Name: crispr/cas9-mediated targeted integration in vivo using a homology-mediated end joining-based strategy
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy at JoVE.com

Эта работа была поддержана CAS стратегической приоритетной исследовательской программы (XDB02050007, XDA01010409), Национальный Hightech R & D программы (863 программы; 2015AA020307), Национальный фонд естественных наук Китая (NSFC предоставляет 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Китай молодежи тысяч талантов программа (HY), перерыв через проект Академии наук Китая, Шанхай городской комитет по науке и технике проекта (16JC1420202 HY), Министерство науки и техники Китая (наиболее; 2016YFA0100500).

Все процедуры, включая животных темы были утверждены Комитетом по этике биомедицинских исследований на Шанхай институтов биологических наук (CAS).
1. дизайн доноров плазмиды
<ol><li>
Выбор sgRNA
	<ol>
<li>Используйте онлайн-ТРИФОСФАТЫ дизайн инструментов для прогнозирова...

<ol>
	<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Mice+Carrying+Reporter+and+Conditional+Alleles+by+CRISPR/Cas-Mediated+Genome+Engineering.">Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Nakade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomology-mediated+end-joining-dependent+integration+of+donor+DNA+in+cells+and+animals+using+TALENs+and+CRISPR/Cas9.">Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9.</a> Nature Communications. 5, 5560 (2014).</li><li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR/Cas9+system+in+zebrafish.">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Scientific reports. 5, 8841 (2015).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+-+Mediated+Precise+Targeted+Integration+In+Vivo+Using+a+Double+Cut+Donor+with+Short+Homology+Arms.">Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms.</a> EBioMedicine. , (2017).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).</li><li>Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obligate+ligation-gated+recombination+(ObLiGaRe):+custom-designed+nuclease-mediated+targeted+integration+through+nonhomologous+end+joining.">Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining.</a> Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+via+CRISPR/Cas9+mediated+homology-independent+targeted+integration.">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology-mediated+end+joining-based+targeted+integration+using+CRISPR/Cas9.">Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9.</a> Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).</li><li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+epiblast+stem+cells.">Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).</li><li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Fibroblasts+into+Neural+Stem+Cells+by+Defined+Factors.">Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors.</a> Cell Stem Cell. , (2012).</li><li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions.">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li><li>Sparman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+by+somatic+cell+nuclear+transfer+in+primates.">Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates.</a> Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).</li><li>Schatten, G., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology:+Transgenic+primate+offspring.">Developmental biology: Transgenic primate offspring.</a> Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).</li><li>Park, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Knockin+in+Porcine+Somatic+Cells+Using+CRISPR/Cas+Ribonucleoproteins.">Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins.</a> International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).</li><li>Woo, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-free+genome+editing+in+plants+with+preassembled+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins.">DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).</li><li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR/Cas+System.">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice.">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes &amp; development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li><li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo.">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li></ol>

Наиболее важные шаги в строительстве HMEJ плазмид доноров являются: (1) выбор sgRNA с высокой эффективностью расщепления ДНК и низкой расстояние между sgRNA резки и стоп-кодон и (2) надлежащего строительства HMEJ доноров. ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной расщепление на обоих трансген доноров вектор (...

