Name: ocular kinematics measured by in vitro stimulation of the cranial nerves in the turtle
Uploaded: 2018-06-02T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle at JoVE.com

लेखक श्रीमती Paulette McKenna और लिसा Pezzino धंयवाद सचिवीय समर्थन के लिए इस अध्ययन में, और तकनीकी सहायता के लिए श्री फिल Auerbach । लेखक भी डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । माइकल एरियल और माइकल एस जोंस (सेंट लुई चिकित्सा विश्वविद्यालय के स्कूल) हमें शुरू करने के लिए इन विट्रो अलग सिर तैयार करने के लिए । इस सहयोग के समर्थन के लिए धन जीवविज्ञान विभाग (रॉबर्ट एस चेस फंड), अकादमिक अनुसंधान समिति, और Lafayette कॉलेज में तंत्रिका विज्ञान कार्यक्रम द्वारा प्रदान किया गया था । अंत में, यह काम श्री फिल Auerbach, जो निधन 28 सितंबर २०१६ को समर्पित है; वह एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप कार्यमुक्त और इस प्रोटोकॉल में उपयोग के लिए अपनी 5 अक्ष चरण की उपयोगिता को मांयता दी । उनकी दोस्ती और उपाय कुशलता बहुत याद किया जाएगा ।

नोट: लाल-कान स्लाइडर कछुए, दोनों पुरुष और महिला, एक विक्रेता से खरीदा गया था । कछुए एक गर्म पशु २ ६०-गैलन sunning के लिए ईंट द्वीपों के साथ २५०-W अवरक्त रोशनी के तहत सुसज्जित टब युक्त सुइट में स्थित थे । पर्यावरण...

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महत्वपूर्ण कदम:
इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम निंनलिखित हैं: 1) विच्छेदन और transected नसों की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए लिया गया ध्यान; 2) कपाल नसों को सक्शन इलेक्ट्रोड द्वारा आकार के मिलान अ...

