Name: high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af Taishan lærde konstruktion Engineering (G.T.), de Shandong fremragende unge videnskabsmand Award (ZR2016JL026 til G. T.), National Natural Science Foundation of China (31771284, 3167070448 og 81641108), Shandong provinsens naturlige Science foundation (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provinsens videnskab og teknologi Plan (J14LE01 og J15LK03), Yantai videnskab og teknologi plan(2015ZH083) og Binzhou medicinske universitet videnskabelige forskningsmidler (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), det svenske Forskningsråd give 621-2011-4423 og 2015-4870. Dette arbejde er også sponsoreret af "Yantai dobbelt hundrede Talent Plan" og "Yantai Hi-Tech Zone blå Ocean Talent Plan".

Alle dyr procedurer blev foretaget i overensstemmelse med Binzhou medicinske universitet dyr brug direktiv og godkendt af den etiske gennemgang bestyrelse Binzhou medicinske universitet.
1. Prøvetilberedning
<ol><li>Tages en 1,5 mL Tube 50 mg mus væv. Tilføje 200 µL lysisbuffer (50 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1% Triton X-100, 10% glycerol), suppleret med protease og fosfatase hæmmere (100 mM NaF, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluor 5 µg/mL pepstatin 10 µg/mL leupeptin, og 5 µg/mL aprotinin).</li>
	<li>Homogeniseres væv med en homogeniseringsapparat i 1 minut på isen.</li>
	<li>Der centrifugeres i 10 min på 8 000 x g ved 4 ° C.</li>
	<li>Indsamle supernatanten til nye rør (1,5 mL) og tage ud 1 µL til protein koncentration assay med BCA kit. Bemærk: Alle de almindeligt anvendte lysis buffere for western blot analyse og Dot skamplet analyse kan anvendes til QDB analyse.</li>
</ol>2. fastlæggelse af specifikke antistof
<ol><li>Forberede prøve lysates (20 µg) i afsnit 1.4, IgG gratis BSA (20 µg), standard protein (600 pg), til western blot analyse. Bemærk: IgG gratis BSA er brugt som en negativ kontrol og den standard protein bruges som positiv kontrol. Specificiteten af antistoffet er påvist ved at vise et band af rigtige størrelse ved hjælp af western blot analyse.</li>
</ol>3. definere det lineære område af QDB analysen
<ol><li>Opløse den standard protein med ddH2O. Dilute protein til en koncentration af 1.200 pg/µL.</li>
	<li>Fortynd den koncentrerede protein fra de forberedte prøver i afsnit 1.4 til 4 µg/µL.</li>
	<li>Opløse BSA med ddH2O. Dilute protein til en koncentration af 1.200 pg/µL og 4 µg/µL.</li>
	<li>En serie af fortynding af standard protein og forberedte prøver blev udarbejdet med vejledning af tabel 1 og tabel 2.</li>
	<li>Mix 10 µL fortynding standard protein eller fortynding forberedt prøver og 10 µL 2 x loading bufferen (120mM Tris-HCl pH 6,8, 20% Glycerol, 4% SDS, 0,2% Bromphenol blå, 200 mM DTT) sammen.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg/µl)</td>
			<td>S2 (33.3pg / µl)</td>
			<td>S3 (100pg/µl)</td>
			<td>S3 (300pg/µl)</td>
			<td>S5 (600pg/µl)</td>
			<td>S6 (1200pg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>standard protein(1200pg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>1,39</td>
			<td>4.17</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG gratis BSA (4pg/µl)</td>
			<td>50</td>
			<td>48.61</td>
			<td>45.83</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>i alt</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Fortynding ordning for standard protein kurve.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0µg/µl)</td>
			<td>X2 (0.25µg / µl)</td>
			<td>X3 (0.5µg / µl)</td>
			<td>X4 (1µg/µl)</td>
			<td>X5 (2µg/µl)</td>
			<td>X6 (4 µg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sample(4µg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>3.125</td>
			<td>6,25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG gratis BSA(4µg/µl)</td>
			<td>50</td>
			<td>46.875</td>
			<td>43.75</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>i alt</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Fortynding ordningen for rede prøver
<ol start="6"><li>Varme blandinger på 85 ° C i 5 min.</li>
</ol>4. proces for QDB analyse
<ol><li>
Eksempelprogrammet
	<ol>
<li>Støtte QDB pladen for at undgå bunden af pladen at berøre overfladen af bordet. For eksempel bruge en tom pipette tip box som støtte.</li>
