Name: an in vivo murine sciatic nerve model of perineural invasion
Uploaded: 2018-04-23T13:00:00
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Gli autori riconoscono i servizi tecnici forniti dall'impianto di citologia molecolare e la struttura animale del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio NIH CA157686 (per R.J. Wong) e P30 CA008748 (concessione di supporto Memorial Sloan Kettering Cancer Center).

Tutte le procedure con soggetti di animali sono state approvate dal comitato di uso al Memorial Sloan Kettering Cancer Center e istituzionali Animal Care.
1. preparazione delle cellule tumorali
<ol><li>Raccolta cellule Panc02-H7 Sub-confluenti con tripsina 0,25% per 5 min a 37 ° C. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL. Nota: Le cellule sono coltivate in pallone a T-225, che contiene circa 12 x 106 cellule per beuta a confluency di 80% e la tripsina 4ml...

<ol>
	<li>Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+in+cancer.">Perineural invasion in cancer.</a> Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).</li><li>Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+and+associated+pain+in+pancreatic+cancer.">Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer.</a> Nat Rev Cancer. 11 (10), 695-707 (2011).</li><li>Deborde, S., Wong, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Schwann+cells+facilitate+cancer+progression+in+nerves.">How Schwann cells facilitate cancer progression in nerves.</a> Cell Mol Life Sci. 341 (177-186), 1236361-1236416 (2017).</li><li>Abiatari, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+transcriptome+signature+of+perineural+invasion+in+pancreatic+carcinoma.">Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma.</a> Mol Cancer Ther. 8 (6), 1494-1504 (2009).</li><li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+dorsal+root+ganglia+and+human+prostate+cell+line+interaction:+redefining+perineural+invasion+in+prostate+cancer.">In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer.</a> Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).</li><li>Gil, Z., Cavel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+pancreatic+cancer+cell+invasion+by+peripheral+nerves.">Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves.</a> J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).</li><li>Deborde, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+induce+cancer+cell+dispersion+and+invasion.">Schwann cells induce cancer cell dispersion and invasion.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1538-1554 (2016).</li><li>Pour, P. M., Egami, H., Takiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+growth+and+metastases+of+induced+pancreatic+cancer+in+relation+to+the+prognosis+and+its+clinical+implications.">Patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implications.</a> Gastroenterology. 100 (2), 529-536 (1991).</li><li>Eibl, G., Reber, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+nude+mouse+model+for+perineural+invasion+and+recurrence+in+pancreatic+cancer.">A xenograft nude mouse model for perineural invasion and recurrence in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 31 (3), 258-262 (2005).</li><li>Stopczynski, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroplastic+changes+occur+early+in+the+development+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Res. 74 (6), 1718-1727 (2014).</li><li>Gil, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-sparing+therapy+with+oncolytic+herpes+virus+for+cancers+with+neural+invasion.">Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion.</a> Clin Cancer Res. 13 (21), 6479-6485 (2007).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Cremer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+N-CAM+gene+in+mice+results+in+size+reduction+of+the+olfactory+bulb+and+deficits+in+spatial+learning.">Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning.</a> Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+(CCL2-CCR2)+signaling+axis+mediates+perineural+invasion.">The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion.</a> Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFR&#945;1+released+by+nerves+enhances+cancer+cell+perineural+invasion+through+GDNF-RET+signaling.">GFR&#945;1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling.</a> P Natl Acad Sci USA. , 02944 (2014).</li></ol>

In questo protocollo viene descritto un modello murino in vivo dell'invasione perineurale che permette per la quantificazione del nervo sciatico invasione dalle cellule di cancro del pancreas. Questo modello permette lo studio dei meccanismi molecolari dell'invasione del nervo. Esperimenti riusciti utilizzando questa tecnica richiedono un approccio attento a tre passaggi critici nel processo: 1) l'iniezione delle cellule tumorali (passi 2.7, 2.8), 2) l'estrazione dei nervi invasi (punto 3.4) e 3) elaborazione de...