Electrophysiological प्रयोगों में लाल-कान स्लाइडर कछुए का उपयोग करने के लिए तर्क:
लाल-कान स्लाइडर कछुए (Trachemys scripta एलिगेंस), दुनिया के सबसे आक्रामक प्रजातियों में से एक माना जाता है1 और संकेत मिलता है कि एक पारिस्थितिकी तंत्र मुसीबत में है सकते हैं । कारण है कि लाल कान स्लाइडर कछुए तो सफल रहे है खराब समझ है लेकिन यह भाग में हो सकता है उनके सहिष्णु शरीर क्रिया विज्ञान और तंत्रिका ऊतकों कि hypoxic शर्तों के तहत जीवित रह सकते है के अधिकार के कारण हो2,3,4 . प्रयोग के लिए उनका उपयोग उनकी संख्या को खतरा नहीं है और ंयूनतम प्रयासों के साथ, electrophysiological तैयारी विस्तारित अवधि के दौरान व्यवहार्य रह सकते हैं, के रूप में लंबे समय के रूप में 18 घंटे5,6। लाभ invertebrate जानवरों जैसे बिठाते7, जो भी ऑक्सीजन के निम्न स्तर को झेलने की क्षमता है8के रूप में उपयोग करने का लाभ के समान है ।
नेत्र आंदोलनों को मापने के लिए तकनीक:
सामने आंख आंदोलनों को मापने के दृष्टिकोण-गैर मानव रहनुमाओं का उपयोग कर जानवरों आंखों अच्छी तरह से9विकसित किया गया है । क्षैतिज, ऊर्ध्वाधर, और मरोड़: आंख तीन अक्षों के आसपास की कक्षा में घूमता है । चुंबकीय खोज कुंडल विधि आम तौर पर माना जाता है rotations मापने के लिए सबसे अधिक विश्वसनीय है, लेकिन इनवेसिव, छोटे कुंडल की आवश्यकता के लिए पशुओं के scleras में डाला10,11। वीडियो आधारित प्रणालियों भी घुमाव उपाय कर सकते है और गैर इनवेसिव होने का फायदा है । अभिनव छवि प्रसंस्करण के साथ बेहतर कैमरों के विकास के लिए अपनी कार्यक्षमता में वृद्धि की है वीडियो बनाने आधारित प्रणालियों एक आकर्षक विकल्प के लिए12,13,14पर विचार करें ।
स्तनधारियों में नेत्र आंदोलनों को मापने के लिए विकसित तकनीक बहुत कम महत्वपूर्ण रहा है । उपाय या तो कम संकल्प कर रहे है या केवल घुमाव के कुछ वर्णन15,16,17,18। विकास की कमी को आंशिक रूप से प्रशिक्षण में कठिनाई पर दोषी ठहराया जा सकता है स्तनधारी दृश्य लक्ष्य का पालन करें । हालांकि नेत्र आंदोलनों अच्छी तरह से लाल-कान स्लाइडर कछुओं में अध्ययन किया गया है19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30, क्योंकि लक्ष्य को ट्रैक करने के लिए पशुओं को प्रशिक्षण देने में चुनौती की वजह से उनकी नजर आंदोलनों की सटीक कीनेमेटीक्स खराब हो जाती है समझ.
लाल-कान स्लाइडर कछुए आम तौर पर विचार कर रहे है पार्श्व रीढ़ आंखों, लेकिन क्योंकि वे पूरी तरह से उनके खोल में उनके सिर मुकर सकते है31, carapace द्वारा पार्श्व दृश्य क्षेत्रों के महत्वपूर्ण रोड़ा होता है३२। परिणाम यह है कि उनकी दृष्टि की दृश्य पंक्ति सामने की ओर मजबूर है, जिससे उंहें और अधिक ललाट की तरह व्यवहार-स्तनधारियों आंखों । इसलिए, नेत्र आंदोलनों को मापने के लिए दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक मॉडल के रूप में उनके उपयोग भी एक अनूठा विकासवादी परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है ।
इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करता है एक इन विट्रो अलग सिर तैयार करने के लिए लाल-कान स्लाइडर कछुओं में आंख आंदोलनों के कीनेमेटीक्स की पहचान । दिमाग कपाल की नसों को अक्षुण्ण छोड़कर खोपड़ी से विच्छेदित हो जाता है. सिर एक जिंबल में आँख आंदोलनों जांचना और आंख की मांसपेशियों innervating कपाल नसों की बिजली की उत्तेजना से प्रतिक्रियाओं पैदा करने के लिए रखा जाता है । आंखों से घुमाव के उपाय एक वीडियो आधारित प्रणाली द्वारा किया जाता है, सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम का उपयोग कर, जो अंधेरे छात्र और आईरिस के चिह्नों को ट्रैक. तैयारी दोनों extraocular (यानी, क्षैतिज, ऊर्ध्वाधर, और मरोड़ घुमाव के कीनेमेटीक्स को मापने का अवसर प्रदान करता है३२ और intraocular (यानी, पुतला परिवर्तन)३३ आंदोलनों ।
Efferent तंत्रिका रास्ते के विश्लेषण के लिए मॉडल प्रणाली:
अधिक आम तौर पर, दृष्टिकोण जांचकर्ताओं के लिए अध्ययन कैसे efferent तंत्रिका संकेतों आंख आंदोलनों उत्पंन जब मांसपेशियों को अपने आराम राज्यों से शुरू और एकीकृत संवेदी सूचना के अभाव में मस्तिष्क को संसाधित करने का मौका प्रदान करता है३२, ३३. इसलिए, आंख कीनेमेटीक्स एक मॉडल प्रणाली है जिसमें वे केवल मस्तिष्क और मांसपेशियों पर synapsing छोड़ने efferent तंत्रिका मार्ग द्वारा संसाधित कर रहे हैं में जांच की जा सकती है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Red-eared slider turtles</td>
			<td>Kons Scientific</td>
			<td>Trachemys scripta elegans</td>
			<td>Large size (carapace length 15-20 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium choride</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>M7304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>C5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>H7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Oakton</td>
			<td>pH 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction stimulation electrode</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>573000</td>
			<td>Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary glass</td>
			<td>A-M systems</td>
			<td>626000</td>
			<td>Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative suction stimulation electrode</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>573050</td>
			<td>Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>GZ7</td>
			<td>Magnification range, 10x &#8211; 70x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic light source</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>HL250-A</td>
			<td>150W Fiber optical microscope illuminator light box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>625654</td>
			<td>stainless steel, straight spring, 5.25&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt dissection probe</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>627405</td>
			<td>Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>623555</td>
			<td>Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5&#34; blades, 4.75&#34; long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>F6521</td>
			<td>Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>Z168696</td>
			<td>Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>S2896</td>
			<td>Scalpel handles, No. 3, stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td>
			<td>S2771</td>
			<td>Scalpel blades, No. 11, steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-1918</td>
			<td>Kleine guillotine type 7575</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z648299</td>
			<td>Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9&#8221; long x 0.07&#8221; diameter handle with square end: 0.17&#8221; x 1.3&#8221; long, other end round: 0.17&#8221; x 1.27&#8221; long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hook</td>
			<td>Autozone</td>
			<td>98069</td>
			<td>SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95/5% O2/CO2</td>
			<td>Airgas, Inc.</td>
			<td>X02OX95C2003102</td>
			<td>5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator</td>
			<td>Airgas, Inc.</td>
			<td>Y11244D296-AG</td>
			<td>Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8&#34;, inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16&#34;, inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable airline pipe valve</td>
			<td>Doctors Foster and Smith</td>
			<td>CD-12061</td>
			<td>Brass valve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rigid table</td>
			<td>Unknown</td>
			<td>Unknown</td>
			<td>Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5&#34; diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#34; tennis ball</td>
			<td>Petco Animal Supplies, Inc.</td>
			<td>712868</td>
			<td>Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative vibration isolation table</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>INT1-36-6-N</td>
			<td>Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3&#39; x 6&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gimbal</td>
			<td>ISI, International Scientific Instruments, Inc.</td>
			<td>Stage from SUPER III-A Scanning EM</td>
			<td>5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, &#177;20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, &#177;10&#176;, and horizontal, &#177;12.5&#176;, with 1.25&#176; precision. Note: from decommission instrument.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chuck for gimbal</td>
			<td>Unknown</td>
			<td>Unknown</td>
			<td>Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative gimbal</td>
			<td>ThorLabs, Inc.</td>
			<td>GN2/M with MBT602/M</td>
			<td>Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video-based eye tracking system</td>
			<td>Arrington Research, Inc.</td>
			<td>ViewPoint EyeTracker, PC-60</td>
			<td>Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44&#176;; vertical +/- 20&#176;; Accuracy ~0.5&#176;; Spatial resolution ~0.15&#176;; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-position magnetic base</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>Pittsburg, item #5645</td>
			<td>Magnetic holder reaches up to 12&#34; and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>900</td>
			<td>5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scope on boom</td>
			<td>Lieca</td>
			<td>GZ6</td>
			<td>Magnification range, 6.7x &#8211; 40x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve/muscle stimulator</td>
			<td>Astro-Med Grass Telefactor</td>
			<td>Grass S88</td>
			<td>Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 &#956;sec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current isolation device</td>
			<td>Astro-Med Grass Telefactor</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 &#181;A to 15 mA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative nerve/muscle stimulator with isolation</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>2100</td>
			<td>Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ocular kinematics measured by in vitro stimulation of the cranial nerves in the turtle