Точные, целенаправленных генома редактирования часто требуется для производства генетически модифицированных животных моделей и клинической терапии. Много усилий был достигнут в разработке различных стратегий для эффективного целенаправленного генома, редактирования, такие как цинковый палец нуклеиназы (ZFN), транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 систем. Эти стратегии создания целевых двухнитевые разрывы ДНК (DSB) в геноме и воспользоваться преимуществами встроенных систем ремонта ДНК, таких как гомологичная рекомбинация (HR)1,2, microhomology опосредованной конец присоединения (MMEJ)3 , 4 , 5и не гомологичных конце присоединения (NHEJ)6,,78 побудить целенаправленной интеграции трансгенов1,9. HR-стратегия на основе в настоящее время наиболее часто используемые генома редактирования подход, который является очень эффективным в клеточных линий, но не легко доступной для не деления клеток из-за его ограниченного возникновения в конце S/G2 фазе. Таким образом HR-стратегия на основе не применима для в естественных условиях изменения генома. Недавно была разработана стратегия на основе NHEJ для забивные эффективного гена в ткани мыши8. Тем не менее метод на основе NHEJ обычно вводит indels на перекрестках, что делает его трудно генерировать точные генома редактирования, особенно при попытке построить в кадр фьюжн генов8. На основе MMEJ целенаправленной интеграции способен редактирования точных генома. Однако это лишь незначительно увеличивает эффективность целенаправленной интеграции в предыдущих докладах5. Таким образом повышение эффективности точные целевые интеграции в vivo срочно необходима для широкого терапевтического применения3.
В недавно опубликованной работе, мы продемонстрировали гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-на основе стратегии, которая показала высокую эффективность целенаправленной интеграции всех сообщений о стратегии как in vitro и in vivo10. Здесь, мы описать протокол для создания системы HMEJ, а также строительство векторов сингл руководство РНК (sgRNA), ориентация гена интереса и доноров векторы укрывательстве sgRNA целевые сайты и ~ 800 bp гомологии оружия (рис. 1) . В этом протоколе мы также описывают подробные шаги для генерации ДНК забивные мышей и краткие шаги для целенаправленной интеграции в тканях в естественных условиях. Кроме того исследование доказательства в концепция стратегии на основе HMEJ продемонстрировала свою способность исправить Fah мутации и спасти фа- / - печени провал мышей, которые далее показали его терапевтический потенциал.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1205px;" width="1206">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">pX330</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">42230</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:359px;">pAAV vector</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">37083</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">pX260</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">42229</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:359px;">AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97307</td>
			<td style="width:524px;">AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:359px;">AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97308</td>
			<td style="width:524px;">HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:359px;">AAV_Cdx2 HMEJ donor</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97319</td>
			<td style="width:524px;">HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:359px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:192px;">Life Technology</td>
			<td style="width:131px;">L3000015</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM9930</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Bbs I</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">R0539S</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">NEB Buffer 2</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">B7002S</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">T7 endonuclease I</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">M0302L</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E2621L</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Plasmid EndoFree-Midi Kit</td>
			<td style="width:192px;">Qiagen</td>
			<td style="width:131px;">12143</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1345</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MEGACLEAR KIT 20 RXNS</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1908</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1354</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:192px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:131px;">P-97</td>
			<td style="width:524px;">&#160;Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Borosilicate glass</td>
			<td style="width:192px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:131px;">B100-78-10</td>
			<td style="width:524px;">type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">FemtoJet microinjector</td>
			<td style="width:192px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:192px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">CM1950-Cryostat</td>
			<td style="width:524px;">thickness&#160;of&#160;40&#160;&#956;m&#160;for&#160;brain,&#160;10 &#956;m&#160;for&#160;liver</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Rabbit anti-mCherry</td>
			<td style="width:192px;">GeneTex</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:192px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">DMEM</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">11965092</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:359px;">FBS</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">10099141</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:359px;">NEAA</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">11140050</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:359px;">Pen,Strep,Glutamine</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">10378016</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:192px;">Omega</td>
			<td style="width:131px;">D2500-02</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">FACS</td>
			<td>BD AriaII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSG</td>
			<td>Ningbo Sansheng Medicine</td>
			<td>S141004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCG</td>
			<td>Ningbo Sansheng Medicine</td>
			<td>B141002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAT#C6762</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CAT#MR-106-D</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 Medium with Phenol Red</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CAT#MR-015-D</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9-mediated targeted integration in vivo using a homology-mediated end joining-based strategy

Как перспективный генома редактирования платформы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система имеет большой потенциал для эффективного генетические манипуляции, особенно для целенаправленной интеграции трансгенов. Однако, из-за низкой эффективности гомологичная рекомбинация (HR) и различных indel мутации не гомологичных конца присоединения (NHEJ)-на основе стратегии-деления клеток, в естественных условиях генома редактирования остается большой проблемой. Здесь мы описываем гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-основанный ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы для эффективного в vivo точные целевые интеграции. В этой системе, целенаправленных генома и доноров вектор содержащий гомологии оружия (~ 800 bp) в окружении одной руководство РНК (sgRNA) целевой последовательности расщепляется, ТРИФОСФАТЫ/Cas9. Эта стратегия на основе HMEJ достигает эффективного трансген интеграции мыши зигот, а также в гепатоциты в естественных условиях. Кроме того, стратегия на основе HMEJ предлагает эффективный подход для коррекции fumarylacetoacetate гидролазы (фа) мутации в гепатоцитах и спасает фа-дефицит индуцированные поражения печени мышей. Вместе взятые, сосредоточив внимание на целенаправленных интеграции, эта стратегия на основе HMEJ обеспечивает перспективным инструментом для различных приложений, включая создание генетически модифицированных животных моделей и целевых генной терапии.

HMEJ-основанные геном редактирования в эмбрионов мыши: Чтобы определить стук в эффективности метода, основанного на HMEJ в мыши зигот, мы поставляли Cas9 мРНК, sgRNA ориентации генов Cdx2 и HMEJ доноров в мыши зигот, который был разработан для предохранителя p2A-mCherry Ре?...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy at JoVE.com

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) система обеспечивает перспективным инструментом для генной инженерии и открывает возможность целенаправленной интеграции трансгенов. Мы описываем гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-на основе стратегии для эффективных ДНК интеграции в естественных условиях и целевой терапии гена с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9.

ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

целевое<em&gt; В Ситу</em&gt; мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Отборочное и независимое генерирование CRISPR / Cas9-опосредованных генов-нокаутов в клетках млекопитающих

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Профилирования времени репликации ДНК, используя данио рерио как в естественных условиях модель системы

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Секвенирование нового поколения и биоинформатики трубопровода для оценки генетических детерминант конституционных болезни

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Определения скорости оплодотворение яйца Bemisia tabaci с помощью цитогенетического техника

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

В естественных условиях применение системы дистанционного управления для манипуляции эндогенного экспрессии генов

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием дрозофилы

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...