Name: surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating
Uploaded: 2018-06-23T12:30:00
Duration: 5 min 35 s
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우리는 국립 자연 과학 중국 펀드 (31770968)와 천진 연구 프로그램의 응용 프로그램 기초 및 고급 기술 (17JCZDJC33400)의 재정 지원에 대 한 감사.

1. 헤 파 린 통합 Starpeg Nanocoating의 제조
<ol><li>
헤 파 린 succinimidyl 호박 (헤 파 린-보 건국)의 합성
	<ol>
<li>얼음 처럼 차가운 이온된 수의 2.0 mL에 용 해 및 헤 파 린의 0.69 g 밖으로 무게.</li>
		<li>둥근 바닥 플라스 크에 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 0.5 mL에 용 해 및 보 건국의 0.23 g으로 무게.</li>
		<li>0.5 ml 둥근 바닥 플라스 크에 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 분해 및 EDC의 0.77 g을 무게.</li>
		<li>둥근 바닥 플라스 크에 NHS 및 EDC 솔루션을 믹스. 실 온에서 30 분 동안 실 온에서 벤치에 혼합된 솔루션을 떠나.</li>
		<li>10 분 초과 EDC와 보 건국 제거 5,031 x g 에 EDC NHS 혼합물 원심</li>
		<li>혼합 솔루션을 10 분 동안 5,031 x g 에서 원심 분리기의 냉 에탄올 30 mL를 추가 합니다.<ol>
<li>두 번 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
StarPEG-헤 파 린 nanocoating의 준비
	<ol>
<li>둥근 바닥 플라스 크에 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 의 1.0 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>같은 둥근 바닥 플라스 크에 10% (w/v) 헤 파 린-NHS의 0.67 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>점도와 명확한 솔루션을 얻기 위해 20 분에 25 ° C에서 인큐베이터에 starPEG-(NH2)8 및 헤 파 린-보 건국의 혼합된 솔루션을 배치 합니다. 참고: 실험 붙일 레이블된 덤플링을 (FAM-헤 파 린) 필요 했다, 제작 절차는 같은 스타-말뚝-(NH2)8 은 물속에에서 녹아 있는 이온 5(6)-보충 carboxyfluorescein N-succinimidyl 에스테 르 0.1% (어 금 니 비율) starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
푸리에 변환 적외선 분광학 (IR FT)에 의해 헤 파 린 못 nanocoating의 특성
	<ol>
<li>시작 하기 전에, 아세톤 및 이온된 수 옥수 박격포와 유 봉 산 장치 (작은 디스크 직경 13 m m)를 씻어. 사용 하기 전에 오븐에서 유리를 건조.</li>
		<li>좋은 KBr 분말의 200-250 mg와 혼합 약 0.1-1% 덤플링을 못 샘플.</li>
		<li>옥수 박격포에는 헤 파 린-고 케이시 혼합물을 배치 하 고 2 µ m의 직경을 가진 작은 알 약으로 정밀 하 게 격파.</li>
		<li>Pelleting 장치에 혼합물을 전송 합니다. 투명 한 펠 릿을 형성 하기 위하여 1-2 분 동안 진공에서 높은 압축 힘 (8 T/c m2)를 적용 합니다.</li>
		<li>부드럽게 당겨 pelleting 장치에서 샘플 펠 릿. 균열 발생을 하지 너무 하드 하지를 주의 해야 합니다.</li>
		<li>매우 신중 하 게는 푸리에 변환 적외선 분 광 기 샘플 화학 구조를 결정 하는 샘플 펠 릿 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스캔 한 전자 현미경 (SEM) 의해 덤플링을 못 nanocoating의 내부 다공성 구조 시험
	<ol>
<li>다음 절차에 대 한 표준 48-잘 셀 문화 접시와 펫을 준비 합니다.</li>
		<li>48-잘 문화 접시의 우물에 헤 파 린 못 코 폴리머 솔루션을 플라스틱.</li>
		<li>24 h-80 ° C에서 플레이트를 고정 합니다.</li>
		<li>Lypophilize 진공 환경에서-50 ° C에서 샘플 (0.1 Pa) 24 h에 대 한.</li>
		<li>샘플 한 알루미늄 스텁의 스티커 표면에 걸쳐 확산.</li>
		<li>골드 샘플 코트 그리고 스캔 한 전자 현미경 내부 다공성 구조를 관찰 하 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
원자 힘 현미경 (AFM)에 의해 헤 파 린 못 nanocoating 표면 검사
	<ol>
<li>실리 카 유리 슬라이드 피 솔루션을 청소 (70% H2이렇게4, 30% H2O2) 40 분 동안 80 ° C에서.</li>
		<li>10 분 동안 메탄올 그리고 10 분 동안 톨루엔에 슬라이드 sonicate</li>
		<li>진공 건조 하 여 슬라이드를 건조.</li>
		<li>3-aminopropyl-triethoxysilane 솔루션 (톨루엔에 2%), 부드럽게 흔들어 많은 슬라이드를 씻어.</li>
		<li>메탄올 톨루엔 10 분에서 10 분 동안에 슬라이드 sonicate</li>