		<li>Ilæg op til 2 µL af prøven til midten af membran i bunden af den enkelte enhed af QDB pladen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tørring pladen
	<ol>
<li>Forlade den indlæste QDB plade for 1 h på værelse tempereret (RT) eller som alternativ forlade den indlæste plade ved 37 ° C i 15 min i et velventileret rum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blokering af pladen
	<ol>
<li>Dyp QDB plade i overførsel buffer (0,039 M Glycin, 0,048 M Tris, 0,37% SDS, 20% methyl alkohol) og Ryst forsigtigt plade for 10 s.</li>
		<li>Skyl QDB pladen forsigtigt med TBST (Tris-bufferet saltvand, 0,1% Tween 20) tre gange, og derefter vaske plade i 5 min i TBST under konstant omrystning.</li>
		<li>Blokere QDB pladen med blokerende buffer (5% nonfat mælk i TBST (100 µL/brønd) for 1 h under konstant omrystning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Primære antistof inkubation
	<ol>
<li>Fortynd den primære antistof i den blokerende buffer på en valgte koncentration (fra 1:500 til 1:5 000), og tilsæt 100 µL til hver enkelt brønd af en almindelig 96 godt plade. Indsætte QDB pladen i 96 godt pladen og Inkuber de kombinerede plader enten for 2 h i RT eller natten over ved 4 ° C under konstant omrystning.</li>
		<li>Alternativt QDB pladen anbringes inde i en boks, og udfylde boksen med blokerende buffer 2 til 3 mm over membran del af pladen, hvis den samme antistof bruges til hele pladen. Tilføj de primære antistof på den valgte koncentration, og Inkuber plade enten for 2 h i RT eller natten over ved 4 ° C ved under konstant omrystning.</li>
		<li>Skyl pladen forsigtigt med TBST for tre gange, før det er vasket med TBST for tre gange, hver gang i 5 min. under konstant omrystning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sekundær antistof inkubation
	<ol>
<li>Fortynd den sekundær antistof i den blokerende buffer på den valgte koncentration (fra 1:1, 000 til 1:50, 000), og enten alikvot 100 µL/brønd i en 96 godt plade eller i en kasse som beskrevet i afsnit 4.4.2, og derefter inkuberes QDB pladen inde enten den indlæste 96 godt pla te eller boksen for 1 h i RT under konstant omrystning.</li>
		<li>Skylles QDB pladen forsigtigt 3 gange med TBST, dernæst pladen for 3 gange, 5 min hver med TBST under konstant omrystning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kvantificering
	<ol>
<li>Forberede udvidet kemiluminescens substrat (ECL) ved at følge producentens anvisninger.</li>
		<li>Alikvot ECL substrat i en 96 godt plade (100 µL/brønd) og Indsæt QDB pladen inde 96 godt pladen i 2 min. under konstant omrystning.</li>
		<li>Fjerne QDB pladen fra 96 godt plade og ryste kort for at fjerne den overskydende væske. Placere plade på en hvid mikrotiter tallerken.</li>
		<li>Tænd mikrotiterplade læseren, og vælg "plade med cover" på brugergrænsefladen før du placerer de kombinerede plader (QDB plade + hvid plade adapter) inde mikrotiterplade læseren for kvantificering. Bemærk: Sørg for at bruge den hvide, uigennemsigtige mikrotiter plade som en adapter til at undgå enhver indblanding fra pladen. Sørg for at vælge "plade med cover" for at undgå jamming maskinen når kombineret plader (QDB plade + 96 godt plade adapter) er placeret inde mikrotiterplade læseren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proposal+for+validation+of+antibodies.">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li><li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies.">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li><li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA).+Quantitative+assay+of+immunoglobulin.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li><li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen,+immunoglobulin+G,+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes.">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li><li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front.">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li><li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+array:+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells.">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li><li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations.">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+dot+blot+analysis+(QDB),+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method.">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li></ol>

