Name: an in vivo murine sciatic nerve model of perineural invasion
Uploaded: 2018-04-23T13:00:00
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Os autores reconhecem os serviços técnicos fornecidos pelo centro de citologia molecular e a facilidade de animais do Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Este trabalho foi financiado por doações de NIH CA157686 (para R.J. Wong) e P30 CA008748 (concessão de apoio do Memorial Sloan Kettering Cancer Center).

Todos os procedimentos com animais sujeitos foram aprovados pelo Comitê de uso no Memorial Sloan Kettering Cancer Center e institucional Cuidado Animal.
1. preparação das pilhas de Cancer
<ol><li>Colheita sub Panc02-H7 confluentes com tripsina 0,25% por 5 min a 37 ° C. Colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mL. Nota: As células são cultivadas em frasco de T-225, que contém cerca de 12 x 106 células por balão na confluência de 80% e tripsina de 4 mL / frasc...

<ol>
	<li>Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+in+cancer.">Perineural invasion in cancer.</a> Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).</li><li>Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+and+associated+pain+in+pancreatic+cancer.">Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer.</a> Nat Rev Cancer. 11 (10), 695-707 (2011).</li><li>Deborde, S., Wong, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Schwann+cells+facilitate+cancer+progression+in+nerves.">How Schwann cells facilitate cancer progression in nerves.</a> Cell Mol Life Sci. 341 (177-186), 1236361-1236416 (2017).</li><li>Abiatari, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+transcriptome+signature+of+perineural+invasion+in+pancreatic+carcinoma.">Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma.</a> Mol Cancer Ther. 8 (6), 1494-1504 (2009).</li><li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+dorsal+root+ganglia+and+human+prostate+cell+line+interaction:+redefining+perineural+invasion+in+prostate+cancer.">In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer.</a> Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).</li><li>Gil, Z., Cavel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+pancreatic+cancer+cell+invasion+by+peripheral+nerves.">Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves.</a> J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).</li><li>Deborde, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+induce+cancer+cell+dispersion+and+invasion.">Schwann cells induce cancer cell dispersion and invasion.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1538-1554 (2016).</li><li>Pour, P. M., Egami, H., Takiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+growth+and+metastases+of+induced+pancreatic+cancer+in+relation+to+the+prognosis+and+its+clinical+implications.">Patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implications.</a> Gastroenterology. 100 (2), 529-536 (1991).</li><li>Eibl, G., Reber, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+nude+mouse+model+for+perineural+invasion+and+recurrence+in+pancreatic+cancer.">A xenograft nude mouse model for perineural invasion and recurrence in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 31 (3), 258-262 (2005).</li><li>Stopczynski, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroplastic+changes+occur+early+in+the+development+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Res. 74 (6), 1718-1727 (2014).</li><li>Gil, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-sparing+therapy+with+oncolytic+herpes+virus+for+cancers+with+neural+invasion.">Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion.</a> Clin Cancer Res. 13 (21), 6479-6485 (2007).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Cremer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+N-CAM+gene+in+mice+results+in+size+reduction+of+the+olfactory+bulb+and+deficits+in+spatial+learning.">Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning.</a> Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+(CCL2-CCR2)+signaling+axis+mediates+perineural+invasion.">The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion.</a> Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFR&#945;1+released+by+nerves+enhances+cancer+cell+perineural+invasion+through+GDNF-RET+signaling.">GFR&#945;1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling.</a> P Natl Acad Sci USA. , 02944 (2014).</li></ol>

Neste protocolo, descrevemos no vivo modelo murino de invasão perineural que permite a quantificação da invasão do nervo ciático por células de câncer pancreático. Este modelo permite o estudo dos mecanismos moleculares da invasão de nervo. Usando esta técnica de experiências bem sucedidas requerem uma abordagem cuidadosa para três passos críticos no processo: 1) a injeção de células cancerosas (etapas 2.7, 2.8), 2) a extração dos nervos invadiram (passo 3.4) e 3) processamento dos nervos colhi...

