Name: high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB at JoVE.com

ويدعم هذا العمل تايشان العلماء الإنشاءات الهندسية (G.T.)، "جائزة العلماء الشباب شاندونغ ممتازة" (ZR2016JL026 إلى ت. غ.)، الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية (31771284 و 3167070448 و 81641108)، شاندونغ الطبيعية المقاطعة مؤسسة العلوم (ZR2016JL026، 2017GSF18103) ومقاطعة شاندونغ العلوم والتكنولوجيا خطة (J14LE01 و J15LK03)، يانتاي plan(2015ZH083) العلوم والتكنولوجيا وبينزهو الطبية الجامعية العلمية أموال البحث (BY2013KYQD17، BY2013KYQD18)، منح "مجلس البحوث السويدية" 621-2011-4423 وعام 2015-4870. كما يشرف هذا العمل "يانتاي مزدوجة مئات المواهب" وخطة "يانتاي التكنولوجيا الفائقة منطقة الأزرق المحيط المواهب".

جميع الإجراءات الحيوان كانت تنفذ وفقا "الجامعة الطبية بينزهو الحيوان استخدام التوجيه"، والتي وافق عليها مجلس المراجعة الأخلاقية للجامعة الطبية بينزهو.
1. إعداد نموذج
<ol><li>تأخذ 50 ملغ الماوس الأنسجة 1.5 مل من أنبوب. إضافة 200 ميليلتر تحلل العازلة (50 مم هيبيس، درجة الحموضة 7.4، 137 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم يدتا، 5 ملم اجتا، مجكل 1 مم2، 10 مم نا2P2O7، 1% X-100 تريتون، والغليسيرول 10%)، وتستكمل مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (100 مم ناف، فينيلميثيلسولفونيل 0.1 مم فلوريد، 5 ميكروغرام/مل بيبستاتين، 10 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، أبروتينين 5 ميكروغرام/مل).</li>
	<li>مجانسة الأنسجة مع الخالطون لمدة 1 دقيقة على الجليد.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 8 000 س ز في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>جمع المادة طافية إلى أنابيب جديدة (1.5 مل) وتأخذ بها 1 ميليلتر للبروتين تركيز الإنزيم مع طقم اتفاق التعاون الأساسي. ملاحظة: يمكن استخدام كافة المخازن المؤقتة تحلل استخداماً لتحليل لطخة غربية ودوت لطخة تحليل لتحليل قدب.</li>
</ol>2. تحديد خصوصية جسم
<ol><li>إعداد نموذج ليساتيس (20 ميكروغرام) في الفرع 1-4، ومفتش الحرة جيش صرب البوسنة (20 ميكروغرام)، البروتين القياسية (600 صفحة)، لتحليل لطخة غربية. ملاحظة: مفتش جيش صرب البوسنة الحرة كعنصر تحكم سلبية والبروتين القياسي يستخدم كعنصر إيجابي. ويتجلى خصوصية الجسم عرض فرقة واحدة من الحجم الصحيح باستخدام تحليل لطخة غربية.</li>
</ol>3-تحديد نطاق التحليل قدب الخطي
<ol><li>حل البروتين القياسية مع ddH2O. ديلوتى البروتين إلى تركز 1,200 بيكوغرام/ميليلتر.</li>
	<li>تخفف من البروتينات المركزة من العينات المعدة في قسم 1.4 إلى 4 ميكروغرام/ميليلتر.</li>
	<li>حل جيش صرب البوسنة مع ddH2O. ديلوت البروتين إلى تركز 1,200 جزء من الغرام/ميليلتر و 4 ميكروغرام/ميليلتر.</li>
	<li>تم إعداد سلسلة من إضعاف البروتين القياسية وإعداد العينات، بالتوجيه من الجدول 1 و الجدول 2.</li>
	<li>ميكس 10 ميليلتر إضعاف البروتين القياسية أو تمييع إعداد العينات و 10 ميليلتر 2 × تحميل المخزن المؤقت (120 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، 20% والغليسيرول، الحزب الديمقراطي الصربي 4%، 0.2% برومفينول الأزرق، 200 ملم DTT) معا.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg/ميليلتر)</td>
			<td>S2 (33.3pg/ميليلتر)</td>
			<td>S3 (100pg/ميليلتر)</td>
			<td>S3 (300pg/ميليلتر)</td>
			<td>S5 (600pg/ميليلتر)</td>
			<td>S6 (1200pg/ميليلتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>protein(1200pg/µl) القياسية</td>
			<td>0</td>
			<td>1.39</td>
			<td>4.17</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>مفتش الحرة جيش صرب البوسنة (4pg/ميليلتر)</td>
			<td>50</td>
			<td>48.61</td>
			<td>45.83</td>
			<td>37.5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>المجموع</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1. نظام تخفيف لمنحنى البروتين القياسية.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0µg/ميليلتر)</td>
			<td>X2 (0.25µg/ميليلتر)</td>
			<td>X3 (0.5µg/ميليلتر)</td>
			<td>X4 (1µg/ميليلتر)</td>
			<td>X5 (2µg/ميليلتر)</td>
			<td>X6 (4 ميكروغرام/ميليلتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sample(4µg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>3.125</td>
			<td>6.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>مفتش BSA(4µg/µl) الحرة</td>
			<td>50</td>
			<td>46.875</td>
			<td>43.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>المجموع</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2. نظام تخفيف لإعداد العينات
<ol start="6"><li>الحرارة الخلائط في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.</li>
</ol>4-عملية تحليل قدب
