Name: an engineered split-tet2 enzyme for chemical-inducible dna hydroxymethylation and epigenetic remodeling
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00
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Agradecemos a financeira das sustentações do National Institutes of Health concedem (R01GM112003 para YZ), Fundação Welch (BE-1913 a YZ), a American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE para YZ), a prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas (RR140053 a YH, RP170660 para YZ), a associação americana do coração (16IRG27250155 a YH) e o programa de prêmio de pesquisa colaborativa de fundação de John S. Dunn.

1. cultura, transfeccao Plasmideo e indução química da pilha
<ol>
	<li>Cultura de uma linhagem de células aderentes (por exemplo, o embrionário rim humano HEK293T célula) no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM), suplementada com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 100 U/mL penicilina e estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Transfect células com o plasmídeo de cidra.
	<ol>
		<li>Pelo menos 18 h antes de transfeccao, semente 0.3 x 106 célul...

<ol>
	<li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+mammals.">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine.">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li><li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+readers+for+5-(hydroxy)methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives.">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li><li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility.">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290 (2016).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites.">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li><li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer.">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li><li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET+family+proteins:+oxidation+activity,+interacting+molecules,+and+functions+in+diseases.">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li><li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA.">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity.">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li><li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences.">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling.">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li><li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Mart&#237;nez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine.">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li></ol>

Aqui nós ilustraram o uso de uma enzima de split-TET2 projetado para conseguir o controle temporal de DNA hydroxymethylation. Após a descoberta da família de TET de dioxigenase 5-methycytosine, muitos estudos foram realizados para decifrar as funções biológicas das proteínas de TET e seu principal produto catalítico 5hmC1,2,3, 4,5,<sup clas...

Metilação do DNA, principalmente refere-se a adição de um grupo metil na posição do carbono 5 da citosina para formar 5-metilcitosina (5mC), é catalisada por DNA metil-transferases (DNMTs). 5mC atua como uma marca importante epigenética no genoma de mamíferos que geralmente sinaliza para repressão transcriptional, inativação do cromossomo x e transposon silenciar1. A reversão da metilação do DNA é mediada pela família de proteínas de dez-elven translocação (TET). Enzimas de TET pertencem ao ferro (II) e 2-do oxoglutarate dioxygenases dependente que catalisam a oxidação sucessiva de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxycytosine (5caC). Oxidação mediada por TET 5mC impõe uma camada adicional de controle epigenético do genoma dos mamíferos. A descoberta do TET provocou intenso interesse no campo epigenético para desvendar as funções biológicas das proteínas TET e 5hmC seu produto principal catalítico. 5hmC não é apenas um intermediário durante o TET-mediado ativo DNA desmetilação2,3,4, mas também atua como um estábulo epigenética marca5,6,7,8 . Apesar de hydroxymethylation de DNA é altamente correlacionada com a expressão de gene e aberrante mudanças no DNA hydroxymethylation estão associadas a algumas doenças humanas9,10,11, as relações causais entre as modificações epigenéticas no DNA e os fenótipos frequentemente permanecem um desafio a ser estabelecida, que pode ser parcialmente atribuída à falta de uma ferramenta confiável com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em definido pelo temporal e espacial resolução.
Aqui nós relatamos o uso de um produto químico-inducible Epigenoma remodelar ferramenta (cidra) para superar o obstáculo que enfrentam os estudos de relações causais entre transcrição hydroxymethylation e gene de DNA. O design é baseado no pressuposto de que o domínio catalítico de TET2 (TET2CD) pode ser dividido em dois fragmentos inativos quando expressa em células de mamíferos e sua função enzimática pode ser restaurada por uma abordagem de dimerização quimicamente inducible ( Figura 1A). Para estabelecer um sistema de separação-TET2CD, nós selecionamos seis locais em TET2CD, composto por uma região rica em Cys e uma dobra dupla-hélice β-hélice (DSBH), com base em uma estrutura de cristal relatado do ADN TET2-complexo que carece de uma região de baixa complexidade12. Um sintético gene que codifica a proteína dimerização rapamicina-inducible módulo FK506 12 (FKBP12) e domínio de ligação FKBP rapamicina (FRB) de mamíferos alvo de14,rapamicina15, juntamente com um peptídeo Self chicotado T2A polipeptídeo sequência16,17, individualmente foi inserido em sites selecionados dividido dentro de TET2CD. A seleção de TET2 como nosso alvo engenharia baseia-se as seguintes considerações. Mutações somáticas, primeiras no TET2 com concomitante redução de hydroxymethylation de DNA são frequentemente observadas em doenças humanas incluindo distúrbios mieloides e câncer10, que fornece informações úteis em locais sensíveis deve ser evitada para inserção. Em segundo lugar, uma grande fração do domínio catalítico TET2, particularmente a região de baixa complexidade, é dispensável para a função enzimática12, permitindo assim que um split-TET2 minimizado para modificações epigenéticas inducible do ofício. Após a triagem de mais de 15 construções, uma construção que exibiu maior restauração rapamicina-inducible da sua actividade enzimática no sistema dos mamíferos foi escolhida e designada como cidra18. Neste documento descrevemos o uso de mCherry-tag cidra para alcançar hydroxymethylation de DNA inducible e epigenéticas remodelação com rapamicina e apresentar três métodos para validar a produção 5hmC mediada por cidra em um sistema celular modelo HEK293T.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0694-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0369-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb)</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L)</td>
			<td>SHEL LAB</td>
			<td>SVAC1E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SSC, 20X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot Apparatus</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td>
			<td>Gendepot</td>
			<td>W3653-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engineered split-tet2 enzyme for chemical-inducible dna hydroxymethylation and epigenetic remodeling

