Name: an engineered split-tet2 enzyme for chemical-inducible dna hydroxymethylation and epigenetic remodeling
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00
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Ringraziamo la finanziaria concedono supporti dai National Institutes of Health (R01GM112003 a YZ), la Fondazione di Welch (BE-1913-YZ), l'American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE per YZ), la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas (RR140053 a YH, RP170660 a YZ), associazione americana del cuore (16IRG27250155 a YH) e il programma di premio di ricerca collaborativa Fondazione John S. Dunn.

1. cultura, plasmide transfezione e induzione chimica delle cellule
<ol>
	<li>Cultura una linea cellulare aderente (ad es., il rene embrionale umano delle cellule HEK293T) nel mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM), completata con 10% inattivati siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e streptomicina a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Transfect cellule con il plasmide di sidro.
	<ol>
		<li>Almeno 18 h prima di transfezione, seme 0,3 x 106 cellule in 2,5 mL di DMEM appro...

<ol>
	<li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+mammals.">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine.">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li><li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+readers+for+5-(hydroxy)methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives.">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li><li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility.">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290 (2016).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites.">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li><li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer.">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li><li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET+family+proteins:+oxidation+activity,+interacting+molecules,+and+functions+in+diseases.">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li><li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA.">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity.">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li><li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences.">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling.">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li><li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Mart&#237;nez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine.">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li></ol>

Qui abbiamo illustrato l'uso di un enzima di Spalato-TET2 derivati dal raggiungere il controllo temporale del DNA hydroxymethylation. Dopo la scoperta della famiglia di TET di 5-methycytosine diossigenasi, molti studi sono stati effettuati per decifrare le funzioni biologiche delle proteine TET e loro principali prodotto catalitica 5hmC1,2,3, 4,5,<...

Metilazione del DNA, per lo più l'aggiunta di un gruppo metile in posizione del carbonio 5 della citosina per formare la 5-metilcitosina (5mC) si riferisce, è catalizzata dalla DNA metil-transferasi (DNMTs). 5mc agisce come un segno importante epigenetico nel genoma dei mammiferi che spesso i segnali per la repressione trascrizionale, inattivazione del cromosoma x e trasposoni silenziamento1. L'inversione di metilazione del DNA è mediata dalla famiglia delle proteine di traslocazione (TET) Ten-elfico. Gli enzimi TET appartengono al ferro (II) e 2-ossoglutarato dipendenti diossigenasi che catalizzano l'ossidazione successivo di 5mC 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxycytosine (5caC). TET-mediata 5mC ossidazione impone un ulteriore livello di controllo epigenetico sopra il genoma dei mammiferi. La scoperta del TET ha suscitato interesse intenso nel campo epigenetico di svelare le funzioni biologiche delle proteine TET e loro 5hmC catalitica dei principali prodotti. 5hmC non è solo un intermedio durante il TET-mediata attivo DNA demetilazione2,3,4, ma anche atti come stalla epigenetica mark5,6,7,8 . Anche se hydroxymethylation del DNA è altamente correlato con l'espressione genica e aberrante cambiamenti nel DNA hydroxymethylation sono associati con alcuni disordini umani9,10,11, i rapporti di causalità tra le modifiche epigenetiche sul DNA e i fenotipi rimangono spesso difficile da stabilire, che può essere parzialmente attribuita alla mancanza di strumento affidabile con precisione aggiungere o rimuovere modifiche del DNA nel genoma presso definito temporale e spaziale ad alta risoluzione.
Qui segnaliamo l'uso di una prodotto chimico-inducible epigenome rimodellamento strumento (sidro) per superare l'ostacolo di fronte gli studi delle relazioni causali tra trascrizione del DNA hydroxymethylation e gene. Il design è basato sul presupposto che il dominio catalitico di TET2 (TET2CD) può essere diviso in due frammenti inattivi quando espresso in cellule di mammifero e sua funzione enzimatica può essere ripristinato attraverso un approccio di dimerizzazione chimicamente inducibile ( Figura 1A). Per stabilire un sistema di Spalato-TET2CD, abbiamo selezionato sei siti in TET2CD, composto di una regione ricca di Cys e una piega doppia elica β-elica (DSBH), sulla base di una struttura di cristallo segnalati di TET2-DNA complesso che manca di una regione di bassa complessità12. Un gene sintetico che codifica la proteina rapamicina-inducible dimerizzazione modulo FK506 12 (FKBP12) e dominio di legame di rapamicina FKBP (FRB) dell'obiettivo mammifero della rapamicina14,15, insieme a un peptide self-che fende T2A polipeptide sequenza16,17, singolarmente è stato inserito nei siti selezionati di Spalato all'interno di TET2CD. La selezione di TET2 come nostro obiettivo engineering si basa sulle seguenti considerazioni. Mutazioni somatiche, prime TET2 con concomitante riduzione del DNA hydroxymethylation sono osservate frequentemente in disordini umani tra cui disordini mieloidi e cancro10, che fornisce informazioni utili su siti sensibili deve essere evitato per inserimento. In secondo luogo, non una grande frazione di TET2 dominio catalitico, specialmente la regione di bassa complessità, è indispensabile per la funzione enzimatica12, consentendoci così di una split-TET2 minimizzato per modificazioni epigenetiche viscoelastiche del mestiere. Dopo lo screening oltre 15 costrutti, un costrutto che ha esibito più alto rapamicina-inducible restauro della sua attività enzimatica nel sistema mammifero è stato scelto e designato come sidro18. Qui descriviamo l'uso di sidro mCherry-etichetta per raggiungere viscoelastica DNA hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico con rapamicina e presentiamo tre metodi per la convalida di produzione 5hmC sidro-mediata in un sistema cellulare modello HEK293T.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0694-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0369-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb)</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L)</td>
			<td>SHEL LAB</td>
			<td>SVAC1E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SSC, 20X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot Apparatus</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td>
			<td>Gendepot</td>
			<td>W3653-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engineered split-tet2 enzyme for chemical-inducible dna hydroxymethylation and epigenetic remodeling

