Name: crispr/cas9-mediated targeted integration in vivo using a homology-mediated end joining-based strategy
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por CAS estratégica pesquisa programa prioritário (XDB02050007, XDA01010409), o nacional Hightech R & D programa (programa 863; 2015AA020307), Fundação Nacional de ciências naturais da China (NSFC concede 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), programa mil jovens talentos de China (para HY), Break através do projeto da Academia Chinesa de Ciências, Xangai cidade Comissão de ciência e tecnologia de projeto (16JC1420202 para HY), o Ministério da ciência e tecnologia da China (maioria; 2016YFA0100500).

Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética biomédica pesquisas nos institutos Shanghai para ciências biológicas (CAS).
1. projeto de plasmídeos de doador
<ol><li>
Seleção de sgRNA
	<ol>
<li>Use ferramentas de design on-line CRISPR para prever sgRNAs sobre o destino região11,12,13,14,<...

<ol>
	<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Mice+Carrying+Reporter+and+Conditional+Alleles+by+CRISPR/Cas-Mediated+Genome+Engineering.">Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Nakade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomology-mediated+end-joining-dependent+integration+of+donor+DNA+in+cells+and+animals+using+TALENs+and+CRISPR/Cas9.">Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9.</a> Nature Communications. 5, 5560 (2014).</li><li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR/Cas9+system+in+zebrafish.">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Scientific reports. 5, 8841 (2015).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+-+Mediated+Precise+Targeted+Integration+In+Vivo+Using+a+Double+Cut+Donor+with+Short+Homology+Arms.">Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms.</a> EBioMedicine. , (2017).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).</li><li>Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obligate+ligation-gated+recombination+(ObLiGaRe):+custom-designed+nuclease-mediated+targeted+integration+through+nonhomologous+end+joining.">Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining.</a> Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+via+CRISPR/Cas9+mediated+homology-independent+targeted+integration.">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology-mediated+end+joining-based+targeted+integration+using+CRISPR/Cas9.">Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9.</a> Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).</li><li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+epiblast+stem+cells.">Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).</li><li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Fibroblasts+into+Neural+Stem+Cells+by+Defined+Factors.">Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors.</a> Cell Stem Cell. , (2012).</li><li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions.">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li><li>Sparman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+by+somatic+cell+nuclear+transfer+in+primates.">Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates.</a> Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).</li><li>Schatten, G., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology:+Transgenic+primate+offspring.">Developmental biology: Transgenic primate offspring.</a> Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).</li><li>Park, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Knockin+in+Porcine+Somatic+Cells+Using+CRISPR/Cas+Ribonucleoproteins.">Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins.</a> International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).</li><li>Woo, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-free+genome+editing+in+plants+with+preassembled+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins.">DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).</li><li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR/Cas+System.">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice.">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes &amp; development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li><li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo.">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li></ol>

Os passos mais críticos na construção de plasmídeos de doador HMEJ são: (1) seleção da sgRNA com alta eficiência de clivagem de DNA e baixa distância entre local de corte de sgRNA e stop códon e (2) a boa construção de doador HMEJ. Clivagem CRISPR/Cas9-mediada em ambos vetor de doador do transgene (contendo sites de destino sgRNA e braços de homologia ~ 800 bp) e genoma alvo é necessária para a integração de alvo eficiente e precisa in vivo. Os passos mais importantes da geração de batida-em r...