<ol><li>
نموذج التطبيق
	<ol>
<li>دعم لوحة قدب لتجنب الجزء السفلي من اللوحة لمس سطح الجدول. على سبيل المثال، استخدام مربع تلميح ماصة فارغة كدعم.</li>
		<li>تحميل تصل إلى 2 ميليلتر من العينة إلى مركز للغشاء في الجزء السفلي من وحدة فردية للوحة قدب.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تجفيف اللوحة
	<ol>
<li>إجازة لوحة قدب المحملة ح 1 في الغرفة المعتدلة (RT) أو كبديل لذلك لوحة المحملة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في مكان جيد التهوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
حجب لوحة
	<ol>
<li>تراجع لوحة قدب في نقل المخزن المؤقت (م 0.039 جليكاين، 0.048 "م تريس"، 0.37 في المائة الحزب الديمقراطي الصربي، الكحول الميثيل 20 ٪) وهزه بلطف لوحة لمدة 10 ق.</li>
		<li>شطف لوحة قدب برفق مع تبسة (تريس مخزنة المالحة، 0.1% 20 توين) ثلاث مرات، ويغسل ثم لوحة لمدة 5 دقائق في تبسة تحت الهز المستمر.</li>
		<li>كتلة لوحة قدب مع المخزن المؤقت لحظر (الحليب الخالي من 5% في تبسة (100 ميليلتر في البئر) ح 1 تحت الهز المستمر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
الاحتضان الابتدائي جسم
	<ol>
<li>تضعف جسم الأولية في المخزن المؤقت الذي حظر بتركيز المختار (من 1:500 إلى 000 1:5)، وإضافة 100 ميليلتر لكل بئر الفردية من صفيحة جيدا 96 العادية. إدراج لوحة قدب في لوحة جيدا 96 واحتضان لوحات مجتمعة أما عن ح 2 في الرايت أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تحت الهز المستمر.</li>
		<li>بدلاً من ذلك، ضع لوحة قدب داخل مربع، وملء المربع مع المخزن المؤقت حظر مم 2 إلى 3 أعلاه جزء الغشاء في اللوحة إذا تم استخدام جسم نفس لوحة كاملة. إضافة جسم أساسي في تركيز المختار، واحتضان لوحة أما عن ح 2 في الرايت أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية بإطار الهز المستمر.</li>
		<li>شطف لوحة برفق مع تبسة ثلاث مرات قبل ذلك هو غسلها مع تبسة لثلاث مرات، كل مرة لمدة 5 دقائق تحت الهز المستمر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
الثانوي جسم الحضانة
	<ol>
<li>تضعف جسم الثانوية في المخزن المؤقت لحظر في تركيز المختار (من 1:1، 000 01:50، 000)، وأما اليكووت 100 ميليلتر/جيدا في طبق جيدا 96 أو في مربع كما هو موضح في القسم 4.4.2 ومن ثم احتضان لوحة قدب داخل أما جيش جيد 96 تحميل الشركة المصرية للاتصالات أو مربع لح 1 في RT تحت الهز المستمر.</li>
		<li>شطف لوحة قدب بلطف 3 مرات مع تبسة، ثم تغسل لوحة ل 3 مرات، 5 دقيقة كل مع تبسة تحت الهز المستمر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
القياس الكمي
	<ol>
<li>إعداد تشيميلومينيسسينسي تعزيز الركيزة (القامة) باتباع إرشادات الشركة المصنعة.</li>
		<li>الكوة القامة الركيزة إلى 96 لوحة جيدا (100 ميليلتر في البئر) وإدراج لوحة قدب داخل لوحة 96 جيدا لمدة 2 دقيقة تحت الهز المستمر.</li>
		<li>قم بإزالة لوحة قدب من 96 لوحة جيدا واهتز بإيجاز لإزالة السائل الزائد. ضع اللوحة على لوحة بيضاء ميكروتيتير.</li>
		<li>قم بتشغيل القارئ الميكروسكوبية، وحدد "لوحة الغطاء" في واجهة المستخدم قبل وضع لوحات مجتمعة (لوحة قدب + محول لوحة بيضاء) داخل القارئ الميكروسكوبية للقياس الكمي. ملاحظة: تأكد من استخدام لوحة ميكروتيتير بيضاء، وغير شفافة كمحول لتجنب أي تدخل من اللوحة. تأكد من اختيار "لوحة الغطاء" لتفادي التشويش على الجهاز عند الجمع بين اللوحات (لوحة جيدا محول لوحة + 96 قدب) يتم وضعها داخل القارئ الميكروسكوبية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proposal+for+validation+of+antibodies.">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li><li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies.">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li><li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA).+Quantitative+assay+of+immunoglobulin.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li><li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen,+immunoglobulin+G,+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes.">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li><li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front.">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li><li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+array:+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells.">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li><li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations.">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+dot+blot+analysis+(QDB),+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method.">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li></ol>

