e embrionárias. Zebrafish são passível de análise genética e são as espécies de vertebrados modelo filogeneticamente menores que têm um sistema vascular semelhante e sistema hematopoiético aos seres humanos. Desenvolvem de embriões de zebrafish ex utero, e dentro de 48 horas pós fertilização (hpf) gerar HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafish são também altamente fecundo, com fêmeas deitado sobre 100 ovos em uma única embreagem, permitindo a replicação experimental e tamanhos de amostra grande. Zebrafish embriões são opticamente transparentes, permitindo a visualização microscópica do sistema hematopoiético. Várias linhas de transgênicas fluorescentes de zebrafish marcando linfócitos como runx1: EGFP peixe9, cd41: EGFP peixe10, e kdrl:mCherry; CMap: animais de duplo-positivo do GFP3 , permitem a visualização em tempo real de HSC surgimento e expansão na vivo3,4,7,8, 9. Geração rápido tempo e desenvolvimento ex utero do zebrafish conduziu a seu uso em mutagênese estudos11,12,13,14,15 e drogas rastreio de16,17,18,19,20 para compostos que mantêm a promessa terapêutica para distúrbios do sangue humano. Em geral, conservação do sistema hematopoiético, a presença e o desenvolvimento fácil de linhas transgénicas e tempo de regeneração rápida fez o zebrafish um modelo barato, rápido, flexível e ideal para estudos hematopoiéticos.
Numerosos métodos de isolamento e testes de linfócitos foram desenvolvidos em mamíferos sistemas hematopoiéticos. Os investigadores podem utilizar uma combinação de receptores de superfície celular para marcar linfócitos21,22,23,24, bem como explorar a capacidade dos linfócitos de efluxo tintura25,26. Depois que eles são rotulados, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação permite que a sua separação física. Provar que é uma célula de um HSC requer irradiando um animal hospedeiro para destruir HSPCs endógenos, transplantando linfócitos putativos e observando a longo prazo, linhagem multi reconstituição de todos amadurecem tipos de células do sangue. Estes ensaios funcionam bem em ratos, como existem numerosos da pilha-superfície anticorpos contra células hematopoiéticas e linhagens puras do mouse que facilitam a correspondência imune para transplante. No entanto, alguns zebrafish anticorpos de superfície de células hematopoiéticas foram gerados27, dificultando a identificação e isolamento de linfócitos. A maneira mais comum para marcar e isolar linfócitos zebrafish é com animais transgénicos, segundo o qual uma sequência do promotor celular específico está dirigindo expressão de uma proteína fluorescente. Estudos têm visualizado e enumerado de linfócitos na parede ventral da aorta dorsal com microscopia utilizando esta técnica3,4,8,9. Outros laboratórios geraram variedades clonais de zebrafish28,29 e realizaram transplantes bem sucedidos em animais MHC-combinadas30. No entanto, essas técnicas são custo proibitivo para muitos laboratórios são tecnicamente difíceis e são demoradas. Para solucionar esses problemas, laboratórios têm gerado vários ensaios em vitro para testar para a presença, as taxas de proliferação e a capacidade de diferenciação de HSPCs31,32,33, 34,35,36. Estes ensaios mostram proliferação e diferenciação dos HSPCs em vitro31,32,33,34,35,36, o resgate de hematopoiéticas defeitos36e um método eficiente para descobrir e testar citocinas33,34,35. Eles também têm sido utilizados para identificar os genes responsáveis pela HSPC biologia31,32. Neste estudo, tomamos estes ensaios um passo adiante, permitindo a quantificação de HSPCs em um embrião em desenvolvimento do zebrafish. Estes ensaios também podem ser utilizados para quantificar o número de HSPCs em animais mutantes e os animais tratados com drogas hematopoiéticas interrupções. Em essência, estes ensaios são rápidos, presentes alguns desafios técnicos e maneiras baratas de dosar números HSPC, examinar sua proliferação e investigar blocos na diferenciação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:741px;" width="741">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">10% Bovine Serum Albumin in Iscove&#39;s MDM</td>
			<td style="width:115px;">StemCell Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">9300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
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		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+</td>
			<td style="width:115px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">HyClone PBS (1x)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">&#160;DMEM 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Corning CellGrow</td>
			<td style="width:119px;">10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">&#160;Ham&#39;s F12 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Corning CellGrow</td>
			<td style="width:119px;">10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">FBS 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">HEPES 100 mL (1 M)</td>
			<td style="width:115px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Penicillin/streptomycin (5000 U/mL 
			and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:115px;">Corning Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-009-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:115px;">Corning Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-005-CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">1.5 mL MCF tube</td>
			<td style="width:115px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock</td>
			<td style="width:115px;">BD Safety Glide</td>
			<td style="width:119px;">305905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Methocel MC</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">14 mL Polystyrene round bottom tube</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">10 mm polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Librease TM</td>
			<td style="width:115px;">Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Pronase</td>
			<td style="width:115px;">Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">15 cm Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:341px;">AB</td>
			<td style="width:115px;">Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td>
			<td style="width:119px;">ZL1</td>
			<td>zebrafish strain used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos

