Name: an engineered split-tet2 enzyme for chemical-inducible dna hydroxymethylation and epigenetic remodeling
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00
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Nous remercions le financier prend en charge de la National Institutes of Health accorde (R01GM112003 à YZ), la Fondation Welch (BE-1913 à YZ), l’American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE à YZ), la prévention du Cancer et Research Institute of Texas (RR140053 à YH, RP170660 à YZ), l’American Heart Association (16IRG27250155 à YH) et le programme de prix de recherche en collaboration de fondation de John S. Dunn.

1. Culture, Transfection de plasmide et Induction chimique des cellules
<ol>
	<li>Culture d’une lignée de cellules adhérentes (p. ex., l’embryonnaire rein humain cellules HEK293T) au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), additionnée de 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine à 37 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Transfecter les cellules avec le plasmide de cidre.
	<ol>
		<li>Au moins 18 heures avant la transfection,...

<ol>
	<li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+mammals.">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine.">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li><li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+readers+for+5-(hydroxy)methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives.">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li><li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility.">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290 (2016).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites.">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li><li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer.">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li><li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET+family+proteins:+oxidation+activity,+interacting+molecules,+and+functions+in+diseases.">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li><li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA.">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity.">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li><li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences.">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling.">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li><li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Mart&#237;nez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine.">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li></ol>

Ici, nous avons illustré l’utilisation d’une enzyme machiné split-TET2 pour obtenir un contrôle temporel des hydroxymethylation de l’ADN. Après la découverte de la famille TET de 5-methycytosine dioxygénase, de nombreuses études ont été réalisées à déchiffrer la fonction biologique des protéines TET et leur principal produit catalytique 5hmC1,2,3, 4,<sup class="x...

Méthylation de l’ADN, pour la plupart fait référence à l’ajout d’un groupe de méthyle à la position du carbone 5 de cytosine pour former 5-méthylcytosine (5mC), est catalysée par l’ADN méthyl-transférase (DNMTs). 5MC agit comme une marque épigénétique majeure dans le génome de mammifères qui signale souvent pour répression transcriptionnelle, inactivation du chromosome x et transposon silencieux1. Le renversement de la méthylation de l’ADN est médié par la famille de protéine de translocation (TET) dix-elven. Enzymes de TET appartiennent au fer (II) et 2-oxoglutarate dioxygénases dépendants qui catalysent l’oxydation successifs de 5mC 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxycytosine (5caC). TET-mediated 5mC oxydation impose une couche supplémentaire de contrôle épigénétique sur le génome des mammifères. La découverte de TET a suscité l’intérêt intense dans le domaine épigénétique pour dévoiler les fonctions biologiques des protéines TET et leur principal produit catalytique 5hmC. 5hmC n’est pas seulement un intermédiaire durant la médiation TET active ADN déméthylation2,3,4, mais aussi agit comme une écurie épigénétique marque5,6,7,8 . ADN hydroxymethylation est fortement corrélé avec l’expression des gènes et aberrante dans ADN hydroxymethylation est associée à certaines maladies humaines9,10,11, les relations de cause à effet entre des modifications épigénétiques sur l’ADN et les phénotypes restent souvent difficiles à établir, qui peut être partiellement attribué à l’absence d’outil fiable pour ajouter ou supprimer des modifications de l’ADN dans le génome à adéquatement défini temporelle et spatiale résolution.
Nous rapportons ici l’utilisation d’un chimique-inducible épigénome remodelage outil (cidre) à surmonter l’obstacle face à des études de relations causales entre hydroxymethylation et gène transcription de l’ADN. La conception est basée sur l’hypothèse que le domaine catalytique de TET2 (TET2CD) peut se scinder en deux fragments inactifs lorsqu’elle est exprimée dans les cellules de mammifères et sa fonction enzymatique peut être reconstituée en adoptant une approche de dimérisation chimiquement inductible ( Figure 1 a). Pour mettre en place un système de split-TET2CD, nous avons sélectionné six sites dans TET2CD, composé d’une région riche en Cys et un pli double brin β-hélice (DSBH), sur la base d’une structure en cristal rapportés du complexe ADN-TET2 qui ne dispose pas d’une région de faible complexité12. Un gène synthétique codant la protéine inductible par la rapamycine dimérisation module FK506 12 (FKBP12) et domaine de liaison de la rapamycine FKBP (FRB) de la cible mammalienne de rapamycine14,15, ainsi que d’un peptide Self clivage T2A polypeptide séquence16,17, a été individuellement insérés dans les sites sélectionnés split dans TET2CD. La sélection de TET2 que notre objectif de génie est basée sur les considérations suivantes. Premières mutations somatiques dans TET2 avec réduction concomitante dans hydroxymethylation de l’ADN sont fréquemment observées dans les maladies humaines, y compris les troubles myéloïdes et cancer10, qui fournit des informations utiles sur les sites sensibles à éviter pour insertion. Deuxièmement, une fraction importante du domaine catalytique TET2, plus particulièrement la région de faible complexité, est indispensable pour la fonction enzymatique12, afin que nous puissions concevoir un split-TET2 réduite pour les modifications épigénétiques inductibles. Après le dépistage des constructions de plus de 15, une construction qui expose plus haute restauration rapamycine inductible de l’activité enzymatique dans le système des mammifères a été choisie et désignée comme cidre18. Nous décrivons ici l’usage du cidre mCherry-tag pour atteindre inductible ADN hydroxymethylation et remodelage épigénétique avec la rapamycine et présenter trois méthodes pour valider la production induite par le cidre 5hmC dans un système cellulaire de modèle HEK293T.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0694-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0369-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb)</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L)</td>
			<td>SHEL LAB</td>
			<td>SVAC1E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SSC, 20X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot Apparatus</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td>
			<td>Gendepot</td>
			<td>W3653-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engineered split-tet2 enzyme for chemical-inducible dna hydroxymethylation and epigenetic remodeling