Forfatterne Yunyun Zhang, Wenfeng Zhang og Jiandi Zhang er medarbejdere i Zestern Biotechniques der producerer QDB plader anvendes i denne artikel. Wenfeng Zhang og Yunyun Zhang erklære interessekonflikt, og Jiandi Zhang har indgivet patentansøgninger. De andre hævder ingen konkurrerende interesser.

Blandt alle de aktuelle tilgængelige immunassay teknikker til proteinanalyse undtagen ELISA er QDB analyse den eneste metode til at opnå absolutte indhold af et specifikt protein på cellulære og væv niveauer i et format, høj overførselshastighed. Selvom med stabil isotop-mærket standard, massespektrometri er stand til at opnå absolut kvantificering af nogle proteiner, er denne metode endnu ikke udviklet til høj overførselshastighed ydeevne. I denne undersøgelse viste vi processen med QDB analyse at opnå absolut bestemmelse af CAPG protein niveau i mus væv, herunder nyrer, milt og prostata. CAPG niveauer fandtes for at være mellem 200 til 360 pg/g i mus nyre væv, 460 til 650 pg/g i mus milt og 330 til 390 pg/g i mus prostata væv.
I forhold til ELISA, kræver QDB analyse minimum indsats skal udvikles i en regelmæssig lab. Først, QDB pladen er en baseret på nitrocellulose membran til at fjerne belægning trin i ELISA. Andet, QDB analyse kun kræver én i stedet for to specifikke antistoffer i en sandwich ELISA. For det tredje, høj bindende kapacitet nitrocellulose membran i forhold til ELISA plade overflade også tillader membran til at modstå strenge vask trin typisk bruges i immunblot analyse til at reducere baggrund indblandingen. Denne funktion er meget nyttig i at analysere komplicerede lysates fremstillet af celler og væv. I modsætning hertil på grund af den relativt lave bindende kapacitet af ELISA-plader bliver reduktion af baggrunden da analysere komplicerede cellulære og væv lysates en reel udfordring i den udviklingsmæssige proces.
QDB analyse kan vedtages let i enhver lab med adgang til et specifikt antistof. Det er dog vigtigt at nævne, at antistoffet specificitet er et relativt begreb, begrænset af faktorer, herunder arternes, vævstyper og celletyper. Som vist i figur 1A, CAPG antistof er specifik, når du analyserer lysate fra mus nyrer, milt og prostata, og endnu bliver ikke-specifikke, når du analyserer mus lever. I virkeligheden, fandt vi rutinemæssigt en antistof at være specifikke for en vævstype, men ikke altid bestemt til andre væv typer fra samme art. Forudgående western blot analyse er således nødvendige for specificiteten af QDB analysen. Faktisk kan antistoffet relativt specificitet være årsag til falske resultater ofte forbundet med ELISA analyse, som uanset hvor meget indsats for fremstillings-virksomhed kan have brugt for at sikre specificiteten af analysen, de ikke kan udstødning alle mulige typer prøver brugerne kan vælge at analysere ved hjælp af deres ELISA produkter.
Som med alle immunassays, er et potentielt problem med den analysemetode, der er QDB manglen konsistens i kvaliteten af den kommercielle antistof. Selv om den tilsyneladende kvalitet af et antistof fra samme virksomhed (samme butik nummer, osv) er brugt, kan der være store forskelle fra ét køb til en anden på grund af batch til batch variationer. Derfor, medmindre fuld tillid er nået i kvaliteten af den tilgængelige antistof, re kendetegner antistof ved hvert køb er vigtigt.
I sammendrag leverer vi her en detaljeret protokol og et eksempel når du bruger metoden QDB analyse for at opnå absolut kvantitativ bestemmelse af et specifikt protein på niveauet væv. Vi viser, at metoden QDB analyse er et praktisk værktøj for alle, der er interesseret i høj overførselshastighed, kvantitative immunblot analyse. Dens evne til at opnå absolut bestemmelse af indholdet af et specifikt protein på cellulære og væv plan også skelne denne teknik fra traditionelle immunblot teknikker. Denne funktion giver mulighed for kombination og sammenligning af resultater fra flere analyser, et skridt nødvendigt især i større befolkning undersøgelser og realisering af relevante association studier på protein-niveau i den nærmeste fremtid.

