Name: a western blotting protocol for small numbers of hematopoietic stem cells
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00
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National Institutes of Health accorder R01 CA149976 (Nada) prise en charge de ce travail.

Toutes les opérations doivent être exécutées conformément aux directives de soins et de l’utilisation institutionnelle des animaux. La procédure a été développée pour l’analyse de des cellules hématopoïétiques souches et progénitrices (CSH et HPs), mais peut être adaptée pour l’analyse des autres populations de cellules.
1. écoulement Cytometry isolement d’autorenouveler murin et HPs
<ol><li>Récolter les murins de la moelle osseuse des cellules comme décrit dans la...

<ol>
	<li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry.">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells.">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li><li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate.">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage.">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li><li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal.">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li><li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs.">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li><li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+global+gene+expression+analysis.">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemoacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li><li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation.">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099 (2014).</li></ol>

Western Blot est une technique courante pour détecter les protéines spécifiques et l’activation des voies de signalisation dans les tissus ou cellules. Par l’introduction de petits ajustements à une procédure couramment utilisée, nous avons pu détecter systématiquement 15 différentes protéines (Table des matières) dans 15 000 GPX et dans certains cas en aussi peu que 500 CSH. The Most des étapes cruciales dans le présent protocole sont : 1) exactement compter les cellules 2) minimiser l...

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont autorenouvellement des cellules qui peuvent donner lieu à toutes les lignées de sang. Ils sont relativement rares cellules dans la moelle osseuse, analyses biochimiques de rendu difficile. Approprié pour l’analyse des cellules rares, comme la cytométrie en flux, des approches ont été très utiles pour quantifier les quantités relatives des marqueurs de surface de cellules et de protéines intracellulaires. Cependant, l’analyse des protéines intracellulaires nécessite l’utilisation de procédures de perméabilisation de cellules pour permettre l’accès d’anticorps, et pas tous les épitopes de surface survivent ces procédures1,2. En outre, les anticorps qui établissent une discrimination entre les produits de différentes protéines isoformes ou de clivage ne sont pas souvent disponibles pour cytométrie en flux, et donc enquêteurs comptent encore sur les transferts Western pour certains types d’analyses.
Analyse par Western blot des lysats cellulaires est une procédure de routine dans la plupart des laboratoires. Cellules peuvent être épurées dans des conditions natives qui préservent les épitopes de molécules de surface de cellules, et par la suite, lysats cellulaires peuvent être préparés et analysés. Cependant, l’analyse des protéines dans des cellules primaires rares populations par Western blot peut exiger euthanasier un grand nombre d’animaux pour obtenir suffisamment de cellules. En faisant de petits ajustements à plusieurs étapes, un protocole épongeant occidental conventionnel a été en mesure de détecter les protéines dans un relativement petit nombre de CSH (500-15 000, selon la protéine d’intérêt). Les réglages comprennent exactement compter les cellules, manipuler avec précaution le culot cellulaire, réduisant les transferts de cellules entre tubes pour minimiser la perte de cellules, et lyse un nombre défini de cellules avec une charge concentrée de la mémoire tampon contenant du protéasome et inhibiteurs de la phosphatase. Plusieurs rapports publiés incluent des Western blots obtenus avec 20 000 ou plusieurs CSS3,4,5,6,7; Cette procédure très simple permettra de réduire le nombre de cellules et les animaux de laboratoire nécessaires pour produire les données équivalentes d’entre 4 et 40 fois. Le protocole vise à normaliser les résultats sur une base par cellule, plutôt qu’à un contrôle interne. Cela permet de détecter une réduction globale des taux de protéines qui peut être négligée si les données sont normalisées à un contrôle interne. L’importance de la normalisation sur une base par cellule a été décrit pour l’analyse du gène expression données8, et le même principe s’applique à la quantification des protéines par Western blot. Ce protocole optimisé devrait être utile pour tous ceux qui ont besoin d’analyser un petit nombre de cellules.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamidel Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5M Tris-HCl pH8.8</td>
			<td>TEKNOVA</td>
			<td>T1588</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0M Tris-HCl pH6.8</td>
			<td>TEKNOVA</td>
			<td>T1068</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-protean 3 comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653360</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658005EDU&#160;</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704155EDU</td>
			<td>transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052EDU&#160;</td>
			<td>electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195&#160;</td>
			<td>signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747EDU&#160;</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732EDU&#160;</td>
			<td>electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710EDU</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704272&#160;</td>
			<td>transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11697498001</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktailrs</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>GB-450-1</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4G</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2469</td>
			<td>WB antibody, validated in 1000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): Fig2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rps6</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4858</td>
			<td>WB antibody,validated in 1000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): Fig2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>actin(HRP conjugated)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab49900</td>
			<td>WB antibody,validated in 500 cells 
			antibody concentration: 1:5000 
			reference(figure): Fig1, Fig2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab48394</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2317</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4EBP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>WB antibody, validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-4EBP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2855</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSC2</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4308</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4877</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTEN</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9188</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (FigS1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTOR</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2983</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (FigS1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-mTOR</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5536</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (FigS1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP2AB</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4953</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (FigS1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AMPKa</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (FigS1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:3000 
			reference(figure): ref5 (Fig4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lineage depletion kit (mouse)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>hematopoietic stem and progenitor cells purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td>hematopoietic stem and progenitor cells purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>phosphorylation stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7 c-kit antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A15423</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-B220</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>48-0452-82</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3e</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>48-0031-82</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mac1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>48-0112-82</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Gr1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>48-5931-82</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ter119</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>48-5921-82</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A30075</td>
			<td>membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>A12450</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S17040</td>
			<td>cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flim</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>E3012</td>
			<td>signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical film processor</td>
			<td>Konica</td>
			<td>SRC-101A</td>
			<td>signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Therom Scientific</td>
			<td>34096</td>
			<td>signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>X-15R</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUEstain protein ladder</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P007-500</td>
			<td>electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSAria II</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incublock</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>I0510</td>
			<td>electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a western blotting protocol for small numbers of hematopoietic stem cells

