Name: an in vivo murine sciatic nerve model of perineural invasion
Uploaded: 2018-04-23T13:00:00
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Los autores reconocen los servicios técnicos prestados por la citología molecular y el animal del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH CA157686 (a R.J. Wong) y P30 CA008748 (beca de apoyo del Memorial Sloan Kettering Cancer Center).

Todos los procedimientos con animales sujetos fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso en el Memorial Sloan Kettering Cancer Center.
1. preparación de las células cancerosas
<ol><li>Cosecha el confluente Panc02 H7 células con tripsina 0.25% por 5 min a 37 ° C. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 mL. Nota: Las células se cultivan en frasco T-225, que contiene aproximadamente 12 x 106 células cada frasco en la confluencia del 80% y 4 mL...

<ol>
	<li>Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+in+cancer.">Perineural invasion in cancer.</a> Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).</li><li>Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+and+associated+pain+in+pancreatic+cancer.">Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer.</a> Nat Rev Cancer. 11 (10), 695-707 (2011).</li><li>Deborde, S., Wong, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Schwann+cells+facilitate+cancer+progression+in+nerves.">How Schwann cells facilitate cancer progression in nerves.</a> Cell Mol Life Sci. 341 (177-186), 1236361-1236416 (2017).</li><li>Abiatari, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+transcriptome+signature+of+perineural+invasion+in+pancreatic+carcinoma.">Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma.</a> Mol Cancer Ther. 8 (6), 1494-1504 (2009).</li><li>Ayala, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+dorsal+root+ganglia+and+human+prostate+cell+line+interaction:+redefining+perineural+invasion+in+prostate+cancer.">In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer.</a> Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).</li><li>Gil, Z., Cavel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+pancreatic+cancer+cell+invasion+by+peripheral+nerves.">Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves.</a> J Natl Cancer Inst. 102 (2), 107-118 (2010).</li><li>Deborde, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+induce+cancer+cell+dispersion+and+invasion.">Schwann cells induce cancer cell dispersion and invasion.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1538-1554 (2016).</li><li>Pour, P. M., Egami, H., Takiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+growth+and+metastases+of+induced+pancreatic+cancer+in+relation+to+the+prognosis+and+its+clinical+implications.">Patterns of growth and metastases of induced pancreatic cancer in relation to the prognosis and its clinical implications.</a> Gastroenterology. 100 (2), 529-536 (1991).</li><li>Eibl, G., Reber, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xenograft+nude+mouse+model+for+perineural+invasion+and+recurrence+in+pancreatic+cancer.">A xenograft nude mouse model for perineural invasion and recurrence in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 31 (3), 258-262 (2005).</li><li>Stopczynski, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroplastic+changes+occur+early+in+the+development+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Neuroplastic changes occur early in the development of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer Res. 74 (6), 1718-1727 (2014).</li><li>Gil, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve-sparing+therapy+with+oncolytic+herpes+virus+for+cancers+with+neural+invasion.">Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion.</a> Clin Cancer Res. 13 (21), 6479-6485 (2007).</li><li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections.">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).</li><li>Cremer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+N-CAM+gene+in+mice+results+in+size+reduction+of+the+olfactory+bulb+and+deficits+in+spatial+learning.">Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning.</a> Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+(CCL2-CCR2)+signaling+axis+mediates+perineural+invasion.">The chemokine (CCL2-CCR2) signaling axis mediates perineural invasion.</a> Mol Cancer Res. 13 (2), 380-390 (2015).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFR&#945;1+released+by+nerves+enhances+cancer+cell+perineural+invasion+through+GDNF-RET+signaling.">GFR&#945;1 released by nerves enhances cancer cell perineural invasion through GDNF-RET signaling.</a> P Natl Acad Sci USA. , 02944 (2014).</li></ol>

En este protocolo se describe un modelo murino en vivo de la invasión perineural que permite la cuantificación de la invasión del nervio ciático por las células de cáncer de páncreas. Este modelo permite el estudio de mecanismos moleculares de la invasión del nervio. Experimentos exitosos con esta técnica requieren un cuidadoso enfoque a tres pasos críticos en el proceso de: 1) la inyección de las células cancerosas (pasos 2.7, 2.8), 2) la extracción de nervios invadidos (paso 3.4) y 3) procesamient...