أصحاب تشانغ يونيون ووينفينج تشانغ تشانغ جياندي هم الموظفون المشتغلون زيستيرن التي تنتج ألواح قدب المستخدمة في هذه المقالة. تشانغ وينفينج وتشانغ يونيون تعلن تضارب المصالح، وقد قدم تشانغ جياندي طلبات براءات الاختراع. الآخرين المطالبة لا تضارب في المصالح.

بين جميع المناعة تتوفر التقنيات الحالية لتحليل البروتين باستثناء أليسا، تحليل قدب هو الأسلوب الوحيد لتحقيق محتوى المطلقة من البروتين محددة على المستويات الخلوية والأنسجة في شكل ارتفاع إنتاجية. على الرغم من أن مع المعيار المسمى النظائر المستقرة الكتلي قادرة على تحقيق التقدير الكمي المطلق للبروتينات قليلة، هذا الأسلوب غير بعد مصمم من أجل إنتاجية عالية الأداء. في هذه الدراسة، أثبتنا عملية تحليل قدب لتحقيق تصميمه المطلق كابج مستوى البروتين في الأنسجة الماوس بما في ذلك الكلي والطحال والبروستاتا. تم العثور على مستويات كابج أن يكون بين 200 إلى 360 جزء من الغرام/غرام في أنسجة الكلي الماوس و 460 إلى 650 جزء من الغرام/غرام في الطحال الماوس و 330 إلى 390 جزء من الغرام/غرام في أنسجة البروستاتا الماوس.
بالمقارنة مع أليسا، يتطلب التحليل قدب جهود الحد الأدنى توضع في مختبر عادية. أولاً، لوحة قدب استناداً إلى غشاء النيتروسليلوز للقضاء على هذه الخطوة طلاء في أليسا. ثانيا، يتطلب التحليل قدب فقط واحد بدلاً من اثنين من الأجسام المضادة المحددة في ساندويتش أليسا. ثالثا، قدرة عالية ملزمة غشاء النيتروسليلوز مقارنة بسطح لوحة أليسا كما يسمح الغشاء على الصمود في وجه الخطوات الصارمة الغسيل المستخدمة عادة في تحليل إيمونوبلوت للحد من التدخل في الخلفية. هذه الميزة غير مفيدة جداً في تحليل معقدة ليساتيس إعداد من الخلايا والأنسجة. وفي المقابل، يصبح الحد الخلفية عند تحليل ليساتيس الخلايا والأنسجة ومعقدة نظراً لقدرة ملزمة منخفضة نسبيا من لوحات أليسا، تحديا حقيقيا في العملية التنموية.
ويمكن اعتماد التحليل قدب بسهولة في أي مختبر مع وصول جسم معين. ومع ذلك، من المهم أن أذكر أن خصوصية الأجسام المضادة مصطلح نسبي، محدودة بعوامل بما في ذلك الأنواع، وأنواع الأنسجة وأنواع الخلايا. كما هو مبين في الشكل 1ألف، جسم كابج هي محددة عند تحليل ليساتي من الماوس الكلي، والطحال، والبروستاتا، ويصبح غير محددة عند تحليل الكبد الماوس. في الواقع، تبين لنا بشكل روتيني جسم واحد لتكون محددة لنوع واحد من الأنسجة، ولكن ليس دائماً محددة لنوع الأنسجة الأخرى من نفس الفصيلة. وهكذا، تحليل لطخة غربية مسبق ضروري لضمان خصوصية التحليل قدب. في الواقع، خصوصية النسبية للأجسام المضادة قد يكون سبب نتائج خاطئة كثيرا ما ترتبط بتحليل إليزا، كما بغض النظر عن مدى الجهد الشركة المصنعة قد قضوا لضمان خصوصية المقايسة، أنها لا يمكن أن يستنفد كل ما يمكن يمكن اختيار أنواع العينات للمستخدمين لتحليل استخدام منتجاتها أليسا.
كما هو الحال مع جميع تحديدكم، مشكلة محتملة مع أسلوب التحليل قدب عدم اتساق نوعية الأجسام المضادة التجارية. حتى لو كان الظاهر نوعية جسم مضاد من نفس تستخدم الشركة (نفس الكتالوج رقم، إلخ)، ويمكن أن تكون هناك اختلافات كبيرة من شراء واحد إلى آخر بسبب تقلب دفعة لدفعة. ولذلك، ما لم تحقق كامل الثقة في نوعية جسم المتاحة، إعادة وصف الجسم عند كل عملية شراء من المهم.
وباختصار، نحن نقدم هنا بروتوكول مفصلاً، وعلى سبيل مثال عند استخدام أسلوب التحليل قدب تحقيقا لتحديد الكمية المطلقة من البروتين محددة على مستوى الأنسجة. ونحن تبين أن أسلوب التحليل قدب أداة ملائمة لكل من يهمه الأمر في ارتفاع الإنتاجية، التحليل الكمي إيمونوبلوت. كما يميز قدرته على تحقيق تصميمه المطلق للمحتوى من البروتين محددة على مستوى الخلايا والأنسجة وهذا الأسلوب من الأساليب التقليدية إيمونوبلوت. تسمح هذه الميزة لتركيبة ومقارنة النتائج من تحليلات متعددة، وخطوة ضرورية لا سيما في الدراسات السكانية الأكبر، وإنجاز دراسات ذات الصلة الرابطة على مستوى البروتين في المستقبل القريب.