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont des cellules rares, avec la moelle osseuse de souris contenant seulement ~ 25 000 phénotypique long terme autorenouveler repopulation. Un protocole Western Blot a été optimisé et adapté à l’analyse d’un petit nombre de CSH (500-15 000 cellules). Autorenouveler phénotypiques ont été purifiés, compté avec précision et lysées directement dans la mémoire tampon de Laemmli témoin. Lysats contenant un nombre égal de cellules ont été analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE), et la tache a été préparée et traitées suite à la série Western blotting protocoles. Utilisant ce protocole, 2 000-5 000 CSH peut être systématiquement analysée, et dans certains cas peuvent être tirées d’aussi peu que 500 cellules, par rapport à des cellules de 20 000 à 40 000 rapportés dans la plupart des publications. Ce protocole devrait être généralement applicable à d’autres cellules hématopoïétiques et permet l’analyse de routine d’un petit nombre de cellules à l’aide de procédures standard de laboratoire.

Des résultats représentatifs de 500-2 000 purifiée autorenouveler et HPs sont indiquées dans la Figure 1 et Figure 2. Le signal de β-actine dans la Figure 1 peut être détecté aussi peu que 500 autorenouveler et HPs purifiée à partir de la moelle osseuse de souris. Notez que les lysats de chargement dans les puits de 1,5 mm produit un signal beaucoup plus fort de 500 HPs chargement dans les ...

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A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Un standard Western blotting protocole a été optimisé pour analyser aussi peu que 500 souches hématopoïétiques ou de cellules progénitrices. Optimisation implique attention manipulation de l’échantillon cellulaire, limiter les transferts entre les tubes et lyse directement les cellules de la mémoire tampon de Laemmli témoin.

Un Western Blotting protocole pour un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

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