Name: capturing the interaction kinetics of an ion channel protein with small molecules by the bio-layer interferometry assay
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Bio-ID Center und SJTU Cross-Disciplinary Research Fund in Medizin und Technik (YG2016QN66), National Natural Science Foundation of China (31271217) und National Basic Research Program of China (2014CB910304) unterstützt.

Hinweis: Die HEK-293T-Zell-Linie kontinuierlich auszudrücken Flagge markiert hEAG1 Kanal-Protein wird erstellt, indem die transfecting ein pCDH Lentivirale Plasmid enthält die DNA-Sequenz des hEAG1 mit einer Flagge am distalen C-Terminus in HEK-293T Zellen, gefolgt von der Puromycin-beständige Auswahl beschrieben wie bisher15.
(1) Affinitätsreinigung der Flagge markiert hEAG1 Kanal-Protein von HEK-293T Zellen
<ol><li>Tauen Sie Zellen, die stabil mit dem Ausdruck h...

<ol>
	<li>Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Interactions+with+Model+Lipid+Membranes:+Applications+in+Drug+Discovery+and+Drug+Delivery.">Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery.</a> Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).</li><li>van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Property-based+design:+Optimization+of+drug+absorption+and+pharmacokinetics.">Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics.</a> J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).</li><li>Papo, N., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+peptide+membrane+interaction+using+surface+plasmon+resonance:+Differentiation+between+pore+formation+versus+membrane+disruption+by+lytic+peptides.">Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides.</a> Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).</li><li>Fechner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+does+matter!+Label-free+detection+of+small+molecule-protein+interaction.">Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).</li><li>Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Bio-Layer+Interferometry+for+the+analysis+of+protein/liposome+interactions.">Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).</li><li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).</li><li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses.">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li><li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-layer+Interferometry+for+Measuring+Kinetics+of+Protein-protein+Interactions+and+Allosteric+Ligand+Effects.">Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects.</a> J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).</li><li>Occhiodoro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+human+ether-a-go-go+potassium+channel+expressed+in+myoblasts+at+the+onset+of+fusion.">Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion.</a> Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).</li><li>Pardo, L. A., Stuhmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eag1:+An+emerging+oncological+target.">Eag1: An emerging oncological target.</a> Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).</li><li>Simons, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+voltage-gated+potassium+channel+gene+KCNH1+cause+Temple-Baraitser+syndrome+and+epilepsy.">Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy.</a> Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).</li><li>Kortum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+KCNH1+and+ATP6V1B2+cause+Zimmermann-Laband+syndrome.">Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome.</a> Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).</li><li>Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eag1+K++Channel:+Endogenous+Regulation+and+Functions+in+Nervous+System.">Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).</li><li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+EAG+channels+are+directly+modulated+by+PIP2+as+revealed+by+electrophysiological+and+optical+interference+investigations.">Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations.</a> Sci. Rep. 6, (2016).</li><li>Do, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+dynamic+binding+capacity+of+resins+for+the+purification+of+proteins.">A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins.</a> PREP. 60 (2), 147-150 (2008).</li><li>Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+specificities+of+inwardly+rectifying+K++channels+for+phosphoinositides.">Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides.</a> J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Suh, B. C., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+is+a+necessary+cofactor+for+ion+channel+function:+How+and+why?.">PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+High-affinity+Antibody-antigen+Binding+Kinetics+Using+Four+Biosensor+Platforms.">Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms.</a> J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).</li></ol>

Membran-Ionenkanäle sind als die primäre therapeutische Ziele von über 13 % der derzeit bekannten Medikamente zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf- und neurologischen Störungen18überprüft worden. Patch-Clamp-Aufnahme, der goldene Standard zur Messung der funktionellen Ionenkanäle mit kleinen Molekülen, hat wurde am meisten benutzt für Ionen-Kanal Liganden screening. Jedoch können nicht solche elektrophysiologische Ansätze zeigen, ob die kleinen M...