جنبا إلى جنب مع التطورات المثيرة في أبحاث الجينوم في السنوات الأخيرة، شهود ميدان البحوث الطبية الحيوية أيضا تقدم كبير في بحوث البروتين. مع تزايد تراكم البيانات البيولوجية على حد سواء الجينوم ومستويات البروتين، باستخدام أدوات بيوينفورماتيك لتحليل هذه البيانات أصبح تركيز البحوث الطبية الحيوية في المستقبل إدراكه وفهمه. ونتيجة لذلك، نجاح البحث بيوينفورماتيكال يثير الطلب على نوعية البيانات من مجتمع البحوث البيولوجية والطبية الحيوية أكثر وأفضل، لا يمكن تحقيق مهمة من خلال النهوض بتقنية في الجينوم ومستويات البروتين.
الطيف الكتلي (مللي ثانية) وتحليل immunoblot حاليا اثنين من التقنيات السائدة لتحليل البروتين. مرض التصلب العصبي المتعدد هيمن على بحوث البروتين البشري في السنوات الأخيرة لتمكين تحليل الآلاف من البروتينات الفردية في نفس الوقت. التقنيات المستندة إلى إيمونوبلوت، بما في ذلك الغربية وصمة عار ووصمة عار دوت، من ناحية أخرى، كما لعبت دوراً هاما في بحوث البروتين حتى منذ اختراع1،2،،من34، 5. يرتبط الإنزيم المرتبط بالانزيم (إليزا)5،،من67 ويمكن اعتبار المرحلة عكس البروتين ميكرواري (ربم)8،9 تنسيق عالية الإنتاجية إيمونوبلوت تحليل. ومع ذلك، هذه الأساليب المناعة إلا أليسا، قياس مستوى التعبير النسبي البروتين محددة. الطابع النسبي لهذه الأساليب سوف تصبح مشكلة حقيقية للدراسات السكانية، كما يجب أن يتم التحليل في الوقت نفسه، منع أي جهود ترمي إلى زيادة حجم تجمع من خلال تحليلات متعددة. وعلاوة على ذلك، النتائج المستمدة من هذه الدراسات فقط نصف الكمية، مما يعقد أي جهود المعلوماتية الحيوية في تحليل البيانات. وفي الوقت نفسه، على الرغم من أن أليسا أيضا مناسبة لتحليل عينات البروتين المطلق إنتاجية عالية، يبدو هذا الأسلوب لمواجهة التحديات في البيئات المعقدة مثل الخلايا أو الأنسجة بسبب قدرته على ربط منخفض والإرسال المتعدد10.
لدينا وضع أسلوب immunoblot مناسبة للدراسات السكانية بالخصائص الرئيسية ليجري مريحة، وارتفاع الإنتاجية، الكمية، ومناسبة لتصميم مطلق لمحتوى البروتين، ويسمى هذا الأسلوب دوت الكمية وصمة تحليل (قدب)11. في هذه الدراسة، ونحن تقديم بروتوكول مفصل لتحليل قدب وإظهار الأسلوب بتحديد محتوى البروتين المطلق للبروتين محددة، كابج، في ثلاث أنسجة الماوس المختلفة بما فيها الطحال والكلى والبروستاتا. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول مفصلاً يوضح جيدا بالجدوى والملاءمة لهذا الأسلوب، وتقديم إرشادات بشأن كيفية تجنب المزالق المحتملة في ممارسة هذا الأسلوب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:911px;" width="910">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:220px;">Tecan</td>
			<td style="width:177px;">Tecan Infinite 200 PRO</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:283px;">QDB plate</td>
			<td style="width:220px;">Yantai Zestern Co.Ltd</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:231px;">Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:283px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)</td>
			<td style="width:220px;">jackson</td>
			<td style="width:177px;">&#160;711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Enhanced chemiluminesence substrate</td>
			<td style="width:220px;">Thermo</td>
			<td style="width:177px;">32134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Rabbit anti-CAPG&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-T52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">CAPG protein</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-HNAE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hepes</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Nacl</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">10461220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Mgcl2</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">20120802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EDTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">E9884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EGTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">BNN1913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Na2P2O7</td>
			<td style="width:220px;">Haituo Chinese medicine test</td>
			<td style="width:177px;">20160914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Glycerol</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">P7626-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pepstatin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">Z290033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">leupeptin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aprotinin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">A3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris-Hcl</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">SDS</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L5750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">DTT</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Bromphenol Blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">B-0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">NaF</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)