		<li>표준 피 펫을 사용 하 여 슬라이드의 표면에 걸쳐 3% 덤플링을 못 솔루션의 장소 100 µ L.</li>
		<li>헤 파 린-못 된 원자 힘 현미경의 표면 검사 (50-80 kHz의 공 진 주파수 강제 0.350 N m 21, 600의 팁 반경 일정 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 마우스 섬 표면 공학 덤플링을 못 Nanocoating
<ol><li>
헤 파 린 못 nanocoating와 마우스 섬 표면 코팅
	<ol>
<li>콜라 소화와 histopaque 그라데이션 정화 이전 정돈19에 보고에 의해 마우스 독도 추출 합니다.</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 해 부 현미경 200 독도 따</li>
		<li>독도를 1 분 동안 503 x g 에서 원심 분리기 PBS의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>상쾌한 떨어져가지고 가십시오 덤플링을 못 솔루션의 250 µ L을 추가 하 고 10 분 아래로 덤플링을 못 솔루션와 잘 섞어 독도 수 있도록 피 펫에 대 한 얼음에 혼합물을 유지.</li>
		<li>1 분 동안 503 x g 에서 원심 분리기.</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 여기저기 잘 혼합 플라스틱.</li>
		<li>1 분 동안 503 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 하 고 추가 사용 하기 위해 독도 유지. 마우스 독도 덤플링을 말뚝 코팅의 시험, FAM-헤 파 린-못 섬 코팅 다음 단계에 사용 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 독도 식구 들-헤 파 린-말뚝 nanocoating 코팅의 시험
	<ol>
<li>보충 코팅된 독도 10% 태아 둔감 한 혈 청 RPMI 1640의 1-2 mL을 추가 하 고 이러한 독도 청구 비 살 균 세균성 문화 접시에 전송.</li>
		<li>거꾸로 형광 현미경 nanocoating 코팅 독도 식구 들-헤 파 린-못의 형태 및 형광 신호를 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 헤 파 린-말뚝의 기능 코팅 비 코팅 독도에 비해 마우스 독도
<ol><li>
헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도의 생존
	<ol>
<li>헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도의 20를 따 고 그들 셀 96 잘 문화 접시의 한 잘 합니다.</li>
		<li>10 웰 스의 총 각 잘 20 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도 채우십시오.</li>
		<li>Noncoated 제어 독도의 20를 따 고 그들 같은 셀 96 잘 문화 접시의 한 잘 합니다.</li>
		<li>10 웰 스의 총 각 잘 20 noncoated 제어 독도 채우십시오.</li>
		<li>독도 포함 하는 96 잘 접시의 각 음에 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 RPMI 1640의 200 µ L를 넣어 고 14 일에 대 한 문화에서 유지 합니다.</li>
		<li>섬 문화 미디어 2 일 마다 교체 합니다.</li>
		<li>라이브/죽은 문화에서 14 일의 끝에 키트를 얼룩이 지 고 거꾸로 형광 현미경 관찰로 독도 취급 합니다.</li>
		<li>거꾸로 형광 현미경 각 섬 내의 PI+ (적색) 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
헤 파 린-말뚝의 revascularization 코팅 마우스 독도 체 외
	<ol>
<li>전 문화 접시를 포함 하 여 모든 실험 플라스틱을 냉각 하 고 피 펫 팁 사용 하기 전에 적어도 12 h.</li>
		<li>냉각 패드에 24-잘 장소를 놓습니다. 추가 250 µ L 얼음의 차가운 증가율 감소 Matrigel 24 잘 셀 문화 접시의 각 음에. 적어도 30 분 동안 4 ° C에서 코팅된 24-잘 접시를 놓습니다.</li>
		<li>냉장고에서 매트릭스 솔루션을 설정 하는 동안 마우스 췌 장 섬 내 피 마일 스벤 1 (MS1) 세포 trypsinize.<ol>
<li>조직 배양 플라스 크에서 모든 문화 매체를 제거 합니다. PBS의 5 mL로 플라스 크를 씻어.</li>
			<li>PBS를 제거 하 고 트립 신-EDTA의 3 mL를 추가 합니다. 표준 인큐베이터에서 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
			<li>가볍게 셀을 분리 하 여 혈 청 보충 미디어의 5 mL을 추가 플라스 크의 아래쪽을 누릅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>15 mL 원심 분리기 튜브를 5 분 동안 1000 x g 에서 원심 분리기로 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>오프는 상쾌한 고 PBS의 5 mL을 추가. 여기저기 잘 혼합 플라스틱.</li>
		<li>5 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 이륙.</li>
		<li>튜브에 혈 청 보충 DMEM 미디어를 추가 하 고 행렬 솔루션 코팅 24-잘 접시의 각 음에 50000 셀 씨.</li>
