Name: capturing the interaction kinetics of an ion channel protein with small molecules by the bio-layer interferometry assay
Uploaded: 2018-03-07T13:30:00
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Este trabalho é apoiado pelo centro de Bio-ID e SJTU fundo de investigação interdisciplinar em medicina e engenharia (YG2016QN66), Fundação Nacional de ciências naturais da China (31271217) e nacional pesquisa básica programa da China (2014CB910304).

Nota: A linha de celular HEK-293T continuamente expressando a proteína de canal com a tag bandeira hEAG1 é construída por transfecting um plasmídeo Lentivirus pCDH contendo a sequência de DNA de hEAG1 com uma bandeira no C-terminal distal em células HEK-293T seguido o resistente a puromicina seleção conforme descrito anteriormente15.
1. afinidade purificação da proteína de canal hEAG1 bandeira-tag de células HEK-293T
<ol><li>Descongele as células expressa...

<ol>
	<li>Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Interactions+with+Model+Lipid+Membranes:+Applications+in+Drug+Discovery+and+Drug+Delivery.">Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery.</a> Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).</li><li>van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Property-based+design:+Optimization+of+drug+absorption+and+pharmacokinetics.">Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics.</a> J. Med. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).</li><li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses.">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li><li>Shah, N. B., Duncan, T. 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A., Stuhmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eag1:+An+emerging+oncological+target.">Eag1: An emerging oncological target.</a> Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).</li><li>Simons, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+voltage-gated+potassium+channel+gene+KCNH1+cause+Temple-Baraitser+syndrome+and+epilepsy.">Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy.</a> Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).</li><li>Kortum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+KCNH1+and+ATP6V1B2+cause+Zimmermann-Laband+syndrome.">Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome.</a> Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).</li><li>Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eag1+K++Channel:+Endogenous+Regulation+and+Functions+in+Nervous+System.">Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).</li><li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+EAG+channels+are+directly+modulated+by+PIP2+as+revealed+by+electrophysiological+and+optical+interference+investigations.">Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations.</a> Sci. Rep. 6, (2016).</li><li>Do, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+dynamic+binding+capacity+of+resins+for+the+purification+of+proteins.">A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins.</a> PREP. 60 (2), 147-150 (2008).</li><li>Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+specificities+of+inwardly+rectifying+K++channels+for+phosphoinositides.">Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides.</a> J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).</li><li>Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+drug+targets+are+there?.">How many drug targets are there?.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).</li><li>Suh, B. C., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+is+a+necessary+cofactor+for+ion+channel+function:+How+and+why?.">PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+High-affinity+Antibody-antigen+Binding+Kinetics+Using+Four+Biosensor+Platforms.">Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms.</a> J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).</li></ol>

Verificados como os alvos terapêuticos primários de mais de 13% de drogas atualmente conhecidas para o tratamento de uma variedade de doenças humanas, incluindo distúrbios cardiovasculares e neurológicos18canais iônicos de membrana. Remendo-braçadeira de gravação, o padrão ouro para medir o funcional de canais iônicos com pequenas moléculas, tem sido amplamente utilizada para ligantes de canal de íon de triagem. No entanto, tais abordagens eletrofisiológicas não podem demonstrar se ...

