Name: absolute quantification of plasma microrna levels in cynomolgus monkeys, using quantitative real-time reverse transcription pcr
Uploaded: 2018-02-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR at JoVE.com

Bu araştırma belirli herhangi bir hibe finansmanı kuruluşları kamu, ticari veya değil, kar amacı gütmeyen sektörlerde üzerinden almadı.

Tüm deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Daiichi Sankyo Co., Ltd. tarafından kabul edildi
1. numune hazırlama
<ol><li>Kan (en az 0.5 mL) cynomolgus maymunlar femoral ven EDTA 2 K içeren tüpler içine toplamak. Not: Bu antikoagülanlar sonraki PCR14,15inhibe çünkü sitrat ve heparin kabul edilebilir değildir.</li>
	<li>Toplanan örnekleri hemen buz ve plazma yalıtım koleksiyonunun 2 saat içinde için s?...

<ol>
	<li>Sch&#246;ler, N., Langer, C., D&#246;hner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+as+a+novel+class+of+biomarkers:+a+comprehensive+review+of+the+literature.">Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature.</a> Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).</li><li>Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Noncoding+RNAs+as+Biomarkers+of+Cardiovascular+Disease+and+Injury.">Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury.</a> Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).</li><li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction.">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).</li><li>Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+quantitative+RT-PCR+array+in+miRNA+expression+profiling+and+comparison+with+microarray+analysis.">Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis.</a> BMC Genomics. 10, 407 (2009).</li><li>Nassirpour, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tubular+injury+microRNA+biomarkers+in+urine:+comparison+of+next-generation+sequencing+and+qPCR-based+profiling+platforms.">Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms.</a> BMC Genomics. 15, 485 (2014).</li><li>Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+do+successful+gene+expression+analysis+using+real-time+PCR.">How to do successful gene expression analysis using real-time PCR.</a> Methods. 50 (4), 227-230 (2010).</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+need+for+qPCR+publication+guidelines?--The+case+for+MIQE.">Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE.</a> Methods. 50 (4), 217-226 (2010).</li><li>Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microRNA+biomarkers+in+plasma+and+serum+using+quantitative+reverse+transcription-PCR+(qRT-PCR).">Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR).</a> Methods. 50 (4), 298-301 (2010).</li><li>Thompson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Measurement+of+Cardiac+Injury-Induced+microRNAs+in+Biofluids+across+Multiple+Test+Sites.">Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites.</a> Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).</li><li>Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Analysis+of+Circulating+microRNA+Specific+to+the+Liver,+Heart,+and+Skeletal+Muscle+of+Cynomolgus+Monkeys.">Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys.</a> Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).</li><li>Matsuzaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+serum+biomarkers,+miR-1,+miR-133a,+and+miR-206+for+Limb-girdle+muscular+dystrophy,+Facioscapulohumeral+muscular+dystrophy,+and+Becker+muscular+dystrophy.">Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy.</a> Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).</li><li>Starkey Lewis, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+potential+markers+of+human+drug-induced+liver+injury.">Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury.</a> Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs,+potential+biomarkers+for+drug-induced+liver+injury.">Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).</li><li>Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+Circulating+MicroRNAs+in+Exosomes/Extracellular+Vesicles+from+Serum+or+Plasma+by+qRT-PCR.">Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).</li><li>Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+heparin+inhibition+in+circulating+MicroRNAs+amplification.">Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification.</a> Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).</li><li>Cheng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+processing+conditions+substantially+influence+circulating+microRNA+biomarker+levels.">Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels.</a> PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).</li><li>Serafin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+set+of+endogenous+reference+genes+for+miRNA+expression+studies+in+Parkinson's+disease+blood+samples.">Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples.</a> BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+external+reference+controls/probes+that+enable+quality+assurance+between+different+microarray+platforms.">A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms.</a> Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).</li><li>Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+microRNAs:+potential+biomarkers+in+need+of+standardized+reporting.">Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting.</a> Front Genet. 4, 56 (2013).</li><li>Malentacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDIA-RNA:+second+external+quality+assessment+for+the+pre-analytical+phase+of+blood+samples+used+for+RNA+based+analyses.">SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses.</a> PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).</li><li>Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+circulating+miRNAs+in+plasma:+effect+of+preanalytical+and+analytical+parameters+on+their+isolation+and+stability.">Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability.</a> J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).</li><li>Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+microRNA+profiles+in+rat+models+of+hepatocellular+injury,+cholestasis,+and+steatosis.">Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis.</a> PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).</li><li>Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Hemolysis+on+Cell-Free+microRNA+Biomarkers.">The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers.</a> Front Genet. 4, 94 (2013).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+stem-loop+RT-qPCR+miRNA+expression+profiling+using+minute+amounts+of+input+RNA.">High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA.</a> Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).</li><li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+approaches+and+considerations.">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).</li><li>Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers.">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).</li><li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR.">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomark. Res. 3, 12 (2015).</li><li>Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+circulating+miRNAs+by+droplet+digital+PCR:+comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-based+chemistries.">Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries.</a> Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).</li></ol>

Bizim kapsamlı değerlendirme ölçüde bireysel örnekleri arasında varyasyon büyüklüğü test miRNAs arasında son derece farklı olduğunu açıkça belirtti dinamik aralığının daha titiz bir istatistiksel analize sağlanan. Bu varyasyonlar vücut sıvıları onların küçük miktarlarda atfedilebilecek olabilir, ancak bu veriler sadece biyolojik varyasyonları, aynı zamanda teknik varyasyonlar yansıtmak belirtmek gerekir. Teknik değişim çoğu aracılığıyla diğer tahlil platformlar...