Metilazione del DNA è una modificazione epigenetica stabile ed ereditabile nel genoma dei mammiferi ed è coinvolta nella regolazione dell'espressione genica per controllare funzioni cellulari. L'inversione di metilazione del DNA, o demetilazione del DNA, è mediato dalla famiglia dieci-undici traslocazione (TET) proteina di diossigenasi. Anche se ampiamente è stato segnalato che aberrante metilazione del DNA e demetilazione sono associati con il cancro e difetti inerenti allo sviluppo, come questi cambiamenti epigenetici direttamente contribuiscano a successive modifiche in progressione di malattia o di espressione di gene rimane poco chiaro, in gran parte a causa della mancanza di strumenti affidabili accuratamente aggiungere o rimuovere modifiche del DNA nel genoma a risoluzione temporale e spaziale definita. Per superare questo ostacolo, abbiamo progettato un enzima di Spalato-TET2 per abilitare il controllo temporale della 5-metilcitosina (5mC) ossidazione e successivo rimodellamento degli Stati epigenetici in cellule di mammifero semplicemente aggiungendo sostanze chimiche. Qui, descriviamo i metodi per l'introduzione di uno strumento di ritocco epigenome chimico-inducibile (sidro), basato su un enzima derivati dal Spalato-TET2, in cellule di mammifero e quantificare la produzione chimica inducibile di 5-idrossimetilcitosina (5hmC) con immunostaining, citometria a flusso o un'analisi della macchia del puntino. Questo strumento di ritocco del chimico-inducible epigenome troveranno ampio uso in sistemi cellulari di interrogare senza alterare il codice genetico, così come nel sondaggio i rapporti di epigenotype−phenotype in vari sistemi biologici.

Conversione di 5mC-a-5hmC inducibile chimica può essere convalidato da immunostaining a livello di singola cellula, analisi di citometria a flusso su popolazioni cellulari trasfettate (mCherry-positivo) o un'analisi più quantitativa di macchia del puntino come illustrato nella Figura 1. Il dominio catalitico di TET2, o TET2CD, sono stati utilizzati in tutto lo studio come controllo positivo. Vedere riferimenti 18-20 per maggiori dettagli riguardo la mappatu...

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An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Un enzima Split-TET2 ingegnerizzati per chimica-inducible DNA Hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico

Protocolli dettagliati per l'introduzione di un enzima derivati dal Spalato-TET2 (sidro) nelle cellule di mammiferi per chimica viscoelastica DNA hydroxymethylation e rimodellamento epigenetici sono presentati.

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

Research

JoVE Journal

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