تفتقر مريحة، الكمية، عالية الإنتاجية إيمونوبلوت الأسلوب لتصميمه المطلق للمحتوى من البروتين محددة على مستوى الخلايا والأنسجة ويعوق إلى حد كبير التقدم في بحوث البروتين. النتائج المستمدة من تقنيات immunoblot المتوفرة حاليا أيضا نسبية، منع أي جهود ترمي إلى الجمع بين الدراسات المستقلة بتحليل واسع النطاق لعينات البروتين. في هذه الدراسة، ونحن تثبت عملية تحليل لطخة دوت الكمية (قدب) لتحقيق التقدير الكمي المطلق في شكل ارتفاع إنتاجية. باستخدام معيار بروتين متاحة تجارياً، نحن قادرون على تحديد المحتوى المطلق لوضع سقف لبروتين الأكتين، مثل جيلسولين (كابج) في عينات البروتين وأعد من ثلاثة أنسجة الماوس المختلفة (الكلي والطحال والبروستاتا) جنبا إلى جنب مع مفصل شرح تفاصيل التجريبية. أننا نقترح التحليل قدب كأسلوب الكمي المطلق للبروتينات الفردية على مستوى الخلايا والأنسجة و immunoblot مريحة، والكمية، وارتفاع إنتاجية. هذا الأسلوب سيساعد إلى حد كبير التحقق من صحة العلامات البيولوجية والتحقق المسار في مختلف مجالات الأبحاث البيولوجية والطبية الحيوية.

ويتطلب تحديد المبلغ المطلق للبروتين أي بما في ذلك البروتين كابج في الأنسجة الماوس جسم معين وبروتين المنقي كمعيار. مجموعة الخطي من تحليلات للبروتين القياسية وليساتيس يحتاج أيضا إلى تكون المنشأة قبل أي تحليل على نطاق واسع. مجموعة الخطي الجسم تعتمد اعتماداً كبيرا على الأجسام المضادة في حد ذاتها، ونطاق التخفيف المناسبة لجسم معين بحاجة إلى التحقق من قبل كل مستخدم على حدة.
ونحن أولاً بتحديد خصوصية جسم كابج في الكلي الماوس، وأنسجة الطحال والبروستاتا باستخدام تحليل لطخة غربية مع المراقبة السلبية (مفتش الحرة جيش صرب البوسنة) ومراقبة إيجابية (بروتين كابج المتاحة تجارياً) (الشكل 1أ). وكان الأجسام المضادة كابج محددة ضد ليساتيس من الماوس الطحال والقلب والعضلات والبروستاتا (الكشف عن عصابة واحدة). نطاقات خاصة بعدم لوحظت في ليساتيس من الكلي والكبد. ولكن في الكلي ليساتي، العصابات غير محددة كانت أضعف إلى حد كبير من الفرقة محددة، مما يوحي الجسم مناسبة لتحليل أنسجة الكلي. المقبل، حددت مجموعة خطية من البروتين القياسي ومقداره ليساتيس للتحاليل منحنيين الجرعة جنبا إلى جنب. بروتين كابج متاحة تجارياً كان متسلسل المخفف كما هو مبين في الجدول 1 على أساس تجاربنا الماضية، وليساتيس النسيج الكلي الماوس، والطحال والبروستاتا قد تضعف أيضا استناداً إلى كمية البروتين الكلي في ليساتيس تحديد من مجموعة أدوات تحديد مجموع بروتين اتفاق التعاون الأساسي. دراستان الجرعة يؤديها جنبا إلى جنب وتآمروا معا في الشكل 1ب. تم اختيار المقدار المناسب من ليساتيس الماوس الكلي والطحال والبروستاتا استناداً إلى إشارات قدب تقاس بالقارئ الميكروسكوبية في وحدة تعسفية. ويرد في الجدول 3القراءة الأصلية لهذه التجربة.
