Name: crispr/cas9-mediated targeted integration in vivo using a homology-mediated end joining-based strategy
Uploaded: 2018-03-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por CAS estratégicas prioritarias programa de investigación (XDB02050007, XDA01010409), el nacional Hightech R & D programa (programa 863; 2015AA020307), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (NSFC concede 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), programa de talentos China juvenil de mil (en HY), rotura a través del proyecto de la Academia China de Ciencias, Shanghai ciudad Comité de ciencia y tecnología proyecto (16JC1420202 a HY), el Ministerio de ciencia y tecnología de China (más; 2016YFA0100500).

Todos los procedimientos incluyendo temas animales han sido aprobados por el Comité de ética de investigación biomédica en los institutos de Shangai para la ciencia biológica (CAS).
1. diseño de donante plásmidos
<ol><li>
Selección de sgRNA
	<ol>
<li>Utilizar herramientas de diseño en línea CRISPR para predecir sgRNAs en la región de destino de12,11,13,<sup cla...

<ol>
	<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Mice+Carrying+Reporter+and+Conditional+Alleles+by+CRISPR/Cas-Mediated+Genome+Engineering.">Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Nakade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomology-mediated+end-joining-dependent+integration+of+donor+DNA+in+cells+and+animals+using+TALENs+and+CRISPR/Cas9.">Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9.</a> Nature Communications. 5, 5560 (2014).</li><li>Hisano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+in-frame+integration+of+exogenous+DNA+mediated+by+CRISPR/Cas9+system+in+zebrafish.">Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish.</a> Scientific reports. 5, 8841 (2015).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+-+Mediated+Precise+Targeted+Integration+In+Vivo+Using+a+Double+Cut+Donor+with+Short+Homology+Arms.">Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms.</a> EBioMedicine. , (2017).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).</li><li>Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obligate+ligation-gated+recombination+(ObLiGaRe):+custom-designed+nuclease-mediated+targeted+integration+through+nonhomologous+end+joining.">Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining.</a> Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+via+CRISPR/Cas9+mediated+homology-independent+targeted+integration.">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology-mediated+end+joining-based+targeted+integration+using+CRISPR/Cas9.">Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9.</a> Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).</li><li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+epiblast+stem+cells.">Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).</li><li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Reprogramming+of+Fibroblasts+into+Neural+Stem+Cells+by+Defined+Factors.">Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors.</a> Cell Stem Cell. , (2012).</li><li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions.">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li><li>Sparman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+by+somatic+cell+nuclear+transfer+in+primates.">Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates.</a> Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).</li><li>Schatten, G., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology:+Transgenic+primate+offspring.">Developmental biology: Transgenic primate offspring.</a> Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR:+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins.">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).</li><li>Park, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Knockin+in+Porcine+Somatic+Cells+Using+CRISPR/Cas+Ribonucleoproteins.">Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins.</a> International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).</li><li>Woo, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-free+genome+editing+in+plants+with+preassembled+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins.">DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).</li><li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR/Cas+System.">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Is+Responsible+for+the+Neonatal+Hepatic-Dysfunction+Phenotype+of+Lethal+Albino+Mice.">Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice.</a> Genes &amp; development. 7 (12), 2298-2307 (1993).</li><li>Paulk, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+gene+repair+corrects+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+in+vivo.">Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo.</a> Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).</li></ol>

Los pasos más críticos en la construcción de plásmidos de donantes HMEJ son: (1) selección de lo sgRNA con alta eficiencia de clivaje de ADN y baja distancia entre sgRNA corte y codón de parada y construcción (2) adecuada de donantes HMEJ. Escote CRISPR/Cas9-mediada en tanto vector de donante transgénico (contiene ~ 800 bp homología brazos y sitios de destino sgRNA) y genoma específica es necesario para la integración específica eficiente y precisa en vivo. Los pasos más críticos de generación de ...

