Name: crispr/cas9-mediated targeted integration in vivo using a homology-mediated end joining-based strategy
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها CAS أولوية البحث البرنامج الاستراتيجي (XDB02050007، XDA01010409)، وفي البحث والتطوير Hightech الوطنية د البرنامج (البرنامج 863؛ 2015AA020307)، مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (المنح تشرف 31522037، 31500825، 31571509، 31522038)، الصين الشباب برنامج المواهب ألف (أن إتش وأي)، وكسر من خلال المشروع من الأكاديمية الصينية للعلوم، مشروع "لجنة مدينة شانغهاي" للعلوم والتكنولوجيا (16JC1420202 إلى إتش وأي)، وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (معظم؛ 2016YFA0100500).

جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية عليها قبل "لجنة أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية" في "معاهد شانغهاي" للعلوم البيولوجية (CAS).
1-تصميم والبلازميدات المانحين
<ol><li>
اختيار سجرنا
	<ol>
<li>استخدام أدوات التصميم كريسبر أون لاين للتنبؤ سجرناس على الهدف المنطقة<sup class="x...

<ol>
	<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Mice+Carrying+Reporter+and+Conditional+Alleles+by+CRISPR/Cas-Mediated+Genome+Engineering.">Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Nakade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomology-mediated+end-joining-dependent+integration+of+donor+DNA+in+cells+and+animals+using+TALENs+and+CRISPR/Cas9.">Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9.</a> Nature Communications. 5, 5560 (2014).</li><li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR/Cas9+system+in+zebrafish.">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Scientific reports. 5, 8841 (2015).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+-+Mediated+Precise+Targeted+Integration+In+Vivo+Using+a+Double+Cut+Donor+with+Short+Homology+Arms.">Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms.</a> EBioMedicine. , (2017).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).</li><li>Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obligate+ligation-gated+recombination+(ObLiGaRe):+custom-designed+nuclease-mediated+targeted+integration+through+nonhomologous+end+joining.">Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining.</a> Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+via+CRISPR/Cas9+mediated+homology-independent+targeted+integration.">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology-mediated+end+joining-based+targeted+integration+using+CRISPR/Cas9.">Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9.</a> Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).</li><li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+epiblast+stem+cells.">Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).</li><li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Fibroblasts+into+Neural+Stem+Cells+by+Defined+Factors.">Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors.</a> Cell Stem Cell. , (2012).</li><li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions.">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li><li>Sparman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+by+somatic+cell+nuclear+transfer+in+primates.">Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates.</a> Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).</li><li>Schatten, G., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology:+Transgenic+primate+offspring.">Developmental biology: Transgenic primate offspring.</a> Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).</li><li>Park, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Knockin+in+Porcine+Somatic+Cells+Using+CRISPR/Cas+Ribonucleoproteins.">Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins.</a> International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).</li><li>Woo, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-free+genome+editing+in+plants+with+preassembled+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins.">DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).</li><li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR/Cas+System.">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice.">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes &amp; development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li><li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo.">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li></ol>

الخطوات الأكثر أهمية في بناء هميج المانحة والبلازميدات: (1) اختيار سجرنا مع الحمض النووي الانقسام وكفاءة عالية ومنخفضة المسافة بين موقع قطع سجرنا وكودون وقف البناء (2) السليم من المانحين هميج. كريسبر/Cas9-بوساطة الانقسام على كل ناقل المانحة التحوير (تحتوي على ~ 800 bp التماثل الأسلحة والمواقع ال?...

