Name: capturing the interaction kinetics of an ion channel protein with small molecules by the bio-layer interferometry assay
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00
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이 작품은 바이오 ID 센터 및 의학 및 공학 (YG2016QN66), 국립 자연 과학 재단의 중국 (31271217), 및 국가 기본 연구 프로그램의 중국 (2014CB910304)에서 SJTU 크로스-징계 연구 기금에 의해 지원 되었다.

참고: 지속적으로 플래그 태그 hEAG1 채널 단백질 표현 HEK 293T 세포 라인 transfecting pCDH lentiviral 플라스 미드 HEK 293T 세포 다음으로 원심 C-말단에 플래그 hEAG1의 DNA 순서를 포함 하 여 구성 되어 있는 puromycin 저항 선택 이전15를 설명합니다.
1. 친 화력 정화 HEK 293T 세포에서 hEAG1 채널 단백질 플래그 태그의
<ol><li>셀을 안정적으로 표현 hEAG1 채널 액체 질소에서 따?...

<ol>
	<li>Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Interactions+with+Model+Lipid+Membranes:+Applications+in+Drug+Discovery+and+Drug+Delivery.">Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery.</a> Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).</li><li>van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Property-based+design:+Optimization+of+drug+absorption+and+pharmacokinetics.">Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics.</a> J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).</li><li>Papo, N., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+peptide+membrane+interaction+using+surface+plasmon+resonance:+Differentiation+between+pore+formation+versus+membrane+disruption+by+lytic+peptides.">Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides.</a> Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. 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A., Stuhmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eag1:+An+emerging+oncological+target.">Eag1: An emerging oncological target.</a> Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).</li><li>Simons, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+voltage-gated+potassium+channel+gene+KCNH1+cause+Temple-Baraitser+syndrome+and+epilepsy.">Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy.</a> Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).</li><li>Kortum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+KCNH1+and+ATP6V1B2+cause+Zimmermann-Laband+syndrome.">Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome.</a> Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).</li><li>Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eag1+K++Channel:+Endogenous+Regulation+and+Functions+in+Nervous+System.">Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).</li><li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+EAG+channels+are+directly+modulated+by+PIP2+as+revealed+by+electrophysiological+and+optical+interference+investigations.">Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations.</a> Sci. Rep. 6, (2016).</li><li>Do, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+dynamic+binding+capacity+of+resins+for+the+purification+of+proteins.">A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins.</a> PREP. 60 (2), 147-150 (2008).</li><li>Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+specificities+of+inwardly+rectifying+K++channels+for+phosphoinositides.">Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides.</a> J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. 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막 이온 채널의 다양 한 심장 혈관 및 신경 질환18를 포함 하 여 인간의 질병 치료에 대 한 현재 알려진된 약물의 13%의 주 치료 대상으로 확인 되었습니다. 패치 클램프 기록, 작은 분자와 이온 채널의 기능을 측정 하기 위한 황금 표준 널리 사용 되었습니다 이온 채널 ligands 심사에 대 한. 그러나, 이러한 electrophysiological 접근 수 없습니다 입증 여부 작은 분자 바인딩합니다 직접 채...

