Name: capturing the interaction kinetics of an ion channel protein with small molecules by the bio-layer interferometry assay
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00
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यह काम बायो-आईडी सेंटर और SJTU क्रॉस-अनुशासनात्मक अनुसंधान निधि में मेडिसिन एण्ड इंजीनियरिंग (YG2016QN66), चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१२७१२१७), और चीन के नेशनल बेसिक रिसर्च प्रोग्राम (2014CB910304) द्वारा समर्थित था.

नोट: HEK-293T सेल लाइन लगातार व्यक्त झंडा-टैग hEAG1 चैनल प्रोटीन transfecting द्वारा निर्मित है एक pCDH lentiviral प्लाज्मिड के बाहर सी पर एक ध्वज के साथ hEAG1 के डीएनए अनुक्रम युक्त HEK-293T कोशिकाओं के बाद में-टर्मिनस puromycin-प्रतिरोधी चयन ...

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	<li>Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Interactions+with+Model+Lipid+Membranes:+Applications+in+Drug+Discovery+and+Drug+Delivery.">Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery.</a> Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).</li><li>van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Property-based+design:+Optimization+of+drug+absorption+and+pharmacokinetics.">Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics.</a> J. Med. 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A., Stuhmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eag1:+An+emerging+oncological+target.">Eag1: An emerging oncological target.</a> Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).</li><li>Simons, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+voltage-gated+potassium+channel+gene+KCNH1+cause+Temple-Baraitser+syndrome+and+epilepsy.">Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy.</a> Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).</li><li>Kortum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+KCNH1+and+ATP6V1B2+cause+Zimmermann-Laband+syndrome.">Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome.</a> Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).</li><li>Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eag1+K++Channel:+Endogenous+Regulation+and+Functions+in+Nervous+System.">Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).</li><li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+EAG+channels+are+directly+modulated+by+PIP2+as+revealed+by+electrophysiological+and+optical+interference+investigations.">Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations.</a> Sci. Rep. 6, (2016).</li><li>Do, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+dynamic+binding+capacity+of+resins+for+the+purification+of+proteins.">A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins.</a> PREP. 60 (2), 147-150 (2008).</li><li>Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+specificities+of+inwardly+rectifying+K++channels+for+phosphoinositides.">Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides.</a> J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. 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Biophys. 37, 175-195 (2008).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+High-affinity+Antibody-antigen+Binding+Kinetics+Using+Four+Biosensor+Platforms.">Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms.</a> J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).</li></ol>

झिल्ली आयन चैनलों मानव रोगों की एक किस्म के उपचार के लिए वर्तमान में जाना जाता दवाओं के 13% से अधिक की प्राथमिक चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में सत्यापित किया गया है हृदय और तंत्रिका विज्ञान विकारों1...