Como alvo as proteínas de canal de íon superfície acessível de célula com pequenas moléculas oferece um enorme potencial para a triagem de ligante e descoberta de drogas biológicas a1,2,3. Assim, um instrumento adequado é necessário para estudar a interação entre o canal iônico e pequenas moléculas e sua função correspondente. A gravação da remendo-braçadeira tem demonstrada para ser uma técnica única e insubstituível em ensaio funcional de canal de íon. No entanto, determinar se as pequenas moléculas alvo diretamente canais iônicos exigir outras tecnologias. Tradicionalmente, o ensaio de ligação do ligante radioativo foi usado para observar a cinética de ligação entre pequenas moléculas e sua proteína de canal de íon do alvo. No entanto, o uso desta técnica é limitado por causa de sua exigência em etiquetar radioativo e deteção. Além disso, a etapa pré-requisito para rotular o ligante pequeno no estudo impede seu uso em muitos tipos de canais iônicos sem ligante específico conhecido. Algumas técnicas de etiqueta livre tais como espectroscopia NMR, difração de raios x, microescala thermophoresis (MST)4 e ressonância de plasmon de superfície (SPR) tem sido usadas para medir as interações da proteína-pequena molécula. Mas esses tipos de ensaios geralmente não podem fornecer informações suficientes por causa da dificuldade para obter a proteína completo, baixa resolução de dinâmica, baixa taxa de transferência e de alto custo5. Em contraste com estas técnicas, bio-camada interferometria (BLI) está emergindo como uma metodologia romance livre de rótulo para superar estas desvantagens para detecção de interações proteína-pequena molécula por imobilizando um pequenas quantidades de amostra de proteína nas superfícies das Biosensor e medir a mudança da ótica sinais6,7. Como uma plataforma de biosensor promissor, técnica BLI já é realizada para observar a interação de moléculas pequenas com água natural proteínas solúveis como um anticorpo monoclonal humano CR80208 e o procedimento de ensaio detalhado tem sido relatado em uma anterior artigo9. Embora o papel fundamental da proteína de canal de íon para descoberta de novos alvos terapêuticos tem sido reconhecido, o ensaio de interação molécula de proteína-pequeno de canal íon baseado em BLI não foi descrito.
O ser humano canais éter à go-go (hEAG1) são expressos em vários tipos de células cancerosas e sistema nervoso central, que faz com que o canal um potencial alvo terapêutico de muitos cancros e distúrbios neuronal10,11, 12,13,14. O estudo eletrofisiológico em nosso laboratório confirmou o efeito inibitório de fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2) do hEAG1 canal15. Com base em nossos resultados, teste PIP2 diretamente a interação com o hEAG1, usando a técnica BLI pode ser como um modelo para outros tipos de interação composto de íon canal molécula de proteína-pequeno especialmente para esses canais sem ligantes específicos. De acordo com as instruções de ensaio BLI, estamos preparados biotinilado hEAG1 proteínas e imobilizado-los na superfície do streptavidin (SA) dicas biosensor seguiram de interação-os para soluções de2 PIP para observar sua vinculação direta entre o proteínas e os lipídios. Após a fixação do PIP2 para hEAG1 a superfície revestida de proteína, a espessura da camada na superfície aumenta, que diretamente correlaciona o deslocamento espectral e pode ser medido em tempo real16. A cinética de ligação pode ser determinada devido a uma mudança positiva na etapa de associação e uma mudança negativa na etapa da dissociação. De acordo com este princípio, nós purificado da proteína de canal de íon hEAG1 funcional de HEK-239T expressão estável sistema usando o método de purificação de afinidade para manter o estado funcional in vitro , em seguida, medido a cinética de ligação de concentração diferente PIP2e rendeu um semblable dados cinéticos, como observado em medidas eletrofisiológicas15. A estreita correspondência entre os resultados do BLI e medições eletrofisiológicas demonstram pela primeira vez a adequação do BLI como uma ferramenta analítica adequada para interação de molécula de proteína-pequeno membrana do canal de íon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/High Glucose Medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1697550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>150 mm X 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40 Substitute</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A610476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A610440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A600332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>A600560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3x FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet-RED96</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>30-5048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition software</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>Version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis software</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>Version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor/Streptavidin</td>
			<td>Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Machine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75004250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>318120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration device</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>UFC503008</td>
			<td>NMWL of 30 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>1:5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Imager 600 Imaging System</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing the interaction kinetics of an ion channel protein with small molecules by the bio-layer interferometry assay

O ensaio de interferometria (BLI) bio-camada é uma ferramenta valiosa para a medição da proteína-proteína e interações da proteína-pequena molécula. Aqui, descrevemos primeiro a aplicação desta técnica romance livre de rótulo para estudar a interação de EAG1 humano proteínas de canal (hEAG1) com a pequena molécula PIP2. hEAG1 canal tem sido reconhecida como potencial alvo terapêutico por causa de sua superexpressão aberrante em cânceres e algumas mutações de ganho-de-função envolvida em alguns tipos de doenças neurológicas. Nós purificada proteínas de canal hEAG1 de um sistema de expressão estável mamíferos e medido a interação com PIP2 por BLI. A medida bem sucedida da cinética de ligação entre a proteína hEAG1 e PIP2 demonstra que o ensaio BLI é uma abordagem de alto rendimento potencial usada para a seleção de romance pequeno-molécula ligante em farmacologia do canal de íon.

Nós purificado a bandeira hEAG1 canal proteína da fusão da HEK-293T células estàvel Blumental hEAG1. A função desta proteína de fusão foi demonstrada usando o método da remendo-braçadeira e a qualidade e a especificidade da proteína purificada são confirmadas por Western blot (Figura 1). A proteína purificada canal é biotinilado para realizar um ensaio de interação com os lipídios (PIP2) usando o ensaio BLI em tempo real. A config...

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Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

O protocolo aqui descreve as interações da proteína de canal de íon hEAG1 purificado com a pequena molécula lipídica ligante fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2). A medida demonstra que BLI poderia ser um método potencial para rastreio de ligante de canal novela pequena molécula íon.

Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bioquímica

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Medição da concentração de íons na camada limite Unstirred com pipeta aberto Patch-Clamp: implicações no controle de canais iônicos por fluido fluem

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

Cromatografia de troca iónica (IEX) acoplada ao multi-ângulo espalhamento de luz (MALS) para caracterização e separação de proteínas

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

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Um ensaio de imagem de molécula única in vitro para a análise de cinética de tradução dependente da tampa

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Derivatização de Cristais de Proteína com I3C usando Triagem de Matriz Microseada Aleatória

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Difração de Elétrons Microcristal de Pequenas Moléculas

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...