타겟팅 작은 분자와 세포 표면 수 이온 채널 단백질 ligand 심사 및 생물 학적 약물 발견1,2,3에 대 한 엄청난 잠재력을 제공 합니다. 따라서, 적절 한 도구 이온 채널 및 작은 분자와 그들의 해당 기능 간의 상호 작용을 공부 하 고 필요 합니다. 패치 클램프 기록 이온 채널의 기능 분석 결과에 독특하고 대신할 기술 될 입증 되었습니다. 그러나, 다른 기술을 요구 작은 분자 이온 채널을 직접 대상 여부 결정. 전통적으로, 방사성 ligand 바인딩 분석 결과 바인딩 사이의 작은 분자 및 그 대상 이온 채널 단백질의 활동을 관찰 하기 위해 사용 되었다. 그러나,이 기술의 사용 제한 됩니다 자사의 요구 사항으로 인해 방사성 라벨 및 탐지에. 또한, 연구에 작은 ligand를 필수 단계 알려진된 특정 ligand 없이 이온 채널의 많은 종류에서는 사용 하 여 방지할 수 있습니다. 일부 레이블 없는 기법 NMR 분광학, 엑스레이 회절, 미 thermophoresis (MST)4 및 표면 플라스몬 공명 (SPR) 등 단백질 작은 분자 상호 작용을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 하지만 이러한 유형의 분석 실험 일반적으로 전체 길이 단백질, 역학, 낮은 처리량 및 높은 비용5의 낮은 해상도 얻을 하는 데 어려움 때문에 충분 한 정보를 제공할 수 없습니다. 이러한 기술을 달리 바이오-레이어 간섭계 (BLI)의 표면에 단백질 샘플의 작은 금액을 immobilizing 여 단백질 작은 분자 상호 작용 검출을 위한 이러한 단점을 극복 하기 위해 새로운 레이블 없는 방법론으로 나오고 있다 바이오 센서와 광학 변경 측정 신호6,7. 유망한 바이오 센서 플랫폼으로 라스 기술은 이미 인간 단일 클론 항 체 CR80208 등 수용 성 단백질 자연 물으로 작은 분자의 상호 작용을 관찰 하 수행 되 고 상세한 분석 결과 절차에 보고 되었습니다는 이전 기사9. 새로운 치료 목표 발견을 위한 이온 채널 단백질의 중요 한 역할을 인정 하지만 이온 채널 단백질 작은 분자 상호 작용 분석 결과 라스에 기반 하지 설명 하고있다.
인간 에테르 일품- 채널 (hEAG1) 다양 한 종류의 암 세포와는 채널 a 잠재적인 치료 타겟이 많은 암과 신경 장애10,11의 중앙 신경 조직 표현 12,,1314. 우리 실험실에서 electrophysiological 연구 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2) hEAG1 채널15의 억제 효과 확인 했습니다. 직접 씨 기술을 사용 하 여 hEAG1와의 상호 작용 특히 특정 ligands를 부족 그 채널에 대 한 이온 채널 단백질 작은 분자 화합물 상호 작용의 다른 유형에 대 한 모델 수 핍2 테스트, 우리의 결과에 따라. 씨 분석 결과의 지침에 따라 우리는 hEAG1 단백질 biotinylated를 준비 하 고 그들을 움직일 streptavidin (SA)의 표면에 바이오 센서 팁 다음 상호 작용 그들 핍2 솔루션 사이의 직접 바인딩을 관찰 하는 단백질 그리고 지질은. 핍2 의 첨부 hEAG1 단백질 코팅된 표면, 표면에 층의 두께를 증가, 후는 직접 스펙트럼 변화를 연결 하 고 실시간16에서 측정 될 수 있다. 바인딩 활동 협회 단계에서 긍정적인 변화 및 부정적인 변화 분리 단계에서 확인할 수 있습니다. 이 원리에 따르면 우리는 HEK 239T 안정 식 시스템에서 기능 hEAG1 이온 채널 단백질을 정화 하는 상태를 유지 하는 생체 외에서 기능, 친 화력 정화 방법을 사용 하 여 다음의 바인딩의 활동을 측정 다른 농도2, 핍 고 electrophysiological 측정15에 관측 된 semblable 운동 데이터를 굴복. 씨에서 결과 및 electrophysiological 측정 사이 가까운 통신 처음으로 이온 채널 막 단백질 작은 분자 상호 작용에 대 한 적절 한 분석 도구로 서 씨의 적합성을 보여 줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1697550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>150 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 Substitute</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A610440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A600332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A600560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet-RED96</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>30-5048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition software</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>Version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis software</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>Version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor/Streptavidin</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Machine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>318120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration device</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>UFC503008</td>
			<td>NMWL of 30 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600 Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the interaction kinetics of an ion channel protein with small molecules by the bio-layer interferometry assay

바이오-레이어 간섭계 (BLI) 분석 결과 단백질-단백질 및 단백질 작은 분자 상호 작용을 측정 하기 위한 유용한 도구입니다. 여기, 우리가 먼저 인간 EAG1의 상호 작용을 공부 하이 소설 레이블 없는 기술의 응용 프로그램 설명 (hEAG1) 채널 단백질 작은 분자 핍2. hEAG1 채널 암 및 신경 질환의 어떤 종류에 관련 된 몇 가지 이득의 기능 돌연변이 탈 선 overexpression 때문에 잠재적인 치료 표적으로 인식 하고있다. 우리는 포유류 안정적인 식 시스템에서 hEAG1 채널 단백질을 순화 하 고 씨에 의해 핍2 와 상호 작용을 측정. HEAG1 단백질 및 PIP2 간의 바인딩의 활동의 성공 측정 씨 분석 결과 이온 채널 약리학에 소설 작은 분자 ligand 심사에 사용 되는 잠재적인 높은 처리량 접근 방식을 보여 줍니다.

우리는 HEK 293T 세포 안정적 overexpressed hEAG1에서 플래그 퓨전 hEAG1 채널 단백질 정화. 이 융해 단백질의 기능 패치 클램프 메서드를 사용 하 여 입증 되었습니다 하 고 품질 및 순화 된 단백질의 특이성 서쪽 오 점 (그림 1)에 의해 확인 된다. 순화 채널 단백질 실시간 씨 분석 결과 사용 하 여 지질 (핍2)와 함께 상호 작용 분석을 수행 하는 biotinylat...

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Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

여기에 프로토콜 작은 분자 지질 ligand phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2)을 정제 hEAG1 이온 채널 단백질의 상호 작용을 설명합니다. 측정 씨 소설 작은 분자 이온 채널 ligand 심사에 대 한 잠재적인 방법이 될 수 보여 줍니다.

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

연구

생화학

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

오픈 패치 클램프 피 펫과 Unstirred 경계 층에 이온 농도의 측정: 유체에 의해 이온 채널의 제어 의미 흐름

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

단백질 분리 및 특성에 대 한 다 각 산란 (MALS)를 결합 하는 이온 교환 크로마토그래피 (전류 구동)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

무작위 마이크로시드 매트릭스 스크리닝을 사용하여 I3C로 단백질 결정의 파생

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

작은 분자의 미세 결정 전자 회절

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...