La edición del genoma, precisa, específica es a menudo necesaria para la producción de modelos animales modificados genéticamente y tratamientos clínicos. Se ha realizado mucho esfuerzo para desarrollar diversas estrategias para el genoma objetivo eficiente de edición, como nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras como activador de transcripción (TALENs) y sistemas de CRISPR/Cas9. Estas estrategias crean roturas de doble cadena DNA específicas (OSD) en el genoma y toman ventaja de intrínsecos sistemas de reparación del ADN, como la recombinación homóloga (HR)1,2, microhomology-mediada se terminan uniendo (MMEJ)3 , 4 , 5y no homólogas terminan uniendo (NHEJ)6,7,8 para inducir la integración dirigida de los transgenes1,9. La estrategia de recursos humanos es actualmente el más de uso general genoma edición de enfoque, que es muy eficiente en las líneas celulares, pero no fácilmente accesibles a las células no se dividen por su ocurrencia restringida en la fase tardía de la S/G2. Así, la estrategia de recursos humanos no es aplicable para en vivo la edición del genoma. Recientemente, la estrategia basada en NHEJ se desarrolló para eficaz de genes knock-en tejidos de ratón8. Sin embargo, el método basado en NHEJ usualmente presenta indels en las uniones, lo que es difícil generar la edición del genoma exacto, especialmente cuando se trata de construir en el marco de la fusión de genes8. Integración dirigida basada en MMEJ es capaz de la edición del genoma exacto. Sin embargo, sólo modestamente aumenta la eficiencia de integración específicas en informes anteriores5. Por lo tanto, mejorar la eficiencia de integración específicas precisa en vivo se necesita urgentemente para amplias aplicaciones terapéuticas3.
En un trabajo publicado recientemente, hemos demostrado una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-basado en la estrategia, que mostró la mayor eficiencia de integración específica en todo divulgado estrategias, tanto in vitro e in vivo10. Aquí, describimos un protocolo para el establecimiento del sistema HMEJ, y también la construcción de los vectores de RNA (sgRNA) solo guía al gen de interés y el donante vectores propios sitios de destino sgRNA y ~ 800 bp de brazos de homología (figura 1) . En este protocolo, también se describen los pasos detallados para la generación de ADN knock-en ratones y breves pasos de integración específica en tejidos en vivo. Por otra parte, un estudio de prueba de concepto de la estrategia basada en HMEJ demostrado su capacidad para corregir la mutación de la Fah y rescatar a Fah- / - hígado insuficiencia ratones, que además revelaron su potencial terapéutico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1205px;" width="1206">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">pX330</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">42230</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:359px;">pAAV vector</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">37083</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">pX260</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">42229</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:359px;">AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97307</td>
			<td style="width:524px;">AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:359px;">AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97308</td>
			<td style="width:524px;">HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:359px;">AAV_Cdx2 HMEJ donor</td>
			<td style="width:192px;">Addgene</td>
			<td style="width:131px;">97319</td>
			<td style="width:524px;">HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:359px;">Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:192px;">Life Technology</td>
			<td style="width:131px;">L3000015</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM9930</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Bbs I</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">R0539S</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">NEB Buffer 2</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">B7002S</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">T7 endonuclease I</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">M0302L</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td style="width:192px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E2621L</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Plasmid EndoFree-Midi Kit</td>
			<td style="width:192px;">Qiagen</td>
			<td style="width:131px;">12143</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1345</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MEGACLEAR KIT 20 RXNS</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1908</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS</td>
			<td style="width:192px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">AM1354</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:192px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:131px;">P-97</td>
			<td style="width:524px;">&#160;Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Borosilicate glass</td>
			<td style="width:192px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:131px;">B100-78-10</td>
			<td style="width:524px;">type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">FemtoJet microinjector</td>
			<td style="width:192px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Freezing microtome</td>
			<td style="width:192px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">CM1950-Cryostat</td>
			<td style="width:524px;">thickness&#160;of&#160;40&#160;&#956;m&#160;for&#160;brain,&#160;10 &#956;m&#160;for&#160;liver</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Rabbit anti-mCherry</td>
			<td style="width:192px;">GeneTex</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:192px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">DMEM</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">11965092</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:359px;">FBS</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">10099141</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:359px;">NEAA</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">11140050</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:359px;">Pen,Strep,Glutamine</td>
			<td style="width:192px;">Gibco</td>
			<td style="width:131px;">10378016</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:192px;">Omega</td>
			<td style="width:131px;">D2500-02</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">FACS</td>
			<td>BD AriaII</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PMSG</td>
			<td>Ningbo Sansheng Medicine</td>
			<td>S141004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCG</td>
			<td>Ningbo Sansheng Medicine</td>
			<td>B141002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAT#C6762</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CAT#MR-106-D</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 Medium with Phenol Red</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CAT#MR-015-D</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas9-mediated targeted integration in vivo using a homology-mediated end joining-based strategy

Como una plataforma de edición de genoma prometedora, el sistema CRISPR/Cas9 tiene gran potencial para la manipulación genética eficiente, especialmente para la integración dirigida de los transgenes. Sin embargo, debido a la baja eficiencia de recombinación homóloga (HR) y las varias mutaciones indel de no homóloga se terminan uniendo (NHEJ)-basado en estrategias en las células no se dividen, en vivo genoma edición sigue siendo un gran desafío. Aquí, describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-sistema CRISPR/Cas9 eficiente en vivo precisa integración específica. En este sistema, el genoma de destino y el donante vector que contiene los brazos de homología (~ 800 bp) flanqueado por destino de RNA (sgRNA) solo guía secuencias son troceadas por CRISPR/Cas9. Esta estrategia basada en HMEJ logra integración eficiente del transgen en cigotos de ratón, así como en hepatocitos en vivo. Por otra parte, una estrategia basada en HMEJ ofrece un enfoque eficaz para la corrección del fumarylacetoacetate hidrolasa (Fah) mutación en los hepatocitos y rescata Fah-deficiencia inducida por ratones de insuficiencia hepática. Tomados en conjunto, centrándose en el objetivo integración, esta estrategia basada en la HMEJ proporciona una herramienta prometedora para una variedad de aplicaciones, incluyendo la generación de modelos animales modificados genéticamente y terapias genéticas específicas.

Edición del genoma basado en HMEJ en embriones de ratón: Para definir la eficiencia knock-in del método basado en la HMEJ de cigotos de ratón, entregamos Cas9 mRNA, sgRNA contra el gen Cdx2 y el donante HMEJ en cigotos de ratón, que fue diseñado para fundir un gen reportero de p2A-mCherry al codón de último de la Cdx2 gen (figura 2A). Los cigotos inyectados convirtieron en blastocistos en la cultura....

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CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) sistema proporciona una herramienta prometedora para la ingeniería genética y abre la posibilidad de integración dirigida de los transgenes. Describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-estrategia por turnos para ADN eficiente objetivo integración en vivo y dirigida terapias genéticas usando CRISPR/Cas9.

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Investigación

Genética

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted<em&gt; In situ</em&gt; mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Dirigida tubería de Bioinformática y secuenciación de próxima generación para evaluar determinantes genéticos de la enfermedad constitucional

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determinar la tasa de fertilización de huevos de Bemisia tabaci mediante una técnica citogenética

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...