छोटे अणुओं के साथ सेल सतह सुलभ आयन चैनल प्रोटीन लक्ष्यीकरण ligand स्क्रीनिंग और जैविक दवा डिस्कवरी1,2,3के लिए एक जबरदस्त क्षमता प्रदान करता है । इस प्रकार, एक उपयुक्त उपकरण आयन चैनल और छोटे अणुओं और उनके इसी समारोह के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है । पैच-दबाना रिकॉर्डिंग आयन चैनल कार्यात्मक परख में एक अनूठा और अपूरणीय तकनीक होने का प्रदर्शन किया गया है । हालांकि, निर्धारित करना है कि छोटे अणुओं सीधे लक्ष्य आयन चैनल अंय प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता है । परंपरागत रूप से, रेडियोधर्मी ligand बाध्यकारी परख के लिए छोटे अणु और अपने लक्ष्य आयन चैनल प्रोटीन के बीच बाध्यकारी के कैनेटीक्स का पालन किया गया । हालांकि, इस तकनीक का उपयोग रेडियोधर्मी लेबलिंग और पता लगाने में इसकी आवश्यकता की वजह से सीमित है । इसके अलावा, आवश्यक कदम के अध्ययन में छोटे ligand लेबल के लिए विशिष्ट ligand ज्ञात बिना आयन चैनलों के कई प्रकार में इसका इस्तेमाल रोकता है । कुछ लेबल-फ्री तकनीक जैसे एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, एक्स-रे विवर्तन, अतिसूक्ष्म thermophoresis (MST)4 और सरफेस plasmon अनुनाद (SPR) में प्रोटीन-छोटे अणु इंटरैक्शन को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है । लेकिन परख के इन प्रकार आमतौर पर मुश्किल की वजह से पर्याप्त जानकारी प्रदान नहीं कर सकते है पूर्ण लंबाई प्रोटीन, गतिशीलता के कम संकल्प, कम प्रवाह, और उच्च लागत5। इन तकनीकों के विपरीत, जैव परत Interferometry (BLI) एक उपंयास लेबल मुक्त पद्धति के रूप में उभर रहा है प्रोटीन का पता लगाने के लिए इन खामियों को दूर करने के लिए-छोटे अणु बातचीत के सतहों पर एक छोटी मात्रा में प्रोटीन का नमूना मैटीरियल 6,7-सेंसर और ऑप्टिकल बदलते संकेतों को मापने. एक होनहार के रूप में, BLI तकनीक पहले से ही प्राकृतिक पानी में घुलनशील प्रोटीन के साथ छोटे अणुओं की बातचीत का पालन करने के लिए प्रदर्शन किया है एक मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी CR80208 और विस्तृत परख प्रक्रिया में बताया गया है एक previous article9. हालांकि नए चिकित्सीय लक्ष्य खोज के लिए आयन चैनल प्रोटीन की महत्वपूर्ण भूमिका को मांयता दी गई है, आयन चैनल प्रोटीन-छोटे अणु संपर्क परख BLI पर आधारित नहीं बताया गया है ।
मानव ईथर जाओ-जाओ चैनल (hEAG1) कैंसर की कोशिकाओं और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विभिंन प्रकार में व्यक्त कर रहे है जो चैनल बनाता है कई कैंसर और न्यूरॉन विकारों के एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य10,11, 12,13,14. हमारी प्रयोगशाला में electrophysiological अध्ययन ने hEAG1 चैनल15पर phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (रंज2) के निरोधात्मक प्रभाव की पुष्टि की है । हमारे परिणामों के आधार पर, BLI तकनीक का उपयोग करके hEAG1 के साथ सीधे बातचीत रंज2 परीक्षण आयन चैनल प्रोटीन के अन्य प्रकारों के लिए एक मॉडल के रूप में किया जा सकता है विशेष रूप से उन चैनलों के लिए विशेष लाइगैंडों कमी छोटे अणु यौगिक बातचीत. BLI परख के निर्देशों के अनुसार, हम biotinylated hEAG1 प्रोटीन तैयार किया और उंहें streptavidin (एसए) की सतह पर मैटीरियल के बाद उंहें रंज2 समाधान के लिए उनके प्रत्यक्ष बंधन के बीच का पालन करने के लिए बातचीत के बाद युक्तियां प्रोटीन और लिपिड । hEAG1 प्रोटीन लेपित सतह को रंज2 के लगाव के बाद, सतह पर परत की मोटाई बढ़ जाती है, जो सीधे वर्णक्रमीय बदलाव को संबद्ध और वास्तविक समय16में मापा जा सकता है । बाध्यकारी कैनेटीक्स को संबद्धता चरण में सकारात्मक बदलाव और पृथक्करण चरण में ऋणात्मक बदलाव के कारण निर्धारित किया जा सकता है । इस सिद्धांत के अनुसार, हम HEK से कार्यात्मक hEAG1 आयन चैनल प्रोटीन शुद्ध-239T स्थिर अभिव्यक्ति प्रणाली अपनत्व शुद्धि विधि का उपयोग करके बनाए रखने के लिए इन विट्रो कार्यात्मक राज्य में, तो के बंधन की कैनेटीक्स मापा अलग एकाग्रता2रंज, और electrophysiological माप15में मनाया के रूप में एक semblable काइनेटिक डेटा झुकेंगे । BLI और electrophysiological माप से परिणामों के बीच करीब पत्राचार पहली बार आयन चैनल झिल्ली प्रोटीन के लिए एक उपयुक्त विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में BLI की उपयुक्तता के लिए प्रदर्शन छोटे अणु संपर्क ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1697550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>150 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 Substitute</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A610440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A600332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A600560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet-RED96</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>30-5048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition software</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>Version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis software</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>Version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor/Streptavidin</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Machine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>318120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration device</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>UFC503008</td>
			<td>NMWL of 30 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600 Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the interaction kinetics of an ion channel protein with small molecules by the bio-layer interferometry assay

