Name: capturing the interaction kinetics of an ion channel protein with small molecules by the bio-layer interferometry assay
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da SJTU fondo di ricerca interdisciplinare in medicina e ingegneria (YG2016QN66), Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31271217) e base nazionale ricerca programma della Cina (2014CB910304) e Bio-ID Center.

Nota: La linea cellulare HEK 293T continuamente esprimendo la bandierina-etichettate hEAG1 proteina canale viene creata dalla trasfezione un plasmide lentivirali pCDH contenente la sequenza di DNA di hEAG1 con una bandiera al C-terminale distale in cellule HEK 293T seguita dal selezione con puromicina-resistente come precedentemente descritto15.
1. affinità purificazione della proteina di hEAG1 canale Bandierina-etichettate da cellule HEK 293T
<ol><li>Scongelare le c...

<ol>
	<li>Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Interactions+with+Model+Lipid+Membranes:+Applications+in+Drug+Discovery+and+Drug+Delivery.">Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery.</a> Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).</li><li>van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Property-based+design:+Optimization+of+drug+absorption+and+pharmacokinetics.">Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics.</a> J. Med. 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Genet. 47 (6), 661-667 (2015).</li><li>Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eag1+K++Channel:+Endogenous+Regulation+and+Functions+in+Nervous+System.">Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).</li><li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+EAG+channels+are+directly+modulated+by+PIP2+as+revealed+by+electrophysiological+and+optical+interference+investigations.">Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations.</a> Sci. Rep. 6, (2016).</li><li>Do, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+dynamic+binding+capacity+of+resins+for+the+purification+of+proteins.">A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins.</a> PREP. 60 (2), 147-150 (2008).</li><li>Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+specificities+of+inwardly+rectifying+K++channels+for+phosphoinositides.">Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides.</a> J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Suh, B. C., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+is+a+necessary+cofactor+for+ion+channel+function:+How+and+why?.">PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+High-affinity+Antibody-antigen+Binding+Kinetics+Using+Four+Biosensor+Platforms.">Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms.</a> J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).</li></ol>

Canali ionici di membrana sono stati verificati come gli obiettivi terapeutici primari di oltre il 13% delle droghe attualmente conosciute per il trattamento di una varietà di malattie umane, tra cui malattie cardiovascolari, neurologiche e18. Patch-clamp di registrazione, il golden standard per la misurazione il funzionale dei canali ionici con piccole molecole, è stato ampiamente usato per ligandi di canale ionico di screening. Tuttavia, tali approcci elettrofisiologici non possono dimostrare ...