Çalışmalar giderek artan sayıda edilmiş mikroRNA (miRNAs) Tanı ve Prognozunda kanserleri, biyolojik olarak keşfetmek veya izleme ve diğer hastalıklar tespit nonclinical ve klinik çalışmalar1,2',3 . Nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) Bu teknik Mikroarray4 ve RNA sıralamanın tabanlı platformlar5daha fazla duyarlı olduğundan tek tek hedef miRNAs, değerlendirmek için kullanılan en yaygın yöntemlerden biridir. Genel olarak, miRNA ifade ΔCq yöntem6kullanarak örneği göre ölçülür. Fizyolojik değişiklikler hedef gen ifade düzeyleri soruşturma için uygun bir yaklaşımdır. Ancak, miRNAs dolaşan göreli miktar yardımcı programı onların küçük miktarlarda nedeniyle sınırlıdır. Buna ek olarak, teknik değişim zor çünkü farklı laboratuvarlar RT-qPCR deneysel protokoller farklı, hangi için tutarsız açar özelleştirebilir veya hatta çelişkili sonuçlar farklı çalışmalar, sonuçlarını karşılaştırmak yapar Farklı çalışmalar7.
Endişeleri yukarıda belirtilen içinde görüş-in mutlak miktar miRNAs vücut sıvıları içinde küçük miktarlarda değerlendirilmesi için daha uygun olabilir. Mutlak miktar yöntem bilinen ilgili hedef miRNA8için sırayla aynı sentetik RNA oligonucleotides konsantrasyonları oluşturulan standart bir eğri kullanır. Sağlık ve Çevre Bilimleri Enstitüsü (HESI) teknik komite genomik üzerinde son zamanlarda birden çok test sitede plazma miRNAs, mutlak ölçümleri sonuçlarını karşılaştırmak için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır. Sonuçlar miRNAs mutlak Nefelometri için standart bir protokol kullanarak birden çok test siteleri9arasında karşılaştırılabilir sonuç vermedi gösterdi. Bu da çalışmanın açıklanan RT-qPCR tahlil yöntemi birden çok miRNA hedefleri ve düşük ifade miRNAs tespiti yardım etmek için ön amplifikasyon çoğaltılmış analiz içeren HESI'ın standart iletişim kuralı için hemen hemen aynıdır.
Bu çalışmada, EDTA-plazma kandan hazırlanan bir sabit hacmi (200 µL) toplanan bilinçli cynomolgus maymunlar femoral ven (n = 50) kullanılan10yapıldı. Aşağıdaki iletişim kuralı ayıklama miRNA ve RT-qPCR öncesi amplifikasyon dahil olmak üzere, plazma numuneleri, hazırlanması için yordamı açıklar. Daha da önemlisi, böylece hedef miRNAs örneklerde miktarı nitelikli bir süreç ile birlikte onaylanabildiğini protokolü hakkında ek teknik bilgiler dahil, oldu. İlk olarak, her miRNA standart eğri onun miktar biyolojik örneklerde önce kendi bireysel algılama aralığı için doğrulandı. İkinci olarak, geçerli metodoloji kalitesini kapsamlı bir dış denetim (cel-miR-238) Cq değerlerinin yoluyla değerlendirilmiştir. Bu nedenle, bu platformun farklı çalışmalar veya laboratuar sonuçlarını karşılaştırmak için daha bilgilendirici ve güvenilir veri verir.
Temsilcisi sonuçları olarak 8 miRNAs profilleri bu rapora dahil burada açıklanan tahlil yöntemi. Bu miRNAs (miR-1, miR-208a, miR-208b ve miR-499a) kalp ve iskelet kası (miR-133a ve miR-206) kemirgenler ve insanlar3(miR-122 ve miR-192), karaciğer doku yaralanması ile potansiyel Emanet biyolojik ilişkili olarak önerilmiştir, 11,12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">BD Microtainer tube (K2EDTA)</td>
			<td style="width:195px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">365974</td>
			<td style="width:167px;">For blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030124359</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&#160; 1.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Safe-Lock micro test tubes&#160; 2.0 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Synthetic oligonucleotide</td>
			<td style="width:195px;">Hokkaido System Science</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Individual miRNA (0.2 &#956;mol,HPLC grade)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris-EDTA Buffer&#160; (pH 8.0)</td>
			<td style="width:195px;">Nippon Gene</td>
			<td style="width:119px;">314-90021</td>
			<td style="width:167px;">TE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Buffer RPE</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Buffer RWT</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">miRNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">217004</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nuclease-Free Water&#160;</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">129114</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Contents in miRNeasy mini kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic&#160;</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">219600</td>
			<td style="width:167px;">ID:MSY0000293, 5 nmol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SC Adapters</td>
			<td style="width:195px;">TAIGEN Bioscience Corporation</td>
			<td style="width:119px;">S0120</td>
			<td style="width:167px;">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">VacEZor 36 Complete System</td>
			<td style="width:195px;">TAIGEN Bioscience Corporation</td>
			<td style="width:119px;">M3610</td>
			<td style="width:167px;">For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4351405</td>
			<td style="width:167px;">Fast 96-Well Block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">9700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4346907</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4311971</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4444557</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000248</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002245</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002246</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002222</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000491</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 000511</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 002290</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4427975</td>
			<td style="width:167px;">Assay ID: 001352</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan MicroRNA Reverse 
			Transcription Kit</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4366597</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan PreAmp Master Mix (2&#215;)</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">4391128</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Wako Pure Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">035-02616</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol (99.5)</td>
			<td style="width:195px;">Wako Pure Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">057-00456</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absolute quantification of plasma microrna levels in cynomolgus monkeys, using quantitative real-time reverse transcription pcr