Metilação do DNA é uma modificação epigenética estável e hereditária no genoma dos mamíferos e está envolvida na regulação da expressão gênica para controlar funções celulares. A reversão da metilação do DNA, ou demetilação do ADN, é mediada por dez-onze translocação (TET) da proteína da família dos dioxygenases. Embora tem sido amplamente relatado que aberrante a metilação do DNA e a desmetilação estão associadas com câncer e defeitos do desenvolvimento, como estas mudanças epigenéticas contribuem directamente para a subsequente alteração na progressão de doença ou de expressão do gene Ainda não está claro, em grande parte devido à falta de ferramentas confiáveis com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em resolução espacial e temporal definido. Para superar este obstáculo, nós projetamos uma enzima split-TET2 para permitir o controle temporal de oxidação 5-metilcitosina (5mC) e subsequentes a remodelação dos Estados epigenéticos em células de mamíferos simplesmente adicionando produtos químicos. Aqui, descrevemos os métodos para a introdução de uma ferramenta de remodelação químico-inducible Epigenoma (cidra), com base em uma divisão de engenharia-TET2 enzima, em células de mamíferos e quantificar a produção química inducible do 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) com immunostaining, citometria de fluxo ou um ensaio de dot-blot. Esta ferramenta de remodelação Epigenoma químico-inducible encontrará ampla utilização em sistemas celulares a interrogar sem alterar o código genético, bem como na investigação das relações epigenotype−phenotype em diferentes sistemas biológicos.

Conversão de 5mC-para-5hmC inducible química pode ser validado pelo immunostaining em nível de célula única, análise de citometria de fluxo em populações de células transfectadas de (mCherry-positivo) ou um ensaio de dot-blot mais quantitativo, conforme ilustrado na Figura 1. O domínio catalítico de TET2, ou TET2CD, foram utilizados ao longo do estudo como um controle positivo. Consulte referências 18-20 para maiores detalhes sobre o mapeamento de...

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An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

Protocolos detalhados para a introdução de uma enzima de divisão de engenharia-TET2 (cidra) em células de mamíferos para química inducible DNA hydroxymethylation e remodelação epigenéticas são apresentados.

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Steady-state Pré-steady-state, e Single-turnover Medição, Kinetic para DNA glicosilase Atividade

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Química

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Gene-terapia inspirou Polycation revestimento para proteção de nanoestruturas de Origami de DNA

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...