Os nervos formam um microambiente do tumor específico que estimula o câncer crescimento e migração1,2,3. Invasão perineural (PNI) é o processo através do qual câncer células invadem em e ao redor dos nervos. Pode ser considerado como uma única rota de metástase desde a invasão do câncer estende longe dos locais de origem, ao longo de nervos. PNI é encontrado em vários tipos de câncer, incluindo pâncreas, próstata, cabeça & pescoço, salivar, cervical e cancros colo-rectais com uma incidência variando de 22% a 100%1,2. PNI está associado com dor e se correlaciona com o prognóstico pobre e pior sobrevivência taxas1,2.
Desenvolvimento de modelos de invasão perineural é essencial para elucidar os mecanismos celulares e moleculares deste processo e para testar agentes terapêuticos candidato para diminuir o PNI. Métodos in vitro de estudar as interações entre cânceres e nervos incluem a co-cultura de células de câncer com nervo explantes4, com raízes dorsais gânglios5,6,7ou com células específicas do nervo microambiente como Schwann células7. Abordagens na vivo , no entanto, são mais fisiologicamente relevantes, incluem o uso de modelos de rato de câncer no qual câncer foi induzido ou transplantado e têm a vantagem de contabilidade para o microambiente todo nervo. Em ortotópico modelos de câncer pancreático ou da próstata, PNI tem sido relatado8,9,10 e a incidência de PNI pode ser gravada, mas por causa do pequeno tamanho dos nervos nesses órgãos, é difícil ver a lata inteira e, por conseguinte, para quantificar a extensão do PNI. O modelo que nós descrevemos aqui é um modelo em vivo do PNI no qual câncer células são injetadas para o nervo ciático de ratos através de um procedimento cirúrgico simples11. O transplante heterotópico invade dentro do nervo em direção a medula espinhal. O comprimento da invasão nervo do local da injeção da medula espinhal pode ser medido, bem como o volume do câncer dentro do nervo. Importante, o nervo invadiram também pode ser coletado para uma variedade de ensaios, incluindo análises microscópicas e moleculares. Uma variedade de células de câncer pode ser testada, e os ratos de anfitrião que tenham sido geneticamente modificados ou tratados com compostos específicos podem ser usados também. Este ensaio poderoso permite que as células cancerosas e o microambiente de acolhimento ser modificado para a investigação sobre os mecanismos de PNI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:973px;" width="973">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Mouse</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">Number and age variable depending on experimental needs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Steps 1.1, 1.2, 1.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C-S</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electric razor</td>
			<td>WAHL</td>
			<td>9962</td>
			<td>Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane, 250 mL</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936060</td>
			<td>Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hypoallergenic surgical tape</td>
			<td>3M Blenderm</td>
			<td>70200419342</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Betadine Swapsticks</td>
			<td>PDI</td>
			<td>SKU 41350</td>
			<td>Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Webcol Alcohol Preps</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile surgical tools (scissors and forceps)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10 &#956;L Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80308</td>
			<td>Steps 2.7, 2.8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Steel Micro spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S50823</td>
			<td>Step 2.7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2.7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacine, 1 g</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-NA139-0001</td>
			<td>Step 2.9. Reconstitute to 0.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5-0 Nylon suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>698H</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue-Tek Cryomold Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-916</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo murine sciatic nerve model of perineural invasion

As células cancerosas invadem os nervos através de um processo denominado invasão perineural (PNI), na qual câncer células proliferaram em migram no microambiente do nervo. Este tipo de invasão é exibido por uma variedade de tipos de câncer e muito frequentemente é encontrado no cancer pancreatic. O tamanho microscópico das fibras nervosas dentro de pâncreas de rato processa o estudo de PNI difícil em modelos murino ortotópico. Aqui, descrevemos um modelo heterotópica na vivo do PNI, onde nós injetamos a linhagem de células de câncer pancreático syngeneic Panc02-H7 em nervo ciático murino. Neste modelo, os nervos ciático de ratos anestesiados são expostos e injetados com células cancerosas. As células cancerosas invadem nos nervos proximalmente em direção a medula espinhal, do ponto de injeção. Os nervos ciático invadiram então são extraídos e processados com OCT para secionar congelado. H & E e mancha da imunofluorescência dessas seções permitem a quantificação de ambos o grau de invasão e alterações na expressão da proteína. Este modelo pode ser aplicado a uma variedade de estudos sobre o PNI, dada a sua versatilidade. Usar ratos com modificações genéticas diferentes e/ou diferentes tipos de células cancerosas permite para investigação dos mecanismos celulares e moleculares do PNI e para tipos diferentes de câncer. Além disso, os efeitos de agentes terapêuticos na invasão do nervo podem ser estudados através da aplicação de tratamento para estes ratos.

Este método descreve a implantação cirúrgica de células de câncer pancreático em nervo ciático murino para criar um modelo in vivo da invasão de nervo quantificáveis. A Figura 1 ilustra a localização anatômica do nervo ciático e o local da injeção. A Figura 2 mostra os dois nervos ciático de um rato nude. Um nervo de PBS injetado (à esquerda) pode ser comparado a um nervo injetado com células de cânc...

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An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Um modelo murino de nervo ciático na Vivo de invasão Perineural

Descrevemos no vivo modelo murino de invasão perineural injetando células de câncer pancreático syngeneic no nervo ciático. O modelo permite a quantificação da extensão da invasão do nervo e apoia a investigação dos mecanismos celulares e moleculares de invasão perineural.

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

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Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

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