تحرير الجينوم الدقيقة، وتستهدف في كثير من الأحيان المطلوبة لإنتاج نماذج حيوانية معدلة وراثيا والعلاجات السريرية. بذلت الكثير من الجهد لوضع استراتيجيات مختلفة لكفاءة الجينوم المستهدفة، مثل نوكلاس إصبع الزنك (زفن)، تحرير النسخ المستجيب المنشط--مثل نوكليسيس (تالينس)، ونظم كريسبر/Cas9. هذه الاستراتيجيات إنشاء فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي المستهدف (جهاز تسوية المنازعات) في الجينوم، والاستفادة من أنظمة إصلاح الحمض النووي الجوهرية، مثل جزئ المتجانسة (الموارد البشرية)1،2، ميكروهومولوجي بوساطة نهاية الالتحاق بالعمل (ميج)3 , 4 , 5، ونهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج)6،،من78 للحث على التكامل المستهدفة المتسلسلات1،9. الاستراتيجية المستندة إلى الموارد البشرية حاليا الأكثر استخداماً الجينوم تحرير نهج، وفعالة جداً في خطوط الخلايا، ولكن لا يسهل على عدم تقسيم الخلايا بسبب حدوثه المقيدة في أواخر المرحلة S/G2. وهكذا، الاستراتيجية المستندة إلى الموارد البشرية لا ينطبق للتحرير في فيفو الجينوم. في الآونة الأخيرة، وضعت استراتيجية تستند إلى نهيج للجينات كفاءة تدق في الماوس الأنسجة8. ومع ذلك، الأسلوب القائم على نج عادة ما يدخل إينديلس في الوصلات، مما يجعل من الصعب على توليد التحرير الجينوم الدقيقة، وخصوصا عندما تحاول بناء الجينات الانصهار في الإطار8. ميج-على أساس التكامل المستهدف قادر على تحرير الجينوم الدقيقة. ومع ذلك، فقط تواضع أنه يزيد من كفاءة التكامل المستهدفة في التقارير السابقة5. ولذلك، تحسين كفاءة دقيقة التكامل المستهدفة في فيفو حاجة ملحة لتطبيقات علاجية واسعة3.
في عمل نشرت مؤخرا، أثبتنا حد التماثل بوساطة الالتحاق بالعمل (هميج)-على أساس الاستراتيجية، التي أظهرت أعلى كفاءة التكامل المستهدفة في استراتيجيات كل المبلغ عنها على حد سواء في المختبر و في فيفو10. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإنشاء نظام هميج، وأيضا بناء ناقلات الجيش الملكي النيبالي (سجرنا) واحد-دليل استهداف الجين للفائدة والجهة المانحة متجهات إيواء المواقع المستهدفة سجرنا و ~ 800 شركة بريتيش بتروليوم التماثل الأسلحة (الشكل 1) . في هذا البروتوكول، كما تصف الخطوات التفصيلية لجيل من الحمض النووي تدق في الفئران وخطوات قصيرة للتكامل المستهدفة في الأنسجة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، دراسة دليل على مفهوم الاستراتيجية المستندة إلى هميج أثبت قدرته على تصحيح الطفرة فاه وإنقاذ فاه-/- الكبد الفشل الفئران، كما كشفت عن إمكانياتها العلاجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1205px;" width="1206">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">pX330</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">42230</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:359px;">pAAV vector</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">37083</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">pX260</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">42229</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:359px;">AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97307</td>
			<td style="width:524px;">AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:359px;">AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97308</td>
			<td style="width:524px;">HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:359px;">AAV_Cdx2 HMEJ donor</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97319</td>
			<td style="width:524px;">HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:359px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:192px;">Life Technology</td>
			<td style="width:131px;">L3000015</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM9930</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Bbs I</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">R0539S</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">NEB Buffer 2</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">B7002S</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">T7 endonuclease I</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">M0302L</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E2621L</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Plasmid EndoFree-Midi Kit</td>
			<td style="width:192px;">Qiagen</td>
			<td style="width:131px;">12143</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1345</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MEGACLEAR KIT 20 RXNS</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1908</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1354</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:192px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:131px;">P-97</td>
			<td style="width:524px;">&#160;Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Borosilicate glass</td>
			<td style="width:192px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:131px;">B100-78-10</td>
			<td style="width:524px;">type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">FemtoJet microinjector</td>
			<td style="width:192px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:192px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">CM1950-Cryostat</td>
			<td style="width:524px;">thickness&#160;of&#160;40&#160;&#956;m&#160;for&#160;brain,&#160;10 &#956;m&#160;for&#160;liver</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Rabbit anti-mCherry</td>
			<td style="width:192px;">GeneTex</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:192px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">DMEM</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">11965092</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:359px;">FBS</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">10099141</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:359px;">NEAA</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">11140050</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:359px;">Pen,Strep,Glutamine</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">10378016</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:192px;">Omega</td>
			<td style="width:131px;">D2500-02</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">FACS</td>
			<td>BD AriaII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSG</td>
			<td>Ningbo Sansheng Medicine</td>
			<td>S141004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCG</td>
			<td>Ningbo Sansheng Medicine</td>
			<td>B141002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAT#C6762</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CAT#MR-106-D</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 Medium with Phenol Red</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CAT#MR-015-D</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9-mediated targeted integration in vivo using a homology-mediated end joining-based strategy