Edição de genoma preciso, alvo é muitas vezes necessária para a produção de modelos de animais geneticamente modificados e terapias clínicas. Muito esforço foi feito para desenvolver várias estratégias para eficiente genoma alvo de edição, tais como nuclease dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras como ativador de transcrição (TALENs) e CRISPR/Cas9 sistemas. Estas estratégias criar quebras de dobro-costa de DNA alvo (DSB) no genoma e tirar proveito dos sistemas de reparo de DNA intrínsecos, como recombinação homóloga (HR)1,2, microhomology-mediada final juntar-se (MMEJ)3 , 4 , 5e não-homólogas final juntando (NHEJ)6,7,8 , para induzir a integração específica de transgenes1,9. A estratégia baseada no HR é atualmente o mais usado do genoma edição de abordagem, que é muito eficiente em linhas celulares, mas não é facilmente acessível de células não-dividindo devido a sua ocorrência restrita na fase tardia do S/G2. Assim, a estratégia baseada no HR não é aplicável para na vivo edição do genoma. Recentemente, a estratégia baseada em NHEJ foi desenvolvida para gene eficiente bata no rato tecidos8. No entanto, o método baseado em NHEJ geralmente introduz puntuais nos cruzamentos, tornando difícil gerar edição genoma preciso, especialmente quando tentando construir em-frame fusão de genes8. Alvo de integração baseada em MMEJ é capaz de genoma preciso de edição. No entanto, apenas moderadamente aumenta a eficiência de integração orientada em anteriores relatórios5. Por conseguinte, melhorando a eficiência da integração alvo precisos na vivo é urgentemente necessária para aplicações terapêuticas amplo3.
Em um trabalho recentemente publicado, demonstrámos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-com base em estratégia, que mostrou a mais alta eficiência de integração orientada em tudo relatado estratégias ambos in vitro e in vivode10. Aqui, descrevemos um protocolo para o estabelecimento do sistema de HMEJ, e também a construção de vetores de RNA (sgRNA) o single-guia como alvo o gene de interesse e o doador vetores abrigar sites de destino sgRNA e ~ 800 bp de braços de homologia (Figura 1) . Este protocolo, também descrevemos as etapas detalhadas para geração de DNA bater-em ratos e breves etapas de integração alvo em tecidos na vivo. Além disso, um estudo de prova de conceito da estratégia baseada em HMEJ demonstrou sua capacidade de corrigir a mutação Fah e resgatar Fah- / - fígado falha ratos, que revelou ainda mais o seu potencial terapêutico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1205px;" width="1206">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">pX330</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">42230</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:359px;">pAAV vector</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">37083</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">pX260</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">42229</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:359px;">AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97307</td>
			<td style="width:524px;">AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:359px;">AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97308</td>
			<td style="width:524px;">HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:359px;">AAV_Cdx2 HMEJ donor</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97319</td>
			<td style="width:524px;">HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:359px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:192px;">Life Technology</td>
			<td style="width:131px;">L3000015</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM9930</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Bbs I</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">R0539S</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">NEB Buffer 2</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">B7002S</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">T7 endonuclease I</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">M0302L</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E2621L</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Plasmid EndoFree-Midi Kit</td>
			<td style="width:192px;">Qiagen</td>
			<td style="width:131px;">12143</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1345</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MEGACLEAR KIT 20 RXNS</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1908</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1354</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:192px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:131px;">P-97</td>
			<td style="width:524px;">&#160;Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Borosilicate glass</td>
			<td style="width:192px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:131px;">B100-78-10</td>
			<td style="width:524px;">type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">FemtoJet microinjector</td>
			<td style="width:192px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:192px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">CM1950-Cryostat</td>
			<td style="width:524px;">thickness&#160;of&#160;40&#160;&#956;m&#160;for&#160;brain,&#160;10 &#956;m&#160;for&#160;liver</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Rabbit anti-mCherry</td>
			<td style="width:192px;">GeneTex</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:192px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">DMEM</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">11965092</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:359px;">FBS</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">10099141</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:359px;">NEAA</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">11140050</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:359px;">Pen,Strep,Glutamine</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">10378016</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:192px;">Omega</td>
			<td style="width:131px;">D2500-02</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">FACS</td>
			<td>BD AriaII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSG</td>
			<td>Ningbo Sansheng Medicine</td>
			<td>S141004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCG</td>
			<td>Ningbo Sansheng Medicine</td>
			<td>B141002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAT#C6762</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CAT#MR-106-D</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 Medium with Phenol Red</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CAT#MR-015-D</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9-mediated targeted integration in vivo using a homology-mediated end joining-based strategy

Como uma promissora plataforma de edição do genoma, o sistema CRISPR/Cas9 tem um grande potencial para manipulação genética eficiente, especialmente para a integração específica de transgenes. No entanto, devido a baixa eficiência de recombinação homóloga (HR) e várias mutações indel de fim não-homóloga ingressar (NHEJ)-com base em estratégias em células não-divisão, na vivo genoma edição permanece um grande desafio. Aqui, descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado sistema CRISPR/Cas9 para integração eficiente na vivo precisos alvo. Neste sistema, o alvo do genoma e o doador vector contendo armas de homologia (~ 800 bp) ladeado por alvo de RNA (sgRNA) único guia sequências são clivadas por CRISPR/Cas9. Esta estratégia baseada em HMEJ alcança a integração do transgene eficiente em zigotos de rato, bem como em hepatócitos na vivo. Além disso, uma estratégia baseada em HMEJ oferece uma abordagem eficiente para correção de fumarylacetoacetate hidrolase (Fah) mutação nos hepatócitos e resgata Fah-deficiência induzida ratos de insuficiência hepática. Tomados em conjunto, focalizando direcionados a integração, esta estratégia baseada em HMEJ fornece uma ferramenta promissora para uma variedade de aplicações, incluindo a geração de modelos de animais geneticamente modificados e terapias do gene alvo.

Edição de genoma HMEJ-baseado em embriões do rato: Para definir a eficiência de bater-do método baseado em HMEJ de zigotos de rato, nós entregamos Cas9 mRNA, sgRNA, tendo como alvo o gene Cdx2 e o doador HMEJ em zigotos de rato, que foi projetado para fundir um gene repórter de p2A-mCherry para o último códon do Cdx2 gene(Figura 2). Os zigotos injetados desenvolveram em blastocistos na cultura. Para...

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CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornece uma ferramenta promissora para a engenharia genética e abre a possibilidade de integração específica de transgenes. Descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado estratégia eficiente DNA alvo integração na vivo e alvo de terapias do gene usando CRISPR/Cas9.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Genética

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Geração independente dependente da seleção e de genes independentes de CRISPR / Cas9 em células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Sequenciamento de nova geração direcionado e fluxo de análises de bioinformática para avaliar determinantes genéticos de doenças constitucionais

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...