في الخطوة الأخيرة، ومستوى البروتين كابج المخفف متسلسل وليساتيس من الماوس الكلي، الطحال والبروستاتا وقد حملت لوحة قدب. وفي هذه الحالة، اخترنا لتحميل 0.3 ميكروغرام/عينة ليساتيس من الماوس الكلي والطحال و 1 ميكروغرام/عينة ليساتيس من تحليل البروستاتا الماوس، كما في هذه المستويات، قراءة قدب كان في الأقل ضعفا على الخلفية بينما جيدا داخل نطاق التحليل الخطي استناداً إلى منحنى الجرعة ليساتيس والبروتين القياسية. تعرض اللوحة للبروتوكول قدب وصف قبل كان كمياً اللوحة مباشرة من قبل القارئ الميكروسكوبية. استخدام البروتين كابج المنقي المخفف متسلسل، يمكن أن نقرر أن منحنى استجابة لجرعة، والمعادلة و R2 بتحليل الانحدار البسيط باستخدام البرمجيات المتاحة (مثل Microsoft office excel). قدب إشارات من ليساتيس من الماوس الكلي، الطحال والبروستاتا وتحويلها إلى كمية البروتين كابج في هذه ليساتيس باستخدام المعادلة الثابتة المطلقة، والنتائج التي تم تصحيحها بمقدار البروتين الكلي، وفي هذه الحالة، 0.3 ميكروغرام ليساتيس من ماوس الطحال والكليتين، 1 ميكروغرام ليساتيس من البروستاتا الماوس، لتركيز البروتين كابج في هذه الأنسجة النهائي كجزء من الغرام/ميكروغرام. يتم إظهار النتائج في الشكل 1ج مع القراءة الأصلية المبينة في الجدول 4-
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> الشكل 1 . الممثل نتيجة لتحليل قدب لتحديد مستويات كابج المطلقة في ثلاثة أنسجة الماوس (الكلي والطحال والبروستاتا). ألف دراسة خصوصية جسم كابج مكافحة أرنب باستخدام الماوس الأنسجة ليساتيس أعد من الطحال، القلب والعضلات، والكلى، والكبد والبروستاتا باستخدام الغربية لطخة تحليل مع المراقبة السلبية (مفتش الحرة جيش صرب البوسنة) ومراقبة إيجابية (تجارياً تتوفر كابج البروتين). ب تعريف تحليلات مجموعة خطية من قدب جسم كابج مكافحة الأرانب استخدام ليساتيس أعد من البروستات، تنقية الكلي والطحال، واستخدام المؤتلف البروتين كابج القياسية. وكانت النتائج في متوسط تريبليكاتيس. جيم التصميم المطلق من مستويات كابج في ليساتيس إعداد من الماوس الكليتين، والطحال، والبروستاتا. يمثل كل شريط نسيج واحد من ماوس فردية. وكانت النتائج متوسط ثلاث نسخ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> الجدول 3: نتيجة للقارئ الميكروسكوبية لدراسات الجرعات باستخدام كلا تضعف على نحو متسلسل، ليساتيس المجمعة من الماوس الطحال والكليتين، والبروستاتا وتنقية البروتين كابج المؤتلف.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
الجدول 4: نتيجة الميكروسكوبية للقارئ تحليل قدب مستوى كابج المطلقة في الكليتين الماوس (8) والطحال (4) والبروستاتا (5) استخدام بروتين كابج المؤتلف كمعيار.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB at JoVE.com