		<li>각 우물에 5 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 또는 noncoated 제어 독도 추가 합니다.</li>
		<li>잘 당 500 µ L의 총 각 잘에 혈 청 보충 DMEM 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>가벼운 현미경 4 h 및 24 시간 보육 후 관 형성을 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
헤 파 린-나무 못 코팅 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비 참고:을 nanocoating 마우스 독도의 기능에 영향을 미칠 것 이라고, 헤 파 린-코팅 고 noncoated 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비는 평가 됩니다.<ol>
<li>한 1.5 mL 튜브에 30 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 또는 noncoated 제어 독도 따. 10 튜브 코팅된 독도 대 한 총 및 noncoated 독도 준비 합니다.</li>
		<li>생리 적 소금물 2 mmol/L 포도 당20 보충의 1 mL을 추가 하 고 2 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 생리 적 소금물 제조 법에 대 한 참조 하십시오 표1. 느슨한 인큐베이터에서 부 화 하는 동안 튜브의 뚜껑을 유지.</li>
		<li>가능한 많은 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>30 분 동안 37 ° C에서 20 mmol/L 포도 당으로 보충 하는 생리 적 소금물의 600 µ L을 추가 하 여 독도 자극.</li>
		<li>ELISA 정량화 상업 인슐린 ELISA를 사용 하 여 키트 인슐린에 대 한 각 관에서 상쾌한의 200 µ L를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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이 문서에서 설명 하는 생활을 위한 "쉬운-을 채택" 접근 세포 표면 덤플링을 통합 starPEG nanocoating는 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 간의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 엔지니어링 및 췌 장 섬 표면 막의 아민 그룹입니다. 실제로, 세포 막 내에서 아미노 그룹은 반응성이 매우 높은, 그리고 그 결과, 이전 연구 보고가 생리 조건14에서 활성화 된 N-hydroxysuccinimidyl (NHS) 에스테 르 주 아미노 그룹 사이 상호 작용 ,,1621. 또한, 광범위 한 연구는 섬 캡슐화 동안 덤플링을 매우 sulphated glycosaminoglycan, 세포 외 매트릭스의 중요 한 분 대의 설립 향상 된 후 이식 이어질 수 보고 revascularization 그리고 감소 IBMIR22,23. 말뚝의 생체 적합성 및 헤 파 린의 multivalent 속성을 고려 하면 우리는 nanocoating의 제조 동안 로드 최대한 덤플링을 8 무장 못 사용. 헤 파 린-보 건국, 작은 섬 세포 막에-NH2 그룹과 반응 이후에 수정 되었다. 헤 파 린 통합 말뚝에 의해 공유 결합 형성 (세포 막)의-NH2 -NHS 형 간염-못의 사이 독도 것 쉽게 "코팅"을 함으로써 따라서는 췌장암의 외부 표면에 나노 얇은 레이어 (nanocoating)를 형성 독도입니다.
현재 방식은 다른 섬 미소-보 건국 (nanocoating)의 작은 섬 세포의-NH2 사이 그 의사 bioorthogonal 화학에 대 한 주요 폴리머로 못 선택 이전에 게시 방법 막 사용 되었다. 섬/셀의 그 안정성을 고려 하면 코팅, 플라즈마, 같은 복잡 한 환경에서 특히 중요 포스트 이식 revascularization 이며 생존, 보 건국-와-NH2 사이 형성 될 것 이라고 더 안정적인에 비해 세포 막이 고24, 정전기 상호 작용9,15,,2425,26 또는 생물 학적 연동 biotin 사이의 소수 성 상호 작용 streptavidin14.
또한, 섬 달리 코팅 접근 또한 멀티 레이어 증 착14,,1625, 현재 기술에 대 한 확장된 섬 처리 기간으로 LBL 방식을 사용 하는 필요 최소한의 처리 하 고 매우 짧은 코팅의 고립 된 독도의 기간. 이러한 요소 둘 다 이기 때문에 독도 생존 종종 이미 손상 된 다음 섬 고립 때문에 손상 된 ECM 효소 소화 하는 동안 후 이식 섬 생존을 위해 필수적입니다. 그러나, 현재 접근에의 한 제한, LBL을 통해 외부 코팅의 두께 증가 또는 층 증 착의 수를 감소에 의해 제어 수 달리 형 간염 페그 nanocoating의 두께 수 없습니다 맞출 시간이 되 고 이다.
또한, 보 건국-와-NH2 장소, 현재 접근 사이 화학 반응은 살아있는 세포에 대 한 적용 온화한 조건 때문 표면 하지 엔지니어링 췌 장의 작은 섬, 하지만 대부분 세포 치료 제한. 또한, 헤 파 린에 대 한 다양 한 cytokines 및 생물 학적 활성 분자와 상호 작용 알려져 고려, 형 간염 페그 nanocoating도 선물 잠재력이 무제한 생물 중재자의 설립에 대 한 오픈 플랫폼 뿐만 아니라 더 복잡 한 세포 표면 공학에 대 한 인터페이스입니다.

