Name: a western blotting protocol for small numbers of hematopoietic stem cells
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00
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National Institutes of Health concedere R01 CA149976 (ale) sostenuto questo lavoro.

Tutte le procedure devono essere eseguite conformemente all'uso animale istituzionale e orientamenti di cura. La procedura è stata sviluppata per l'analisi di murine cellule ematopoietiche staminali e progenitrici (HSCs e HPs), ma può essere adattata per l'analisi di altre popolazioni cellulari.
1. flusso Cytometry isolamento di HSCs murino e HPs
<ol><li>Raccogliere le cellule del midollo osseo murino come descritto in letteratura6. Nota: Nei dati presentati in <...

<ol>
	<li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry.">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells.">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li><li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate.">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage.">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li><li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal.">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li><li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs.">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li><li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+global+gene+expression+analysis.">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemoacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+Protein+with+SDS-PAGE.">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Western+Blot.">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li><li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation.">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099 (2014).</li></ol>

Western Blotting è una tecnica comune per la rilevazione di proteine specifiche e l'attivazione di vie di segnalazione in tessuti o cellule. Con l'introduzione di piccole modifiche ad una procedura comunemente utilizzata, siamo stati in grado di rilevare ordinariamente 15 proteine diverse (Tabella materiali) a 15.000 HSCs e in alcuni casi in appena 500 HSCs. Le fasi critiche in questo protocollo sono: 1) accuratamente contando le cellule, 2) riducendo al minimo il numero di trasferimenti tra tubi e 3) l...

Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule autorinnovabile che possono dare origine a tutti i lignaggi di sangue. Essi sono relativamente rare cellule nel midollo osseo, rendendo difficile analisi biochimiche. Adatto per l'analisi di cellule rare, come la citometria a flusso, gli approcci sono stati estremamente utili per quantificare la quantità relativa di marcatori di superficie delle cellule e proteine intracellulari. Tuttavia, l'analisi delle proteine intracellulari richiede l'uso di procedure di permeabilizzazione delle cellule per consentire l'accesso dell'anticorpo, e non tutte le superficie epitopi sopravvivono queste procedure1,2. Inoltre, gli anticorpi che discriminano tra prodotti di isoforme o scissione di diverse proteine non sono spesso disponibili per citometria a flusso, e quindi gli investigatori si basano ancora su Western blot per determinati tipi di analisi.
L'analisi Western blot dei lisati cellulari è una procedura di routine nella maggior parte dei laboratori. Le cellule possono essere purificate in condizioni native che conservano gli epitopi di molecole della superficie cellulare e lisati cellulari possono successivamente essere preparati ed analizzati. Tuttavia, l'analisi delle proteine nella cellula primaria rara popolazioni mediante Western blot può richiedere gran numero di animali per ottenere abbastanza cellule di eutanasia. Apportando piccole modifiche a diversi passi, un protocollo macchiante occidentale convenzionale è stato in grado di rilevare le proteine in un relativamente piccolo numero di HSCs (500-15.000, a seconda della proteina di interesse). Le regolazioni sono accuratamente contando le cellule, gestire attentamente il pellet cellulare, riducendo i trasferimenti delle cellule fra tubi per ridurre al minimo la perdita delle cellule, e un numero definito di cellule con un carico concentrato di lisi del buffer contenente proteasoma e inibitori delle fosfatasi. Molti rapporti pubblicati includono Western blot ottenuti con 20.000 o più HSCs3,4,5,6,7; Questa semplice procedura ridurrà il numero delle cellule e animali da esperimento necessari per produrre dati equivalenti di compreso tra 4 e 40 volte. Il protocollo è progettato per normalizzare i risultati su base per cella, piuttosto che ad un controllo interno. Questo consente il rilevamento di riduzioni complessive nei livelli della proteina che possono essere trascurati se i dati sono normalizzati ad un controllo interno. L'importanza della normalizzazione su base per cellula è stato descritto per l'analisi dei dati di espressione genica8, e lo stesso principio si applica a quantificare le proteine mediante Western blot. Questo protocollo ottimizzato dovrebbe essere utile per chiunque abbia bisogno di analizzare un piccolo numero di cellule.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP150-20</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamidel Bis solution</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610158</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5M Tris-HCl pH8.8</td>
			<td>TEKNOVA</td>
			<td>T1588</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0M Tris-HCl pH6.8</td>
			<td>TEKNOVA</td>
			<td>T1068</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP179-25</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mini-protean 3 comb</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653360</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658005EDU&#160;</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704155EDU</td>
			<td>transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645052EDU&#160;</td>
			<td>electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708195&#160;</td>
			<td>signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747EDU&#160;</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732EDU&#160;</td>
			<td>electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710EDU</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704272&#160;</td>
			<td>transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11697498001</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktailrs</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>GB-450-1</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4G</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>2469</td>
			<td>WB antibody, validated in 1000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): Fig2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Rps6</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>4858</td>
			<td>WB antibody,validated in 1000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): Fig2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>actin(HRP conjugated)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab49900</td>
			<td>WB antibody,validated in 500 cells 
			antibody concentration: 1:5000 
			reference(figure): Fig1, Fig2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab48394</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2317</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4EBP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>WB antibody, validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-4EBP1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2855</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSC2</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4308</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSP90</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4877</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (Fig5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTEN</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9188</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (FigS1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTOR</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2983</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (FigS1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-mTOR</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5536</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (FigS1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP2AB</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4953</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (FigS1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AMPKa</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2535</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:1000 
			reference(figure): ref5 (FigS1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-47778</td>
			<td>WB antibody,validated in 15000 cells 
			antibody concentration: 1:3000 
			reference(figure): ref5 (Fig4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lineage depletion kit (mouse)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-858</td>
			<td>hematopoietic stem and progenitor cells purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td>hematopoietic stem and progenitor cells purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-03</td>
			<td>phosphorylation stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7 c-kit antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A15423</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-B220</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>48-0452-82</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3e</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>48-0031-82</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Mac1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>48-0112-82</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Gr1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>48-5931-82</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ter119</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>48-5921-82</td>
			<td>cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1653311</td>
			<td>&#160;SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A30075</td>
			<td>membrane blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>A12450</td>
			<td>medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td>cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>&#160;S17040</td>
			<td>cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flim</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>E3012</td>
			<td>signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical film processor</td>
			<td>Konica</td>
			<td>SRC-101A</td>
			<td>signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Therom Scientific</td>
			<td>34096</td>
			<td>signal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>X-15R</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUEstain protein ladder</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P007-500</td>
			<td>electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSAria II</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incublock</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>I0510</td>
			<td>electrophoresis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a western blotting protocol for small numbers of hematopoietic stem cells

Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule rare, con il midollo osseo di topo contenente solo ~ 25.000 fenotipica lungo termine repopulating HSCs. Un protocollo macchiante occidentale è stata ottimizzata e adatta per l'analisi di un piccolo numero di HSCs (500-15.000 cellule). Fenotipica HSCs sono stati purificati, accuratamente contati e direttamente lisate nel tampone di Laemmli. Lisati contenente un numero uguale di cellule sono stati analizzati mediante elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) e la macchia è stata preparata ed elaborato seguendo standard Western blotting protocolli. Usando questo protocollo, 2.000-5.000 HSCs può essere analizzato sistematicamente, e in alcuni casi i dati possono essere ottenuti da poco più di 500 cellule, confrontate alle cellule 20.000 a 40.000 segnalate nella maggior parte delle pubblicazioni. Questo protocollo dovrebbe essere generalmente applicabile ad altre cellule ematopoietiche e consente l'analisi di routine di un piccolo numero di celle utilizzando le procedure standard di laboratorio.

Risultati rappresentativi da 500-2.000 purificata HSCs e HPs sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2. Il segnale di β-actina nella Figura 1 può essere rilevato da poco più di 500 HSCs e HPs purificate dal midollo osseo di un mouse. Si noti che i lisati di caricamento nei pozzetti di 1,5 mm prodotto un segnale molto più forte da 500 HPs di caricamento nei pozzetti di 3,0 mm. F...

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A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Un standard Western blotting protocollo è stato ottimizzato per analizzare come pochi come 500 ematopoietiche staminali o cellule progenitrici. Ottimizzazione comporta un'attenta manipolazione del campione cellulare, limitando i trasferimenti tra tubi e Lisi direttamente le cellule in tampone di Laemmli.

Un Western Blotting protocollo per un piccolo numero di cellule staminali ematopoietiche

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

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