Hematopoiese é um processo essencial de celular no qual células estaminais e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) diferenciarem-se na multiplicidade de linhagens diferentes de células que compõem o sangue maduro. Isolamento e identificação destes HSPCs é difícil, porque eles são definidos ex post facto; Eles só podem ser definidos após sua diferenciação em linhagens de células específicas. Ao longo das últimas décadas, o peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo para estudar a hematopoiese. Embriões de zebrafish desenvolvem ex uteroe pela pós-fertilização de 48 h (hpf) geraram definitivo HSPCs. ensaios para avaliar a diferenciação HSPC e capacidades de proliferação foram desenvolvidas, utilizando o transplante e subsequente reconstituição do sistema hematopoiético além de Visualizar linhas transgénicas especializadas com microscopia confocal. No entanto, estes ensaios são custo proibitivo, tecnicamente difícil e demorado para muitos laboratórios. Desenvolvimento de um modelo in vitro para avaliar HSPCs seria custo-eficaz, mais rápido, e presentes menos dificuldades em relação ao anteriormente descritos métodos, permitindo que os laboratórios avaliar rapidamente telas mutagênese e drogas que afetam a biologia HSPC. Este romance em vitro ensaio para avaliar a HSPCs é realizado pelo chapeamento dissociado do zebrafish toda embriões e adicionando fatores exógenos que promovem a proliferação e diferenciação de HSPC. Os embriões são dissociados em células únicas e chapeados com HSPC-apoio fatores de estimulante de colônia que levá-los a gerar colônia formando unidades (CFUs) que surgem a partir de uma célula progenitora único. Estes ensaios devem permitir análise mais cuidadosa das vias moleculares responsáveis pela HSPC proliferação, diferenciação e regulamento, que permitirá que os pesquisadores a entender os fundamentos da hematopoiese vertebrado e sua desregulação durante a doença.

Para avaliar os números HSPC no zebrafish embrionário, 48 embriões hpf foram digeridos, banhados em metilcelulose com fatores de crescimento hematopoiéticos-apoio exógenos e incubados durante 7 dias (Figura 1A). Após 7 dias, unidades formadora de Colônia (CFUs) foram enumerados (Figura 1B) e imagem (Figura 1C). Controlando as diferentes citoci...

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Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Aqui, apresentamos um método simples para dosar o tronco e progenitoras células hematopoiéticas (HSPCs) no zebrafish embrionária. HSPCs de zebrafish dissociado são banhados em metilcelulose com fatores de apoio, diferenciando-se em sangue maduro. Isto permite a detecção de sangue defeitos e permite para ser facilmente conduzida de despistagem de drogas.

Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

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Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Avaliação de danos oxidativos nas células de superfície ocular/células-tronco do rato primário em resposta ao dano ultravioleta-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...