세포 기반 요법의 치료 효능은 낮은 세포 보존 및 가난한 생존1,2에 의해 제한 됩니다. 세포 치료의 결과 개선, 효소 조작 통해 표면 공학, 주문 펩 티 드 활용, bioorthogonal 화학 및 생체 재료와 물리적 캡슐화 되었습니다 악용된3,4, 5,6,7,8,,910. 현재 프로토콜 표면 공학 ultrathin 덤플링을 통합 starPEG (헤 파 린-PEG) nanocoating 세포 표면에 적용 하 여 "쉬운-을 채택" 방법을 사용 하는 살아있는 세포의 달성을 목표로 한다. 췌 장 독도의 표면 공학 제시 했다 독도 Langerhans과 현재 임상 작은 섬 이식의 비방 결과의 질적 특성으로 인해 예를 들어 여기.
실제로, 임상 작은 섬 이식 현재 격리 된 독도의 간 문맥으로 직접 주입 하 여 수행 되며이 절차만에 사용할 수 선택적 환자 기증자 재료와 낮은 치료 효능의 부족 때문에 11. 통상, alginate 되었습니다 섬 캡슐화 및 표면 수정에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 소재 alginate과 관련 된 염증 성 섬유 증12, 화학 불안정성 때문 이상적 미만 이더라도 13. 또한, 100 ~ 200 µ m 사이 배열 하는 독도의 자연 크기에 비해, alginate 섬 microcapsules는 400와 800 µ m 사이 배열 하는 더 큰 산소의 생리 적 확산 거리를 초과 하는 있는. 등각 섬 캡슐화, 즉., 독도 섬 볼륨의 중요 한 변경 없이 캡슐화, 다음 개발 되었다. 따라서, nanomembranes의 페그, tetrafluoroethylene, 실리콘 막의 구성 또는 다층된 nanocoating (일컬어 "레이어-의해-레이어" [LBL] 기술) 향상 된 생체 외에서 섬 생존14 결과 보고 되었습니다. ,,1516,,1718, 비록는 LBL 자주 접근 필요 합니다 광범위 한 독도 섬 생존을 손상 될 수 있는 여러 층의 증 착에 대 한 기간 전달 . 또한, biomembrane 레이어 또는 nanomembranes 및 섬 표면 사이의 소수 성 상호 작용 사이 정전기 또는 공유 상호 작용에 의존 하는 nanomembranes의 불안정성 또한 우려9,14 제기 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Encumbers intraportal 섬 이식의 치료 결과 또 다른 제한 요소는 즉시 혈액 중재 염증 반응 (IBMIR) 이식된 독도 혈액, 혈소판, 결과와 직접 접촉에 의해 발생 응고 및 면역 부작용 또는 원치 않는 세포 활성화9. 이러한 문제를 해결 하기 위해 별 모양의 폴 리 에틸렌 글리콜 (starPEG)의 구성 하는 울트라 얇은 nanocoating 설립된 생체 적합성과 섬 소재 주택으로 다 준비 되었다. 헤 파 린, 매우 sulphated glycosaminoglycan, 또한 그것의 항 염증 제, 항 응고 제 속성과 vascularization 프로 신생 성장 인자22, 모집 하 여 촉진 수에 대 한 starPEG nanocoating에 통합 되었다 23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Reagent</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">PBS</td>
			<td style="width:160px;">Hyclone</td>
			<td style="width:120px;">AAJ207798</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Streptozototin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">S0130</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Histopaque</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">10831</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">31800022</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:131px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">16000-044</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">15140</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:131px;">Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">13150-016</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">DMEM</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">12800017</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">D-(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">G8644</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">488 phalloidin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">A12379</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">21888-25mg-F</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:131px;">Annexin V/PI apoptosis kit</td>
			<td style="width:160px;">Dojindo</td>
			<td style="width:120px;">AD10</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">DAPI Fluoromount-G</td>
			<td style="width:160px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:120px;">0100-20</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Collagenase from Clostridium, Type XI</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">C7657</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Heparin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H3149</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">NHS</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">56480</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">EDC</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">3449</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">8-armed PEG</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">1685176</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">FAM</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">M041100</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">21888</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">KBr</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">32036</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">3-aminopropyl-triethoxysilane&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3648</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">toluene</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">S-15497-20X</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Live/dead staining kit</td>
			<td style="width:160px;">Biovision, US</td>
			<td style="width:120px;">K501</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:131px;">BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:120px;">354230</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium chloride, 99.5%</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">105864</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Potassium chloride, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">991468</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">988639</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">182158</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:131px;">Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">128839</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">119370</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">21114</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">V900933</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Millipore-linco</td>
			<td style="width:120px;">EZRMI-13K</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