Los nervios forman un microambiente tumoral específica que estimula cáncer crecimiento y migración1,2,3. La invasión perineural (PNI) es el proceso a través del cual cáncer células invaden en y alrededor de los nervios. Puede considerarse como una única vía de metástasis ya que invasión de cáncer se extiende a los sitios de origen a lo largo de los nervios. PNI se encuentra en varios tipos de cáncer incluyendo páncreas, próstata, cabeza y cuello, salival, cervical y cáncer colorrectal con una incidencia que van desde 22% a 100%1,2. PNI es asociado con dolor y se correlaciona con mal pronóstico y peor supervivencia tarifas1,2.
Desarrollando modelos de invasión perineural es esencial para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares de este proceso y a prueba de agentes terapéuticos candidato para disminuir PNI. In vitro métodos de estudio de las interacciones entre los cánceres y los nervios son el cocultivo de las células cancerosas con nervio explantes4, raíz dorsal ganglios5,6,7o con células específicas del nervio microambiente como Schwann las células7. Métodos in vivo , sin embargo, son más fisiológicamente relevantes, incluyen el uso de modelos de ratón de cáncer que el cáncer ha sido inducido o trasplantado y tienen la ventaja de la contabilidad para el microambiente entero del nervio. En orthotopic del modelos de cáncer de páncreas o próstata, PNI ha sido reportados8,9,10 y puede registrar la incidencia de la PNI, pero debido al pequeño tamaño de los nervios en los órganos, es difícil ver el nervio todo y por lo tanto, para cuantificar el grado de PNI. El modelo que se describe aquí es un modelo en vivo de PNI en que el cáncer de las células se inyectan en el nervio ciático de los ratones a través de una sencilla intervención quirúrgica11. El trasplante heterotópico invade dentro del nervio hacia la médula espinal. Puede medirse la longitud de la invasión del nervio desde el sitio de inyección en la médula espinal, así como el volumen del cáncer dentro del nervio. Lo importante es el nervio invadido también puede recogerse para una variedad de análisis incluyendo análisis microscópicos y moleculares. Una variedad de células de cáncer puede ser probada, y los ratones de host que han modificado genéticamente o tratados con compuestos específicos pueden utilizarse también. Este ensayo potente permite a las células cancerosas y el microambiente de host modificado para la investigación en los mecanismos de PNI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:973px;" width="973">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Mouse</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">Number and age variable depending on experimental needs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Steps 1.1, 1.2, 1.3.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td>Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C-S</td>
			<td>Step 1.2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electric razor</td>
			<td>WAHL</td>
			<td>9962</td>
			<td>Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane, 250 mL</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>1001936060</td>
			<td>Step 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hypoallergenic surgical tape</td>
			<td>3M Blenderm</td>
			<td>70200419342</td>
			<td>Step 2.3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Betadine Swapsticks</td>
			<td>PDI</td>
			<td>SKU 41350</td>
			<td>Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Webcol Alcohol Preps</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>5110</td>
			<td>Step 2.4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile surgical tools (scissors and forceps)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10 &#956;L Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80308</td>
			<td>Steps 2.7, 2.8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Steel Micro spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S50823</td>
			<td>Step 2.7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 2.7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bupivacine, 1 g</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-NA139-0001</td>
			<td>Step 2.9. Reconstitute to 0.5%</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5-0 Nylon suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>698H</td>
			<td>Step 2.9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tissue-Tek Cryomold Molds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-916</td>
			<td>Step 4.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo murine sciatic nerve model of perineural invasion

Las células cancerosas invaden los nervios a través de un proceso denominado la invasión perineural (PNI), en que el cáncer de las células proliferan y migran en el microambiente del nervio. Este tipo de invasión es exhibido por una variedad de tipos de cáncer y se encuentra muy frecuentemente en el cáncer de páncreas. El tamaño microscópico de fibras nerviosas en páncreas de ratón hace que el estudio de PNI difícil en modelos murinos de orthotopic. Aquí, describimos un modelo de heterotopic en vivo de PNI, donde inyectamos la línea celular de cáncer de páncreas syngeneic Panc02-H7 en el nervio ciático murino. En este modelo, nervios ciáticos de ratones anestesiados son expuestos e inyectados con las células cancerosas. Las células cancerosas invaden en los nervios proximalmente hacia la médula espinal desde el punto de inyección. Los nervios ciáticos invadidos entonces son extraídos y procesados con OCT para secciones congeladas. H & E y tinción de inmunofluorescencia de estas secciones permiten la cuantificación del grado de invasión y los cambios en la expresión de la proteína. Este modelo puede aplicarse a una variedad de estudios sobre PNI dada su versatilidad. Usando ratones con modificaciones genéticas diferentes o diferentes tipos de células cancerosas permite para la investigación de los mecanismos celulares y moleculares de la PNI y para tipos de cáncer diferentes. Además, los efectos de agentes terapéuticos en la invasión del nervio pueden ser estudiados mediante la aplicación de tratamiento a estos ratones.

Este método describe la implantación quirúrgica de las células de cáncer de páncreas en el nervio ciático murino para crear un modelo en vivo de invasión del nervio cuantificables. La figura 1 muestra la localización anatómica del nervio ciático y el sitio de inyección. La figura 2 muestra los dos nervios ciático de un ratón desnudo. Un nervio de PBS inyectado (izquierda) puede ser comparado con un nervio ...

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An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

Un modelo de nervio ciático murinos In Vivo de invasión Perineural

Describimos un modelo murino en vivo de invasión perineural por células de cáncer pancreático syngeneic de inyección en el nervio ciático. El modelo permite la cuantificación del grado de invasión del nervio y apoya la investigación de los mecanismos celulares y moleculares de la invasión perineural.

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

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Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion

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Investigación

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