RT-qPCR tek tek hedef miRNAs değerlendirmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. MiRNAs düzeyleri genellikle örneği göre ölçülür. Fizyolojik değişiklikler hedef gen ifade düzeyleri incelenmesi için uygun bir yaklaşımdır. Ancak, mutlak miktar daha iyi istatistiksel analizi kullanılarak gen ifade düzeyleri kapsamlı bir değerlendirme için tercih edilir. Mutlak miktar ortak değil hala kullanın. Bu rapor plazma miRNA, RT-qPCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar.
EDTA-plazma sabit birim (200 µL) bilinçli cynomolgus maymunlar femoral ven toplanan kan üzerinden hazırlanan (n = 50). Toplam RNA ticari olarak mevcut sistemi kullanılarak ayıklandı. Plazma miRNAs miRNA özgü ileri/geri PCR astar ve yoklama içeren sonda tabanlı RT-qPCR deneyleri tarafından sayısal. Standart Eğriler mutlak miktar için piyasada bulunan sentetik RNA oligonucleotides kullanarak oluşturulan. Sentetik bir cel-miR-238 normalleştirme ve kalite değerlendirmesi için bir dış denetimi olarak kullanıldı. Miktar döngüsü (Cq) değerleri 35 yukarıda gösterdi miRNAs qPCR adım önce önceden güçlendirilmiş.
MiR-1, miR-206 ve miR-499a öncesi amplifikasyon onların düşük ifade seviyeleri nedeniyle gerekli ise muayene 8 miRNAs arasında miR-122, miR-133a ve miR-192 öncesi amplifikasyon tespit edildi. MiR-208a ve miR-208b sonra bile öncesi amplifikasyon tespit değildi. Örnek işleme verimliliğini çivili cel-miR-238 Cq değerleri tarafından değerlendirilmiştir. Bu tahlil yöntemde teknik değişim az 3 kat olarak tahmin edilmiştir ve miktar (LLOQ) alt sınırı 102 kopya/µL, çoğu muayene miRNAs için yapıldı.
Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi bir tahmin sağlar ve kalite değerlendirmesi farklı çalışmalar ilgili verileri sağlar. MiRNAs vücut sıvıları, ön amplifikasyon içinde az sayıda kötü tespiti geliştirmek yararlı olduğunu göz önünde bulundurarak miRNAs dile getirdi.

RT-qPCR tarafından miRNA testin iş akışı ve kalite assessment Şekil 1 qPCR10kullanarak kan örnekleri miRNA tahlil iş akışı gösterir. Deneyler kalitesini cel-miR-238 dış denetimi de dahil olmak üzere tarafından doğrulanabilir. Bu RNA ayıklama teknik farklılığı ortaya çıkaracaktır ve sonraki RT-qPCR işler. Bu çalışmada, Cq değerleri 50 örnekleri hesaplanan ortalama ± SD 21,0 ±...

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR at JoVE.com

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Bu rapor plazma miRNA, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi anlaşılmasını tanıyor ve nitel karşılık gelen verilerden farklı çalışmalar veya laboratuvar değerlendirmesini sağlar.

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Thermo Scientific Solaris qPCR Testi kullanarak Kantitatif Real-Time PCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA&#39;lar ve microRNA, Profilleme

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analizi - A Yüksek Verimli, Sc2.0 Genotiplendirme için Real Time PCR Testi

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...