세포 표면 공학 호스트 면역 공격에서 이식된 세포를 보호할 수 있습니다. 그것은 또한 이식 기능을 개선 하기 위해 셀룰러 가로 바꿀 수와 생존 후 이식. 이 프로토콜은 표면 공학 ultrathin 덤플링을 통합 starPEG (형 간염-PEG) nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 달성을 목표로 한다. 췌 장 섬 표면 공학에 대 한 형 간염 페그 nanocoating를 생성 하려면 덤플링을 succinimidyl 호박 (헤 파 린-보 건국) 처음 사용 하 여 N-(3-dimethylamino propyl)-그것의 카복실산 그룹의 수정에 의해 합성 되었다N'-에틸 carbodiimide 염 산 염 (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS). 형 간염 페그 혼합물 다음 아미노 끝 기능성된 8-무장 한 starPEG (starPEG-(NH2)8) 및 헤 파 린-보 건국의 가교에 의해 형성 되었다. 섬 표면 코팅, 마우스 독도 콜라 소화 및 Histopaque를 사용 하 여 그라데이션 정화를 통해 격리 했다. 격리 된 독도 다음 NHS와 작은 섬 세포 막의 아민 그룹 사이의 공유 바인딩 수 있도록 10 분 동안 얼음 감기 형 간염 페그 솔루션으로 치료 했다. Nanocoating 형 간염 페그와 부딪히는 섬 크기에 최소한의 변경 하 고 볼륨 및 형 간염 페그와 독도의 heparinization 또한 섬 이식 하는 동안 인스턴트 혈액 중재 염증 반응을 줄일 수 있습니다. "쉬운-을 채택" 이렇게 세포 생존 능력을 타협 하지 않고 충분히 살아있는 세포의 표면 공학에 대 한 가벼운입니다. 형 간염 페그 nanocoating 또한 무제한 기능 생물학 중재자 및 생활에 대 한 다층된 표면 관 수 있도록 개방형 플랫폼 제공 고려 덤플링을 여러 cytokines에 바인딩 선호도 보이고 있다, 세포 표면 생명 공학입니다.

