Name: guided protocol for fecal microbial characterization by 16s rrna-amplicon sequencing
Uploaded: 2018-03-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por el programa I-CORE (convocatoria nº 41/11), el Israel Science Foundation (grant no. 908/15) y la Europea de Crohn y Colitis organización (ECCO).

Aprobación ética para el estudio fue otorgada por el Comité de ética de investigación Local de Sheba y todos los métodos fueron realizados conforme a las normas y directrices pertinentes. El protocolo recibió una excepción del consentimiento del paciente de la Junta de revisión ética local, desde la materia fecal que se utilizaron fueron ya sometidos a la base de la microbiología como parte del workup clínico y sin paciente identificable que no sea de edad, Género y resultados microbianos. Escrito, el consen...

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	<li>Braun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microbial+characterization+of+hospitalized+patients+with+suspected+infectious+diarrhea+shows+significant+dysbiosis.">Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis.</a> Scientific Reports. 7, 1088 (2017).</li><li>De Filippo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+diet+in+shaping+gut+microbiota+revealed+by+a+comparative+study+in+children+from+Europe+and+rural+Africa.">Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).</li><li>Yatsunenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gut+microbiome+viewed+across+age+and+geography.">Human gut microbiome viewed across age and geography.</a> Nature. 486, 222-227 (2012).</li><li>Rodriguez, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444, 1027-1031 (2006).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea.">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).</li><li>Bakken, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+Clostridium+difficile+infection+with+fecal+microbiota+transplantation.">Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).</li><li>Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+composition+of+the+human+fecal+microbiome+after+bacteriotherapy+for+recurrent+Clostridium+difficile-associated+diarrhea.">Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea.</a> Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).</li><li>Nood, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duodenal+infusion+of+donor+feces+for+recurrent+Clostridium+difficile.">Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile.</a> The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).</li><li>Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+of+stool+cultures.">Value of stool cultures.</a> The Lancet. 316, 413-416 (1980).</li><li>Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+diagnostics+for+infectious+diarrhea.">New concepts in diagnostics for infectious diarrhea.</a> Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).</li><li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality-filtering+vastly+improves+diversity+estimates+from+Illumina+amplicon+sequencing.">Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing.</a> Nature Methods. 10, 57-59 (2013).</li><li>Leek, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+widespread+and+critical+impact+of+batch+effects+in+high-throughput+data.">Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data.</a> Nature Reviews Genetics. 11, (2010).</li><li>Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Create+a+global+microbiome+effort.">Create a global microbiome effort.</a> Nature. 526, 631-634 (2015).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample.">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> PNAS. 108, 4516-4522 (2011).</li><li>Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+PCR+approach+to+accelerate+analyses+of+human-associated+microbial+communities.">A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities.</a> PloS One. 7, (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7, 335-336 (2010).</li><li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DADA2:+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data.">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13, 581-583 (2016).</li><li>Lozupone, C., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UniFrac:+A+new+phylogenetic+method+for+comparing+microbial+communities.">UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).</li><li>Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UniFrac:+An+effective+distance+metric+for+microbial+community+comparison.">UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison.</a> The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+16S+rRNA+gene+for+identification+of+a+broad+range+of+clinically+relevant+bacterial+pathogens.">Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens.</a> PloS One. 10, e0117617 (2015).</li><li>Hiergeist, A., Gl&#228;sner, J., Reischl, U., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+intestinal+microbiota:+culture+versus+sequencing.">Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing.</a> ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).</li><li>Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing.">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).</li><li>Salipante, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+16S+rRNA+next-generation+sequencing+of+polymicrobial+clinical+samples+for+diagnosis+of+complex+bacterial+infections.">Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections.</a> PloS One. 8, e65226 (2013).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).</li></ol>

16S rRNA-amplicones y metagenómica escopeta secuenciación han ganado popularidad en microbiología clínica aplicaciones21,22,23. Estas técnicas son ventajosas en su mayor capacidad para capturar taxa cultivables y no cultivables, proporcionando datos sobre la abundancia relativa de inóculo patógeno y su capacidad para identificar más precisamente un polimicrobial infecciosa 24de la huella digital. Los avances en el campo de la inves...