जानवरों के euthanized के बाद, उनके ऊतकों मरने लगते हैं । कछुए क्योंकि गर्म खून रीढ़ की तुलना में, खासकर जब उनके ऊतकों का एक लंबे समय तक जीवित रहने का एक लाभ प्रदान करते हैं । इस वजह से, इन विट्रो में कछुओं में प्रयोग समय की विस्तारित अवधि के लिए तंत्रिका संकेतों और उनके लक्ष्य कार्यों के नियंत्रण की जांच के लिए किया जा सकता है । एक अलग सिर तैयारी का उपयोग करना, हम कछुए में नेत्र आंदोलनों के कीनेमेटीक्स मापा, और बिजली के संकेतों से उनके मॉडुलन कपाल नसों द्वारा किए गए. खोपड़ी से मस्तिष्क निकाले जाने के बाद कपाल की नसों को ज्यों का त्यों छोड़ना पड़ा, उस विच्छेदित सिर को आँख आंदोलनों की जांच करने के लिए एक जिंबल में रखा गया । कांच इलेक्ट्रोड कपाल नसों से जुड़े थे (oculomotor, trochlear, और abducens) और आंख आंदोलनों पैदा करने के लिए धाराओं के साथ उत्तेजित. हम एक अवरक्त वीडियो ट्रैकिंग प्रणाली और आंखों के quantified घुमाव के साथ आंख आंदोलनों पर नजर रखी । आयाम, आवृत्तियों, और ट्रेन अवधियों की एक सीमा के साथ वर्तमान दालों प्रतिक्रियाओं पर प्रभाव का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. क्योंकि तैयारी मस्तिष्क से अलग है, efferent मार्ग मांसपेशी लक्ष्य के लिए जा रहा अलगाव में जांच की जा सकती है केंद्रीय संसाधित संवेदी सूचना के अभाव में तंत्रिका संकेतन की जांच ।

चित्रा 1 एक विच्छेदन का वर्णन वीडियो से लिया छवियों के स्टिल्स दिखाता है. छवियों मस्तिष्क से काटने से पहले नसों के विशिष्ट स्थानों प्रदान करते हैं ।
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Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे का उपयोग करने के लिए एक इन विट्रो अलग कछुआ सिर तैयार करने के लिए उनकी आंख आंदोलनों के कीनेमेटीक्स उपाय । cranium से मस्तिष्क को हटाने के बाद, कपाल नसों धाराओं के साथ प्रेरित किया जा सकता है आंख और पुतली आकार में परिवर्तन के घुमाव मात्रा ।

नेत्र कीनेमेटीक्स द्वारा मापा इन विट्रो कछुए में कपाल नसों की उत्तेजना

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

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टीएमएस: थीटा - फट प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए नाजुक एक्स सिंड्रोम और Autism के साथ व्यक्तियों में plasticity की Mechasnism अन्वेषण

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