बायो-लेयर interferometry (BLI) की परख प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-छोटे अणु इंटरैक्शन को मापने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है । यहां, हम पहले इस उपंयास लेबल के आवेदन का वर्णन मुक्त तकनीक छोटे अणु रंज2के साथ मानव EAG1 (hEAG1) चैनल प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए । hEAG1 चैनल के कैंसर में अपनी ंयायपालिका अधिक व्यक्त की वजह से संभावित चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है और कुछ लाभ के समारोह मस्तिष्क संबंधी रोगों के कुछ प्रकार में शामिल उत्परिवर्तनों । हम एक स्तनधारी स्थिर अभिव्यक्ति प्रणाली से hEAG1 चैनल प्रोटीन शुद्ध और BLI द्वारा रंज2 के साथ बातचीत मापा । hEAG1 प्रोटीन और रंज2 के बीच बंधन के कैनेटीक्स के सफल माप दर्शाता है कि BLI परख एक संभावित उच्च प्रवाह दृष्टिकोण आयन चैनल औषध विज्ञान में उपंयास छोटे अणु ligand स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया है ।

हम HEK से झंडा संलयन hEAG1 चैनल प्रोटीन शुद्ध-293T कोशिकाओं छुरा से व्यक्त hEAG1 । इस फ्यूजन प्रोटीन के समारोह पैच-क्लैंप विधि का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया है और गुणवत्ता और शुद्ध प्रोटीन की विशिष्?...

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Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

यहां प्रोटोकॉल छोटे अणु लिपिड ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (रंज2) के साथ शुद्ध hEAG1 आयन चैनल प्रोटीन की बातचीत का वर्णन । माप दर्शाता है कि BLI उपंयास छोटे अणु आयन चैनल ligand स्क्रीनिंग के लिए एक संभावित तरीका हो सकता है ।

जैव परत Interferometry परख द्वारा छोटे अणुओं के साथ एक आयन चैनल प्रोटीन के संपर्क कैनेटीक्स पर कब्जा

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1 और TRIP8b बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु inhibitors की पहचान के लिए विधि

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

सह-immunoprecipitation द्वारा परमाणु और cytoplasmic भागों में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के दृश्य और<em&gt; बगल में</em&gt; निकटता Ligation परख

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकल प्रोटीन अणुओं के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

खुला पैच के साथ unstirr सीमा परत में आयन एकाग्रता की माप-क्लैंप पिपेट: द्रव प्रवाह द्वारा आयन चैनलों के नियंत्रण में निहितार्थ

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

आयन एक्सचेंज क्रोटोग्राफी (आईईईईएक्स) में प्रोटीन पृथक्करण और विशेषीकरण के लिए मल्टी-एंगल लाइट कैटरिंग (मलों) को युग्मित

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

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स्क्रीनिंग छोटे अणु अवरोधकों के लिए NADH-युग्मित ATPase परख के एक अर्द्ध उच्च Throughput अनुकूलन

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कैप-डिपेंडेंट ट्रांसल काइनेटिक्स के विश्लेषण के लिए इन विट्रो सिंगल-अणु इमेजिंग परख

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

रैंडम माइक्रोसीेड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग का उपयोग करके I3C के साथ प्रोटीन क्रिस्टल का व्युत्पन्न

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छोटे अणुओं का माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

लिगांड परख (DRaCALA) के अंतर रेडियल केशिलरी एक्शन के साथ छोटे लिगांड के बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करना

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...