헤 파 린 못 nanocoating starPEG-(NH2)8 , EDC와 보 건국 커플링 에이전트 (그림 1)으로 사용 하는 헤 파 린의 활용에 의해 합성 되었다. 헤 파 린 못 nanocoating의 화학 구조에 의해 FT-적외선 조사 되었다 그리고 그림 2에서 같이, 헤 파 린의 특성 피크 3300-3600 c m-1, 헤 파 린 (그림 2 의 수 산 기 그룹에 해당에서 관찰 될 수 있었다 빨간). (그림 2 블루) 3300-3600 c m-1 에서 피크의 진폭에 있는 감소는 starPEG-(NH2)8 아 미드 그룹 및 헤 파 린 생성 그룹 사이 활용을 나타냅니다. 아 미드에 해당 하는 피크 1650 c m-1 의 carbonyl 진동 스트레칭 또한 succinimidyl 호박으로 덤플링의 카복실산 그룹 및 starPEG-(NH2)의 아민 사이 충분 한 반응을 나타내는 감소 되었다 8. 헤 파 린 못 nanocoating의 표면 구조는 원자 힘 현미경 검사 법에 의해 시험 되었다 루 외에서 표시 하는는 nanocoating 약 30 nm 높이에 이르기까지 작은 다공성 기능 (검 버섯) 폭에서 2 µ m 100 ~ 200 사이 직경10nm. 스캔 한 전자 현미경 검사 법에서 얻은 데이터는 또한 vivo에서 전달 중 세포 생존에 적합 될 수 제안 덤플링을 페그 (그림 3)의 높은 상호 다공성 구조를 확인 합니다.
격리 된 마우스 독도의 표면 코팅 시험 되었다 고 그림 4에 제시 된으로 녹색 형광으로 표시 하는 nanocoating의 얇은 레이어 코팅된 독도의 표면에 걸쳐 섬 볼륨/크기에 분명 변화를 유발 하지 않고 예금은 균등 하 게. 코팅, 동안 그들의 생존을 유지 하기 위해 얼음에 독도 유지 하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 코팅 기간 10 분이 경우에 최적화 되었다 독도 생존 능력의 유지 관리를 허용 하도록. 그것은 그는 nanocoating의 더 나은 관측을 위해 이전에 보고 된9,16 코팅된 독도의 횡단면을 검사 전자 현미경 검사 법 더 적절할 것, 비록 데이터 생성 협조할 문화에서 생활 독도 대신 열 한 고정 및 임베디드 대에서
에 관한 생존 및 코팅된 독도, 섬 revascularization 및 기능의 기능 평가 체 외되었습니다. 헤 파 린의 유익한 속성을 고려 하면 섬 표면 덤플링을 기능화 수 문화에 따라서 생존 섬 revascularization 용이 하 게. 우리는 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도 전시 문화 (그림 5)에서 강력한 섬 생존을 관찰 했습니다. 훨씬 더 고급 혈관 형성은 헤 파 린-페그와 공동 경작 했다 섬 내 피 세포 (MS1)에서 또한 분명 코팅 독도, 길쭉한 microvessel 같은 구조와 같은 네트워크 혈관 구조 (그림 6에 표시 된 ).
Nanocoating 프로세스 덤플링을 말뚝 코팅 독도의 효과 포도 당 자극 인슐린 분 비 능력을 발생합니다. 인슐린 분 비의 낮은 수준 때 독도 생리 적 소금물 포도 (2 mmol/L;의 sub-stimulatory 수준으로 보충을 끼얹는다 했다 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다 그림 7)입니다. 독도 포도 당 (20 mmol/L 포도 당)의 위에 생리 적 수준으로 자극 했다, 인슐린 분 비의 증가 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> 그림 1: 형 간염 페그 nanocoating 췌 장 섬 표면 공학의 화학 구조. 섬 코팅 덤플링을 NHS 및 세포 막 및 스타-말뚝-(NH2)8주 아민 사이 화학식 가교에 의해 달성 되었다. 각 헤 파 린 분자는 각 NHS 그룹을 수정 하는 여러 carboxyl 그룹을 소유한 다. NHS 활성화 carboxyl 그룹 폼 아 미드 결합를 통해 nanocoating 형 간염-고 독도의 안정화는 단백질의 1 차 아민과 반응 것 이다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> 그림 2 : 스타-말뚝-(NH2)8, 헤 파 린에 형 간염 페그 nanocoating의 적외선 스펙트럼의 건조 상태. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> 그림 3: 형 간염-못 말린된 상태에서의 전자 현미경 이미지를 스캔. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> 그림 4: 헤 파 린-말뚝의 대표 이미지 코팅 형광 현미경 독도. 헤 파 린 식구 들 (녹색에서 표시)와 함께 사전 이라는 했다. 이미지는 100 독도의 대표. 눈금 막대 = 100 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> 그림 5: 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 전시 강력한 섬 생존. (A) 데이터의 의미, n mean± 표준 오류로 그룹당 50 독도 =. (B) 살아있는 세포는 빨강에서 녹색 및 죽은 세포에 표시 했다. 눈금 막대 = 100 µ m 이미지는 50 독도의 대표. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> 그림 6: 헤 파 린 못 nanocoating 용이 내 섬 revascularisation. MS1 셀 헤 파 린-나무 못 코팅 독도와 noncoated 제어 독도 공동 경작의 Matrigel 튜브 형성. 이미지 4와 24 h. 규모 바에서 찍은 = 100 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> 그림 7: 헤 파 린 못 nanocoating 섬 인슐린 분 비 기능에 변화를 발생 시킵니다. 헤 파 린-나무 못 코팅된 독도 및 noncoated 제어 독도 (각 30) 2 mmol/L (흰색 막대)에 노출 됐다 또는 30 분 응답 20 mmol/L 포도 당으로 인슐린 분 비에 대 한 20 mmol/L (검은 막대) 포도 코팅 사이 비교 했다 고 독도 제어. 데이터의 의미, n 평균 ± 표준 오차 표시 됩니다 = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Heparinized StarPEG Nanocoating와 췌 장 독도의 표면 공학

이 프로토콜은 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 및 섬의 아민 그룹 사이의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 헤 파 린 통합 starPEG nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 표면 공학 달성을 목표로합니다 세포 막입니다.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

룽 공학을위한 절차

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

연구

생체공학

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

연속 흐름 Microspotter을 사용하여 수정 된 표면에 세포의 침수 인쇄

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

암 세포의 침략에 응용 프로그램을 사용하여 종양의 기질 미시의 조직 공학

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

의 생명 공학에 대한 각질 기반의 나노 섬유의 합성

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

에 내장 혈관 신생에 의하여 조직 공학<em&gt; 생체</em&gt; 조직 공학 상공 회의소

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Sustained Administration of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Polylactic-co-glycolic acid Microspheres

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

단일 세포 수준에서 캐비테이션 버블 (들) -cell 상호 작용 및 결과 Bioeffects을 조사하기위한 표면 패터닝와 마이크로 유체 시스템

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...