Le proteine di canale cella agli ioni superficie-accessibile con piccole molecole di targeting offre un enorme potenziale per lo screening di ligando e biologici droga scoperta1,2,3. Quindi, è necessario uno strumento adeguato per lo studio dell'interazione tra canale ionico e piccole molecole e loro funzione corrispondente. La registrazione di patch-clamp ha dimostrata di essere una tecnica unica e insostituibile nell'analisi funzionale di canale ionico. Tuttavia, determinare se le piccole molecole bersaglio direttamente i canali ionici richiedono altre tecnologie. Tradizionalmente, il test di associazione di ligand radioattivo fu utilizzato per osservare la cinetica del legame tra piccola molecola e la sua proteina di canale ionico di destinazione. Tuttavia, l'utilizzo di questa tecnica è limitata a causa del relativo requisito in etichettatura radioattivo e rilevamento. Inoltre, il passaggio dei prerequisiti per etichettare il ligando piccolo nello studio impedisce al utilizzando in molti tipi di canali ionici senza ligando specifico noto. Alcune tecniche privo di etichetta come spettroscopia NMR, diffrazione di raggi x, Microscala submicronica (MST)4 e risonanza plasmonica di superficie (SPR) sono stati utilizzati per misurare le interazioni della proteina-piccola molecola. Ma questi tipi di analisi di solito non possono fornire informazioni sufficienti a causa della difficoltà di ottenere le proteine full-length, bassa risoluzione di dinamiche, bassa velocità effettiva e costo elevato5. In contrasto con queste tecniche, bio-strato interferometria (BLI) sta emergendo come una nuova metodologia privo di etichetta per ovviare a questi inconvenienti per la rilevazione di interazioni proteina-piccola molecola di immobilizzare una piccole quantità di campione della proteina sulle superfici del biosensori e misura il cambiamento ottico segnali6,7. Come una promettente piattaforma biosensore, tecnica di BLI è già effettuato per osservare l'interazione di piccole molecole con acqua naturale proteine solubili come un anticorpo monoclonale umano CR80208 e la procedura dettagliata è stata segnalata in un precedente articolo9. Anche se è stato riconosciuto il ruolo chiave della proteina canale dello ione per l'individuazione di nuovi bersagli terapeutici, il dosaggio di interazione ione canale proteina-piccola molecola basato su BLI non è stata descritta.
L'essere umano canali etere à go-go (hEAG1) sono espressi in vari tipi di cellule tumorali e sistema nervoso centrale che rende il canale un potenziale bersaglio terapeutico di molti tipi di cancro e disordini di un neurone10,11, 12,13,14. Lo studio elettrofisiologico nel nostro laboratorio ha confermato l'effetto inibitorio di fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato (PIP2) su hEAG1 canale15. Basato sui nostri risultati, test PIP2 direttamente l'interazione con il hEAG1 usando BLI tecnica può essere come un modello per altri tipi di ioni canale proteina-piccola molecola interazione composto specialmente per quei canali che mancano ligandi specifici. Secondo le istruzioni di dosaggio BLI, abbiamo preparato biotinilati hEAG1 proteine e loro immobilizzato sulla superficie della streptavidina (SA) consigli di biosensore di interazione li seguirono alla soluzioni di2 PIP per osservare il loro legame diretto tra il proteina e del lipido. Dopo l'allegato di PIP2 la superficie rivestita della proteina hEAG1, lo spessore dello strato sulla superficie aumenta, che direttamente correla lo spostamento spettrale e può essere misurato in tempo reale16. La cinetica di legame può essere determinata a causa di un cambiamento positivo nel passaggio di associazione e uno spostamento negativo nel passaggio di dissociazione. Secondo questo principio, abbiamo purificato la proteina di canale di ioni hEAG1 funzionale da HEK-239T espressione stabile sistema utilizzando il metodo di purificazione di affinità per mantenere lo stato funzionale in vitro , poi misurata la cinetica di legame di differenti concentrazioni PIP2e ha reso un come dati cinetici, come osservato in misurazioni elettrofisiologiche15. La stretta corrispondenza tra i risultati dalla BLI e misurazioni elettrofisiologiche dimostrano per la prima volta l'idoneità di BLI come strumento analitico appropriato per l'interazione proteina-piccola molecola di ioni canale membrana.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1697550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>150 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 Substitute</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A610440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A600332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A600560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet-RED96</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>30-5048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition software</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>Version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis software</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>Version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor/Streptavidin</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Machine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>318120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration device</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>UFC503008</td>
			<td>NMWL of 30 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600 Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the interaction kinetics of an ion channel protein with small molecules by the bio-layer interferometry assay

Il dosaggio di interferometria (BLI) bio-strato è un prezioso strumento per la misurazione della proteina-proteina e proteina-piccola molecola interazioni. Qui, descriviamo in primo luogo l'applicazione di questa tecnica novella privo di etichetta per studiare l'interazione del umano EAG1 proteine canale (hEAG1) con la piccola molecola PIP2. canale di hEAG1 è stato riconosciuto come potenziale bersaglio terapeutico a causa della sua sovraespressione aberrante nei cancri e poche mutazioni con guadagno di funzione coinvolti in alcuni tipi di malattie neurologiche. Abbiamo purificato proteine canale hEAG1 da un sistema di espressione stabile dei mammiferi ed abbiamo misurato l'interazione con PIP2 da BLI. La misurazione eseguita con successo della cinetica di legame tra proteina hEAG1 e PIP2 dimostra che il dosaggio BLI è un potenziale approccio di alto-rendimento utilizzato per lo screening di romanzo della piccolo-molecola ligando in farmacologia canale ionico.

Abbiamo purificato la proteina di canale bandiera fusione hEAG1 da HEK 293T cellule stabilmente iperespresso hEAG1. La funzione di questa proteina di fusione è stata dimostrata utilizzando il metodo di patch-clamp e la qualità e la specificità della proteina purificata sono confermati mediante Western blot (Figura 1). La proteina purificata canale è biotinilato per eseguire un test di interazione con i lipidi (PIP2) usando l'analisi in tempo re...

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Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Il protocollo qui descrive le interazioni della proteina canale dello ione di hEAG1 purificato con la piccola molecola lipidica ligando fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato (PIP2). La misurazione dimostra che BLI potrebbe essere un metodo potenziale per lo screening di romanzo della piccolo-molecola ioni canale ligando.

Catturare la cinetica di interazione di una proteina di canale ionico con piccole molecole mediante il saggio di interferometria di Bio-strato

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