Ausrichtung der Zelle Oberfläche zugänglich Ion Kanalproteinen mit kleinen Molekülen, bietet ein enormes Potenzial für die Liganden Screening und biologische Drug Discovery1,2,3. Somit ist ein geeignetes Instrument für die Untersuchung der Interaktion zwischen Ionenkanal und kleine Moleküle und ihre entsprechende Funktion erforderlich. Die Patch-Clamp-Aufnahme wurde zu einer einzigartigen und unersetzlichen Technik in Ionen-Kanal funktionelle Assay nachgewiesen. Feststellung, ob die kleinen Moleküle direkt Ionenkanäle Ziel erfordern jedoch andere Technologien. Traditionell wurde radioaktives Ligand-Bindung-Assay verwendet, die Kinetik der Bindung zwischen niedermolekularer und seine Zielprotein Ionen-Kanal zu beobachten. Allerdings beschränkt sich die Nutzung dieser Technik wegen seiner Anforderung in radioaktiven Markierung und Erkennung. Darüber hinaus verhindert, dass der erforderliche Schritt, den kleinen Liganden in der Studie zu kennzeichnen seine Verwendung in vielen Arten von Ionenkanälen ohne bekannte spezifische Liganden. Einige markierungsfreie Techniken wie NMR-Spektroskopie, x-ray Diffraction, Microscale Thermophorese (MST)4 und Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden verwendet, um die Protein-kleine Molekül-Interaktionen zu messen. Aber diese Art von Tests in der Regel können nicht wegen der Schwierigkeit, in voller Länge Protein, niedrige Auflösung von Dynamik, niedriger Durchsatz und hohe Kosten5zu erhalten ausreichenden Informationen zur Verfügung stellen. Im Gegensatz zu diesen Techniken taucht Bio-Schicht Interferometrie (BLI) als eine neuartige markierungsfreie Methodik zur Überwindung dieser Nachteile zum Nachweis von Protein-kleine Molekül Interaktionen durch eine winzige Mengen des Proteins Probe auf den Oberflächen der Immobilisierung Biosensor und Messung der optischen Veränderung signalisiert6,7. Als eine vielversprechende Biosensor-Plattform BLI Technik wird bereits durchgeführt, um die Interaktion von kleinen Molekülen mit natürlichem Wasser lösliche Proteine wie ein menschlicher monoklonaler Antikörper CR80208 beobachten und die detaillierte Testverfahren ist berichtet worden, einem vorherige Artikel9. Obwohl die Schlüsselrolle der Ionen-Kanal-Protein für neue therapeutische Targets Entdeckung erkannt wurde, wurde die Ionen-Kanal Protein-kleine Molekül Interaktion Assay anhand BLI nicht beschrieben.
Der Mensch Äther À Gogo- Kanäle (hEAG1) werden in verschiedene Arten von Krebszellen und zentrale Nervensystem, wodurch der Kanal A möglichen therapeutischen Angriffspunkt vieler Krebsarten und neuronalen Erkrankungen10,11, ausgedrückt 12,13,14. Die elektrophysiologische Untersuchung in unserem Labor hat die inhibitorische Wirkung von Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP2) am hEAG1-Kanal15bestätigt. Anhand unserer Ergebnisse, PIP2 Tests, direkt als Modell für andere Arten von Ionen-Kanal Protein-kleine Molekül zusammengesetzte Interaktion vor allem für diese Kanäle fehlen spezifische Liganden Interaktion mit den hEAG1 mit BLI Technik sein kann. Entsprechend den Anweisungen des BLI Assays, wir vorbereitet biotinylierte hEAG1 Proteine und immobilisiert ihnen auf der Oberfläche des Streptavidin (SA) Biosensor Tipps gefolgt von Interaktion sie PIP2 Lösungen zu beobachten, deren direkte Bindung zwischen den Protein und die Lipid. Nach die Befestigung des PIP2 an die hEAG1 Protein beschichtete Oberfläche, die Dicke der Schicht auf der Oberfläche erhöht, die direkt korreliert die spektrale Verschiebung und können in Echtzeit-16gemessen werden. Die verbindliche Kinetik kann durch eine positive Wende im Verein Schritt und eine negative Verschiebung der Dissoziation Schritt ermittelt werden. Nach diesem Prinzip wir gereinigt die funktionale hEAG1 Ionen-Kanal-Protein von HEK-239T stabile Expressionssystem mit Affinität Reinigung Methode, die in-vitro- funktionellen Zustand beizubehalten, dann gemessen die Kinetik der Bindung von unterschiedlicher Konzentration2PIP und ergab eine semblable kinetischen Daten wie Elektrophysiologische Messungen15beobachtet. Die enge Korrespondenz zwischen den Ergebnissen aus den BLI und Elektrophysiologische Messungen zeigen zum ersten Mal die Eignung von BLI als geeignete analytisches Werkzeug für Ionen-Kanal Membran-Protein-kleine Molekül Interaktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1697550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>150 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 Substitute</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A610440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A600332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A600560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet-RED96</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>30-5048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition software</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>Version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis software</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>Version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor/Streptavidin</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Machine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>318120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration device</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>UFC503008</td>
			<td>NMWL of 30 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600 Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the interaction kinetics of an ion channel protein with small molecules by the bio-layer interferometry assay