Sammen med de spændende fremskridt inden for genomforskning i de seneste år, vidner biomedicinsk forskningsfelt også den betydelige fremgang i proteom forskning. Med stigende akkumulering af biologiske data på begge genomisk og proteom niveauer, ved hjælp af bioinformatic værktøjer til at analysere disse data er blevet fokus for biomedicinsk forskning i fremtidens iagttages. Derfor succes af bioinformatical forskning rejser krav om mere og bedre kvalitet af data fra Fællesskabets biologiske og biomedicinsk forskning, en opgave kan kun opnås gennem teknik avancement på genomisk og proteom niveauer.
Massespektrometri (MS) og immunblot analyse er to fremherskende teknikker til proteinanalyse i øjeblikket. MS har domineret proteom forskning i de seneste år at aktivere analyse af tusindvis af individuelle proteiner samtidigt. De immunblot-baserede teknikker, herunder vestlige skamplet og dot skamplet, på den anden side har også spillet en betydelig rolle i protein forskning selv siden sin opfindelse1,2,3,4, 5. Enzym forbundet immunosorbent assay (ELISA)5,6,7 og omvendt fase protein microarray (RPPM)8,9 kan anses for høj overførselshastighed format af immunblot analyse. Men alle disse immunassay metoder, undtagen ELISA, måle relative udtryk niveauet af et specifikt protein. Den relative karakter af disse metoder vil blive et reelt problem for befolkningen undersøgelser, som analysen skal ske på samme tid, at forhindre enhver indsats for at øge Gruppestørrelse gennem flere analyser. Resultaterne fra disse undersøgelser er desuden kun semi-kvantitative, således vanskeliggør enhver Bioinformatik indsats i dataanalyse. I mellemtiden, selv om ELISA er velegnet til høj overførselshastighed absolutte analyse af protein prøver, denne teknik synes at møde udfordringer i komplekse miljøer såsom celler eller væv på grund af sin lave bindende kapacitet og multiplexing10.
Vi har udviklet en immunblot metode egnet til befolkningen undersøgelser med Nøglekarakteristika for at være praktisk, høje overførselshastighed, kvantitative, og egnet til absolut bestemmelse af proteinindhold, og navngivet denne teknik kvantitative dot skamplet analyse (QDB)11. I denne undersøgelse, vi præsenterer en detaljeret protokol for QDB analyse og påvise metoden ved bestemmelse af det absolutte proteinindholdet af et bestemt protein, CAPG, i tre forskellige mus væv, herunder nyrer, milt og prostata. Vi mener, at denne detaljerede protokollen godt illustrerer gennemførlighed og bekvemmelighed af denne metode, og vejlede om hvordan man undgår de potentielle faldgruber i praksis af denne metode.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:911px;" width="910">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:220px;">Tecan</td>
			<td style="width:177px;">Tecan Infinite 200 PRO</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:283px;">QDB plate</td>
			<td style="width:220px;">Yantai Zestern Co.Ltd</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:231px;">Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:283px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)</td>
			<td style="width:220px;">jackson</td>
			<td style="width:177px;">&#160;711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Enhanced chemiluminesence substrate</td>
			<td style="width:220px;">Thermo</td>
			<td style="width:177px;">32134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Rabbit anti-CAPG&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-T52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">CAPG protein</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-HNAE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hepes</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Nacl</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">10461220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Mgcl2</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">20120802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EDTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">E9884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EGTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">BNN1913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Na2P2O7</td>
			<td style="width:220px;">Haituo Chinese medicine test</td>
			<td style="width:177px;">20160914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Glycerol</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">P7626-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pepstatin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">Z290033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">leupeptin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aprotinin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">A3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris-Hcl</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">SDS</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L5750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">DTT</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Bromphenol Blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">B-0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">NaF</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)