Méthylation de l’ADN est une modification épigénétique stable et héréditaire dans le génome de mammifères et est impliquée dans la régulation de l’expression des gènes pour contrôler les fonctions cellulaires. Le renversement de la méthylation de l’ADN, ou la déméthylation de l’ADN, est véhiculé par la famille de protéine de translocation (TET) de dix-onze de dioxygénases. Bien qu’il a été largement rapporté qu’aberrante de méthylation de l’ADN et de déméthylation sont associés à des anomalies du développement et cancer, comment ces changements épigénétiques contribuent directement à l’altération ultérieure dans la progression expression ou d’une maladie génétique reste floue, en grande partie en raison du manque d’outils fiables pour ajouter ou supprimer les modifications de l’ADN dans le génome à une résolution spatiale et temporelle définie adéquatement. Pour surmonter cet obstacle, nous avons conçu une enzyme split-TET2 pour permettre le contrôle temporel de l’oxydation de la 5-méthylcytosine (5mC) et retouche ultérieure des États épigénétiques dans les cellules de mammifères en ajoutant simplement des produits chimiques. Nous décrivons ici les méthodes pour introduire un outil de retouche épigénome chimique-inductible (cidre), basé sur une enzyme machiné split-TET2, dans les cellules de mammifères et de quantifier la production inductible chimique de 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) avec immunomarquage, cytométrie en flux ou un dosage de dot-blot. Cet outil de retouche épigénome chimique-inducible trouverez large utilisation en interrogeant les systèmes cellulaires sans modifier le code génétique, ainsi que dans la détection des relations epigenotype−phenotype dans les systèmes biologiques différents.

Conversion chimique de 5mC-à-5hmC inductible peut être validée par immunohistochimie au niveau de single-cell, analyse en cytométrie en flux sur les populations de cellules transfectées de (mCherry-positif) ou une épreuve plus quantitative de buvardage tel qu’illustré à la Figure 1. Le domaine catalytique de la TET2, ou TET2CD, ont été utilisés tout au long de l’étude comme témoin positif. Voir les références 18-20 pour plus amples renseign...

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An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Une Enzyme machiné Split-TET2 pour Hydroxymethylation inductible par produit chimique de l’ADN et le remodelage épigénétique

Des protocoles détaillés pour introduire une enzyme machiné split-TET2 (cidre) dans des cellules de mammifères pour hydroxymethylation chimique d’ADN inductible et remodelage épigénétique sont présentés.

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

L&#39;état d&#39;équilibre des mesures cinétiques, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d&#39;affaires de l&#39;activité de ADNglycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Recherche

Chimie

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