Die Bio-Layer-Interferometrie (BLI)-Assay ist ein wertvolles Instrument zur Messung von Protein-Protein und Protein-kleine Molekül Interaktionen. Hier beschreiben wir zunächst die Anwendung dieser neuartigen markierungsfreie Technik auf der Wechselwirkung des menschlichen EAG1 Kanalproteine (hEAG1) mit dem kleinen Molekül-PIP-2. hEAG1 Kanal ist wegen seiner abweichenden Überexpression in Krebs und ein paar Gain-of-Function-Mutationen in einigen Arten von neurologischen Erkrankungen beteiligt als mögliche therapeutische Ziel anerkannt. Wir hEAG1 Kanal-Proteine von einem Säugetier stabile Expressionssystem gereinigt und die Interaktion mit PIP2 von BLI gemessen. Die erfolgreiche Messung der Kinetik der Bindung zwischen hEAG1 Protein und PIP2 zeigt, dass die BLI-Assay eine potenzielle Hochdurchsatz-Ansatz für neuartige Small-Molecule-Liganden Screening in der Ionen-Kanal Pharmakologie ist.

Wir reinigen das FLAG hEAG1 Kanal Fusionsproteins von HEK-293T Zellen stabil überexprimieren hEAG1. Die Funktion dieses Schmelzverfahren Protein nachgewiesen mithilfe der Patch-Clamp-Methode und die Qualität und Besonderheit des gereinigten Protein von Western-Blot (Abbildung 1) bestätigt werden. Die gereinigten Kanal-Protein ist biotinylierte einen Interaktion Assay mit Lipiden (PIP2) ausführen mithilfe von Echtzeit-BLI-Assay. Die Bindungskonf...

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Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Hier das Protokoll beschreibt die Wechselwirkungen von gereinigten hEAG1 Ionen-Kanal-Protein mit niedermolekularer Lipid Liganden Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP-2). Die Messung zeigt, dass BLI eine mögliche Methode für neue kleine Molekül-Ion Channel Liganden Screening werden könnte.

Erfassung der Interaktion Kinetics eines Ionenkanals Proteins mit kleinen Molekülen durch die Bio-Schicht Interferometrie Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Forschung

Biochemie

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Ionenaustausch-Chromatographie (IEX) gekoppelt an Multiwinkel Lichtstreuung (MALS) für Protein Trennung und Charakterisierung

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Ableitung von Proteinkristallen mit I3C mit Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identifizierung der Bindungsproteine kleiner Liganden mit der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...