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

هنا نظهر عملية مفصلة للتحليل الكمي دوت وصمة عار (قدب) بتحديد مضمون مطلق من البروتين المستهدف، وضع سقف لبروتين الأكتين، مثل جيلسولين (كابج)، في ثلاث ماوس مختلف الأنسجة. علينا أن نظهر بإنتاجية عالية، وتقنية إيمونوبلوت مريحة، والكمية للتحقق من صحة العلامات البيولوجية على مستوى الخلايا والأنسجة و.

إنتاجية عالية، وتحديد محتوى البروتين المحددة في مستويات الأنسجة باستخدام نقطة الكمية المطلقة لطخة تحليل (قدب)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

بروتين طريقة التحضير لتحديد إنتاجية عالية من البروتينات التفاعل مع العامل المساعد النووية عن طريق LC-MS / MS تحليل

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

تحديد المحتوى فيكوبيليبروتين في سيانوباكتيريوم سينيتشوسيستيس سبيكتروفوتوميتريك

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

إثراء جزيئات البروتين الدهني الأصلي مع ميكرورنا والتحديد اللاحق لمحتوياتها المطلقة/النسبية ميكرورنا ومعدل نقلها الخلوي

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

مراقبة ديناميكيات تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي في الجسم الحي بدقة زمنية عالية باستخدام χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

نظام تنقية البروتين عالي الإنتاجية اقتصادي ومتعدد الاستخدامات باستخدام محول لوحة متعدد الأعمدة

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...