I nervi formano un microambiente tumorale specifico che stimola il cancro crescita e migrazione1,2,3. Invasione perineurale (PNI) è il processo attraverso cui il cancro cellule invadono in e intorno ai nervi. Può essere considerato come un unico itinerario della metastasi dall'invasione tumorale estende lontano dai siti di origine lungo i nervi. PNI è trovato in molti tipi di cancro tra cui testa del pancreas, della prostata & collo, salivario, cervicale e cancri colorettali con un'incidenza che varia da 22% a 100%1,2. PNI è associato con dolore e correla con la prognosi difficile e peggio sopravvivenza tariffe1,2.
Sviluppo di modelli di invasione perineurale è essenziale per delucidare i meccanismi cellulari e molecolari di questo processo e per candidati agenti terapeutici per ridurre PNI di test. Metodi in vitro di studiare le interazioni tra tumori e nervi comprendono la co-coltura delle cellule tumorali con nervo espianti4, con radice dorsale i gangli5,6,7o con celle specifiche dal nervo microambiente come Schwann cells7. In vivo gli approcci, tuttavia, sono più fisiologicamente rilevanti, includono l'uso di modelli murini di cancro in cui il cancro è stato indotto o trapiantato e hanno il vantaggio di contabilità per il microambiente intero nervo. In orthotopic modelli di cancro del pancreas o della prostata, PNI è stato segnalato8,9,10 e l'incidenza delle PNI può essere registrata, ma a causa delle piccole dimensioni dei nervi in quegli organi, è difficile da vedere l'intero nervo e quindi per quantificare l'entità del PNI. Il modello che qui descritto è un modello in vivo di PNI in cui il cancro le cellule vengono iniettate nel nervo sciatico dei topi tramite un semplice intervento chirurgico11. Il trapianto heterotopic invade all'interno del nervo verso il midollo spinale. La lunghezza dell'invasione del nervo dal sito di iniezione al midollo spinale può essere misurata, così come il volume del cancro all'interno del nervo. D'importanza, il nervo invaso possa essere raccolti anche per una varietà di analisi compreso analisi microscopiche e molecolare. Una varietà di cellule tumorali possa essere testata, e i topi di host che sono stati geneticamente modificati o trattati con composti specifici possono essere usati pure. Questo potente test permette di essere modificate per indagine sui meccanismi di PNI per le cellule tumorali e il microambiente di host.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:973px;" width="973">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Mouse</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">Number and age variable depending on experimental needs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Steps 1.1, 1.2, 1.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C-S</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electric razor</td>
			<td>WAHL</td>
			<td>9962</td>
			<td>Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane, 250 mL</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936060</td>
			<td>Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hypoallergenic surgical tape</td>
			<td>3M Blenderm</td>
			<td>70200419342</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Betadine Swapsticks</td>
			<td>PDI</td>
			<td>SKU 41350</td>
			<td>Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Webcol Alcohol Preps</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile surgical tools (scissors and forceps)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10 &#956;L Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80308</td>
			<td>Steps 2.7, 2.8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Steel Micro spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S50823</td>
			<td>Step 2.7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2.7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacine, 1 g</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-NA139-0001</td>
			<td>Step 2.9. Reconstitute to 0.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5-0 Nylon suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>698H</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue-Tek Cryomold Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-916</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo murine sciatic nerve model of perineural invasion

Le cellule tumorali invadono nervi attraverso un processo chiamato invasione perineurale (PNI), in cui il cancro cellule proliferano e migrano nel microambiente del nervo. Questo tipo di invasione è esposto da una varietà di tipi di cancro e molto spesso è trovato nel cancro del pancreas. Le dimensioni microscopiche di fibre nervose all'interno del pancreas del mouse rende difficile in modelli murini di orthotopic lo studio del PNI. Qui, descriviamo un modello heterotopic in vivo di PNI, dove iniettiamo la linea cellulare di cancro del pancreas syngeneic Panc02-H7 nel nervo sciatico murino. In questo modello, nervi sciatici dei topi anestetizzati sono esposti e iniettati con le cellule tumorali. Le cellule tumorali invadono nei nervi prossimalmente verso il midollo spinale dal punto di iniezione. Il nervo sciatico invaso vengono poi estratti e trattato con OCT per sezionamento congelati. H & E e colorazione di immunofluorescenza di queste sezioni permettono di quantificazione di entrambi il grado di invasione e cambiamenti nell'espressione della proteina. Questo modello può essere applicato ad una varietà di studi su PNI data la sua versatilità. Utilizzando topi con diverse modificazioni genetiche e/o diversi tipi di cellule tumorali permette di indagine dei meccanismi cellulari e molecolari di PNI e per diversi tipi di cancro. Inoltre, gli effetti di agenti terapeutici sulla invasione del nervo possono essere studiati mediante l'applicazione di trattamento a questi topi.

Questo metodo viene descritto l'impianto chirurgico di cellule di cancro al pancreas nel nervo sciatico murino per creare un modello in vivo di invasione del nervo quantificabili. La figura 1 illustra la posizione anatomica del nervo sciatico e il sito di iniezione. La figura 2 Mostra i due nervi sciatici di un topo nudo. Un nervo di PBS iniettato (a sinistra) può essere paragonato ad un nervo iniettato con cellule tum...

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An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Un modello In Vivo murino nervo sciatico di invasione perineurale

Descriviamo un modello murino in vivo di invasione perineurale iniettando le cellule tumorali pancreatiche syngeneic nel nervo sciatico. Il modello consente per la quantificazione del grado di invasione del nervo e appoggia la indagine dei meccanismi cellulari e molecolari dell'invasione perineurale.

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

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