Concentración de esfuerzos se hicieron para entender mejor el microbioma diversidad y abundancia, como otro aspecto de la captura de diferencia y semejanzas entre los individuos en condiciones sanas y patológicas. Edad2,3, geografía4, estilo de vida5,6y5 de la enfermedad fueron demostrados para ser asociado con la composición del microbioma de la tripa, pero muchas condiciones y poblaciones aún no han sido completamente caracterizado. Recientemente se ha divulgado que el microbioma puede ser modificado para aplicaciones terapéuticas7,8,9. Por lo tanto, la penetración adicional en la relación entre diferentes condiciones fisiológicas y la composición microbiana es el primer paso hacia la optimización de posibles modificaciones futuras.
Los métodos tradicionales de cultivo microbiano están limitados por bajos rendimientos10,11y se conceptualizan como un estado binario donde es una bacteria presente en el intestino o no. Secuenciación de alto rendimiento basado en el ADN ha revolucionado la ecología microbiana, lo que permite la captura de todos los miembros de la comunidad microbiana. Sin embargo, la secuencia Lee longitud y calidad siguen siendo barreras significativas a la taxonomía exacta asignación12. Además, basado en experimentos de alto rendimiento pueden sufrir de efectos por lotes, donde las mediciones son afectadas por variables no biológicas o no científica13. En los últimos años, se han establecido varios programas para estudiar el microbioma humano, incluyendo el proyecto americano Gut, el proyecto microbioma humano de Estados Unidos (US) y el proyecto MetaHIT de Reino Unido (Reino Unido). Estas iniciativas han generado grandes cantidades de datos que no son fácilmente comparables debido a la falta de coherencia en sus planteamientos. Una variedad de proyectos internacionales tales como el consorcio internacional de microbioma humano, el proyecto del microbioma humano normas y el National Institute of Standards and Technology (NIST) intentó abordar algunos de estos temas14 y desarrolla estándares para la medición de microbioma que permita el logro de resultados reproductivos confiables. Se describe aquí es un protocolo integrado de15,varios métodos ampliamente utilizados de16 para 16S rRNA alto rendimiento secuencia (16S-seq) a partir de la recogida de muestras fecales a través del análisis de datos. El protocolo describe un enfoque PCR libre de columnas, diseñado originalmente para la extracción directa de la planta DNA16, para permitir el manejo simultáneo de grandes cantidades de heces las muestras en un tiempo relativamente corto con alta calidad amplificaron la DNA para la apuntada secuenciación de la región variable microbiana de V4 en una plataforma común de la secuencia. Este protocolo tiene como objetivo guiar a los científicos interesados en iniciar el uso de productos de rRNA 16S que ordena de manera robusta, reproductiva, fácil de usar, detallada, usando controles importantes. Tener un protocolo de visitas guiadas y detallada paso a paso puede minimizar el efecto de lote y así permitirá resultados de secuenciación más comparables entre laboratorios.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit</td>
			<td>KAPABIOSYSTEMS</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR Master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td>dsDNA quantify reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0710-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-866-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>dsDNA detecting kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity D1000</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Screen Tape 5067-5582</td>
			<td>separation and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen Tape Assay</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Reagents 5067-5583</td>
			<td>for DNA libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhiX Control v3</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>15017666</td>
			<td>control library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E406-10mL-TAM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL collection tubes</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.695.400</td>
			<td>Safe Seal collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic stick swab in PP test tube</td>
			<td>STERILE INTERIOR</td>
			<td>23117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>2720 Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequncing Machine</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Miseq</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR workstation</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>UV-cleaner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortexer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guided protocol for fecal microbial characterization by 16s rrna-amplicon sequencing

El microbioma intestinal humana juega un papel central en la protección de las células de la lesión, en el procesamiento de energía y nutrientes y en promover la inmunidad. Desviaciones de lo que se considera una composición de la microbiota saludable (disbiosis) pueden influenciar las funciones vitales que conduce a condiciones patológicas. Esfuerzos de investigación recientes y en curso se han dirigido hacia la caracterización de las asociaciones entre la composición microbiana y la salud humana y la enfermedad.
Los avances en tecnologías de secuenciación de alto rendimiento permiten la caracterización de la composición microbiana del intestino. Estos métodos incluyen amplicon de rRNA 16S que ordena y secuencia de la escopeta. Secuenciación de amplicones de rRNA 16S se utiliza para Perfil de composición taxonómica, mientras que la secuenciación shotgun proporciona información adicional acerca de las predicciones del gene y anotación funcional. Una ventaja en el uso de un método de secuenciación específica de la región variable del 16S rRNA gene es su costo sustancialmente inferior en comparación con la secuencia de la escopeta. Las diferencias de secuencia en el gene del rRNA 16S se utilizan como una huella microbiana para identificar y cuantificar diferentes taxones dentro de una muestra individual.
Grandes esfuerzos internacionales han alistado estándares para secuenciación de amplicones de rRNA 16S. Sin embargo, varios estudios reportan una fuente común de variación causada por el efecto de lote. Para minimizar este efecto, uniformados protocolos para toma de muestras, procesamiento y la secuencia deben implementarse. Este protocolo propone la integración de protocolos ampliamente usados a partir de muestras fecales para el análisis de datos. Este protocolo incluye un enfoque directo-PCR libre de columnas, que permite el manejo simultáneo y la extracción de ADN de un gran número de muestras fecales, junto con la amplificación por PCR de la región V4. Además, el protocolo describe la tubería análisis y proporciona un script usando la última versión de QIIME (QIIME 2 versión 2017.7.0 y DADA2). Este protocolo paso a paso está destinado a los interesados en iniciar el uso de productos de rRNA 16S que ordena de manera robusta, reproductiva, fácil de usar, detallada orientar a.

Figura 1muestra una ilustración esquemática del protocolo.
Forma prospectiva hemos recogido muestras de heces de pacientes hospitalizados con diarrea infecciosa sospechada. Las muestras fueron sometidas al laboratorio de microbiología clínica en el Sheba Medical Center entre febrero y mayo de 2015, como fue descrito previamente1. Muestras de heces fueron sometidas a culti...

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Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Este manuscrito describe un detallado protocolo estandarizado de secuenciación de amplicones de rRNA 16S de alto rendimiento. El protocolo presenta un protocolo integrado, uniformado, factible y de bajo costo a partir de la recolección de muestras fecales a través de análisis de datos. Este protocolo permite el análisis de un gran número de muestras con estándares rigurosos y varios controles.

Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing para la identificación microbiana y caracterización

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Investigación

Biología

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

La secuenciación de próxima generación de 16S ARN ribosomal genes Amplicones

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

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Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

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Efficient Nucleic Acid Extracción y 16S rRNA genes de secuenciación para bacteriana Comunidad Caracterización

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In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

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Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación

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