Mangler en bekvem, hæmmer kvantitative, høje overførselshastighed immunblot metode for absolut bestemmelse af indholdet af et specifikt protein på cellulære og væv niveau betydeligt fremskridt i proteom forskning. Resultaterne stammer fra aktuelt tilgængelige immunblot teknikker er også relativ, forhindrer ethvert forsøg på at kombinere uafhængige undersøgelser med en omfattende analyse af protein prøver. I denne undersøgelse viser vi processen med kvantitative dot skamplet analyse (QDB) at opnå absolut kvantificering i et format, høj overførselshastighed. Brug en kommercielt tilgængelig protein standard, er vi i stand til at bestemme det absolutte indhold af udjævningen actin protein, gelsolin-lignende (CAPG) i protein prøver fremstillet af tre forskellige mus væv (nyrer, milt og prostata) sammen med en detaljeret forklaring af de eksperimentelle detaljer. Vi foreslår QDB analyse som en praktisk, kvantitative, høje overførselshastighed immunblot metode til absolut kvantificering af individuelle proteiner på niveauet cellulære og væv. Denne metode vil kraftigt støtte biomarkør valideringogverificering pathway i forskellige områder af biologiske og biomedicinsk forskning.

Bestemmelse af den absolutte beløb for et protein, herunder CAPG protein i mus væv kræver både et specifikt antistof og et oprenset protein som standard. Det lineære område af analyser af både protein standard og lysates skal også være etableret før nogen omfattende analyse. Det lineære område af antistoffet er stærkt afhængige af antistoffet i sig selv, og rækken passende fortynding af et specifikt antistof skal kontrolleres ved hver enkelt bruger.
Vi først bestemmes specificiteten af CAPG antistof i musenyre, milt og prostata væv ved hjælp af western blot analyse med den negative kontrol (IgG gratis BSA) og positiv kontrol (kommercielt tilgængelig CAPG protein) (fig. 1A). Anti-CAPG antistoffer var specifikt mod lysates fra mus milt, hjerte, muskel og prostata (et band opdaget). Ikke-specifikke bands blev observeret i lysates fra nyrerne og leveren. Men i nyre lysate, uspecifikke bands var væsentligt svagere end de bestemt frekvensbånd, hvilket tyder på, at antistof er velegnet til nyre væv analyse. Næste, den lineære område af standard protein og mængden af lysates analyser blev bestemt af to side om side dosis kurver. En kommercielt tilgængelig CAPG protein var seriefremstillede fortyndet som angivet i tabel 1 baseret på vores tidligere erfaringer og væv lysates af mus nyrerne, milt og prostata var også fortyndet baseret på mængden af total protein i lysates fastsættes af en BCA total protein bestemmelse kit. To dosis undersøgelser blev udført sideløbende og afbildet sammen i figur 1B. Den passende mængde lysates af mus nyrer, milt og prostata blev valgt på grundlag af de QDB signaler målt ved mikrotiterplade læseren i vilkårlig enhed. Den oprindelige læsning for dette eksperiment er vist i tabel 3.
I det sidste trin, seriefremstillede fortyndet CAPG protein standarden og lysates fra musenyre, blev milt og prostata indlæst på QDB pladen. I dette tilfælde valgte vi at belastning 0,3 µg/prøve for lysates fra musenyre og milt og 1 µg/prøve for lysates fra mus vurderede analyse, som på disse niveauer, QDB læsningen var på mindst 20-fold i baggrunden mens godt inden for det lineære område af analysen baseret på dosis kurve i både lysates og protein standard. Pladen blev udsat for den beskrevne QDB protokol før pladen var tal direkte af mikrotiterplade læseren. Bruger de seriefremstillede fortyndet renset CAPG protein, kunne vi etablere en dosis-respons kurve, ligning og R2 ved simpel