كمنصة تحرير جينوم واعدة، النظام كريسبر/Cas9 بإمكانات كبيرة لكفاءة المعالجة الجينية، خاصة بالنسبة للتكامل المستهدفة من المتسلسلات. ومع ذلك، بسبب انخفاض كفاءة جزئ المتجانسة (الموارد البشرية) والطفرات إينديل مختلف للغاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج)-على أساس الاستراتيجيات في عدم تقسيم الخلايا، في فيفو الجينوم التحرير ما زال يشكل تحديا كبيرا. هنا، يمكننا وصف حد التماثل بوساطة الالتحاق بالعمل (هميج)-على أساس نظام كريسبر/Cas9 للكفاءة في فيفو دقيقة التكامل المستهدفة. في هذا النظام، ناقلات الجينوم المستهدفة والجهات المانحة التي تحتوي على التماثل الأسلحة (~ 800 bp) يحف به دليل واحد الحمض النووي الريبي (سجرنا) المستهدفة هي المشقوق متواليات من كريسبر/Cas9. هذه الاستراتيجية على أساس هميج يحقق التكامل التحوير كفاءة في الماوس زيجوتيس، وكذلك في خلايا الكبد في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يوفر نهج فعالة لتصحيح فوماريلاسيتواسيتاتي هيدرولاز (فاه) الطفرات في خلايا الكبد استراتيجية تستند إلى هميج وتنقذ فاه-النقص الناجم عن فشل الكبد في الفئران. مجتمعة، مع التركيز على استهداف التكامل، وتوفر هذه الاستراتيجية على أساس هميج أداة واعدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك توليد نماذج حيوانية معدلة وراثيا والعلاج بالجينات المستهدفة.

الجينوم المستندة إلى هميج التحرير في أجنة الفأر: لتحديد كفاءة تدق في الأسلوب القائم على هميج في زيجوتيس الماوس، ونحن تسليمها Cas9 مرناً، سجرنا استهداف الجين Cdx2 والجهة المانحة هميج في الماوس زيجوتيس، الذي صمم للصمامات جين مراسل مشري p2A إلى كودون آخر من Cdx2 </em...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy at JoVE.com

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

بانتظام مجمع إينتيرسباسيد في البروتين قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر المرتبطة 9 (كريسبر/Cas9) نظام يوفر أداة واعدة للهندسة الوراثية، وتفتح إمكانية التكامل المستهدفة من المتسلسلات. يصف لنا نهاية التماثل بوساطة من الالتحاق بالعمل (هميج)-على أساس استراتيجية للحمض النووي فعالة تستهدف الاندماج في فيفو واستهدف العلاج الجيني باستخدام كريسبر/Cas9.

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

باستخدام تقنية PCR-نيون الشعرية جل الكهربائي إلى التركيب الوراثي كريسبر / Cas9 بوساطة خروج المغلوب المسوخ في تنسيق عالية الإنتاجية

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

جيل يعتمد على الاختيار ومستقل من كريسبر / كاس 9 بوساطة جين نوكوتس في خلايا الثدييات

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

استهدفت تسلسل الجيل القادم وأنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم المحددات الوراثية للمرض الدستورية

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

تحديد "معدل إخصاب البيض" من حيث دراسة استخدام "تقنية الخلوية الوراثية"

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

في تطبيق نظام التحكم عن بعد "التلاعب بالتعبير الجيني الذاتية" فيفو

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

في فيفو دراسة وظيفية من المتغيرات البشرية النادرة المرتبطة بالأمراض باستخدام دروسوفيلا

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...