regressionsanalyse ved hjælp af tilgængelige software (f.eks Microsoft office excel). QDB signaler fra lysates af mus nyrer, milt og vurderede blev omdannet til det absolutte beløb af CAPG protein i disse lysates ved hjælp af etablerede ligning, og resultaterne blev korrigeret af total protein beløb, i dette tilfælde 0,3 µg for lysates fra musen milt og nyrer og 1 µg for lysates fra mus prostata, for den endelige koncentration af CAPG protein i disse væv som pg/µg. Resultaterne er vist i figur 1C med den oprindelige læsning vist i tabel 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> Figur 1 . Repræsentative resultatet af en QDB analyse til at bestemme de absolutte CAPG niveauer i tre mus væv (nyrer, milt og prostata). A. undersøge specificiteten af kanin anti-CAPG antistof ved hjælp af musen væv lysates forberedt fra milt, hjerte, muskel, nyre, lever og prostata ved hjælp af vestlige duppes analyse med den negative kontrol (IgG gratis BSA) og positiv kontrol (kommercielt tilgængelige CAPG protein). B. definition af lineære vifte af QDB analyser af kanin anti-CAPG antistof ved hjælp af lysates fremstillet af prostata, renset nyrer, milt, og ved hjælp af rekombinante CAPG protein standard. Resultaterne var et gennemsnit af tre. C. absolut bestemmelse af CAPG niveauer i lysates fremstillet af musen nyrer, milt og prostata. Hver søjle repræsenterer en væv fra en enkelt mus. Resultaterne var gennemsnittet af tre eksemplarer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> Tabel 3: Skyldes mikrotiterplade læser af dosis undersøgelser ved hjælp af både seriefremstillede fortyndet, samlet lysates fra mus milt, nyrer, og prostata og renset rekombinante CAPG protein.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
Tabel 4: Resultat fra mikrotiterplade læser af QDB analysen af den absolutte CAPG niveau i mus nyrerne (8), milt (4) og prostata (5) anvendelse af en rekombinant CAPG protein som standard.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB at JoVE.com

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Her viser vi en detaljeret proces af kvantitative dot skamplet analyse (QDB) ved at bestemme det absolutte indhold af en målrettet protein, udjævningen actin protein, gelsolin-lignende (CAPG), i tre forskellige mus væv. Vi demonstrere en høj produktivitet, praktisk, kvantitative immunblot teknik til biomarkør validering på niveauet cellulære og væv.

Høj overførselshastighed, absolut bestemmelse af indholdet af en markeret Protein i væv niveauer ved hjælp af kvantitative Dot duppes analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

En Protein Forberedelse Metode til High-throughput Identifikation af proteiner Samspil med en Nuclear Cofactor Brug LC-MS / MS-analyse

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse af glycogenindholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestemmelse af Phycobiliprotein indhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning af Protein niveauer på tværs af væv og udvikling ved hjælp af standardiserede kvantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Berigelse af Native lipoprotein partikler med microRNA og efterfølgende bestemmelse af deres absolutte/relative microRNA indhold og deres cellulære overførselshastighed

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Anvendelse af mikroskala termoforese til måling af protein-lipid interaktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Et økonomisk og alsidigt proteinrensningssystem med høj gennemløb ved hjælp af en pladeadapter med flere kolonner

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...