Name: high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 10 s
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यह काम Taishan जनाब कंस्ट्रक्शन इंजीनियरिंग (ग्राम विशनोई), शेडोंग उत्कृष्ट युवा वैज्ञानिक पुरस्कार (ZR2016JL026 टू जी. टी.), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१७७१२८४, ३१६७०७०४४८, और ८१६४११०८), शेडोंग प्रांतीय प्राकृतिक द्वारा समर्थित है । विज्ञान फाउंडेशन (ZR2016JL026, 2017GSF18103), शेडोंग प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (J14LE01 और J15LK03), Yantai विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (2015ZH083) और Binzhou चिकित्सा विश्वविद्यालय के वैज्ञानिक अनुसंधान कोष (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), स्वीडिश अनुसंधान परिषद अनुदान 621-2011-4423 और 2015-4870 । यह काम "Yantai डबल सौ प्रतिभा योजना" और "Yantai हाई-टेक जोन ब्लू महासागर टैलेंट प्लान" द्वारा भी प्रायोजित है ।

सभी पशु प्रक्रियाओं Binzhou चिकित्सा विश्वविद्यालय पशु उपयोग निर्देश के साथ लाइन में किए गए थे और Binzhou चिकित्सा विश्वविद्यालय के एथिकल रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित ।
1. नमूना तैयारी
<ol><li>लो ५० मिलीग्राम माउस ऊतक में एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब । Add २०० µ l lysis बफर (५० mM Hepes, पीएच ७.४, १३७ मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, 5 मिमी EGTA, 1 मिमी MgCl2, 10 मिमी ना2P2O7, 1% ट्राइटन एक्स-१००, 10% ग्लिसरॉल), को छेड़ने और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ पूरक (१०० mm NaF, ०.१ mm phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड, 5 µ g/ml pepstatin, 10 µ g/मब leupeptin, 5 µ g/मब aprotinin) ।</li>
	<li>Homogenize एक homogenizer के साथ एक बर्फ पर 1 मिनट के लिए ऊतक ।</li>
	<li>4 डिग्री सेल्सियस पर ८ ००० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।</li>
	<li>नई ट्यूबों (१.५ मिलीलीटर) में supernatant लीजिए और बीसीए किट के साथ प्रोटीन एकाग्रता परख के लिए बाहर ले 1 µ एल । नोट: पश्चिमी दाग विश्लेषण और डॉट ब्लाट विश्लेषण के लिए सभी आमतौर पर इस्तेमाल किया lysis बफ़र्स QDB विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।</li>
</ol>2. एंटीबॉडी की विशिष्टता का निर्धारण
<ol><li>पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए नमूना lysates (20 µ ग्राम) धारा १.४, आईजीजी मुक्त BSA (20 µ ग्राम), मानक प्रोटीन (६०० स्नातकोत्तर), में तैयार करें । नोट: आईजीजी मुक्त BSA एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है और मानक प्रोटीन एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है । एंटीबॉडी की विशिष्टता पश्चिमी दाग विश्लेषण का उपयोग कर सही आकार के एक बैंड दिखाकर प्रदर्शन किया है ।</li>
</ol>3. QDB विश्लेषण की रेखीय सीमा को परिभाषित करना
<ol><li>ddH2ओ के साथ मानक प्रोटीन भंग १,२०० स्नातकोत्तर/µ एल की एकाग्रता के लिए प्रोटीन को पतला करें ।</li>
	<li>धारा १.४ में तैयार नमूनों से केंद्रित प्रोटीन को पतला करने के लिए 4 µ g/µ l</li>
	<li>ddH2ओ के साथ BSA को भंग करना प्रोटीन को १,२०० pg/µ l और 4 µ g/µ l की एकाग्रता के लिए पतला करें ।</li>
	<li>मानक प्रोटीन और तैयार नमूनों के कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला 1 और तालिका 2तालिका के मार्गदर्शन के साथ तैयार किया गया ।</li>
	<li>मिश्रण 10 µ एल कमजोर पड़ने मानक प्रोटीन या कमजोर पड़ने नमूनों तैयार और 10 µ एल 2x लोड हो रहा है बफर (120mM Tris-एचसीएल पीएच ६.८, 20% ग्लिसरॉल, 4% एसडीएस, ०.२% Bromphenol ब्लू, २०० mM डीटीटी) एक साथ ।</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg/µ l)</td>
			<td>S2 (33.3 pg/µ एल)</td>
			<td>S3 (100pg/µ l)</td>
			<td>S3 (300pg/µ l)</td>
			<td>S5 (600pg/µ l)</td>
			<td>S6 (1200pg/µ l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>मानक प्रोटीन (1200pg/µ l)</td>
			<td>0</td>
			<td>१.३९</td>
			<td>४.१७</td>
			<td>१२.५</td>
			<td>25</td>
			<td>५०</td>
		</tr>
<tr>
<td>आईजीजी इव BSA (4pg/µ l)</td>
			<td>५०</td>
			<td>४८.६१</td>
			<td>४५.८३</td>
			<td>३७.५</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>कुल</td>
			<td>५०</td>
			<td>५०</td>
			<td>५०</td>
			<td>५०</td>
			<td>५०</td>
			<td>५०</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1. मानक प्रोटीन वक्र के लिए कमजोर पड़ने की योजना है ।
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0 µ g/µ l)</td>
			<td>X2 (0.25 µ g/µ l)</td>
			<td>X3 (0.5 µ g/µ l)</td>
			<td>X4 (1 µ g/µ l)</td>
			<td>X5 (2 µ g/µ l)</td>
			<td>X6 (4 µ g/µ l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>नमूना (4 µ g/µ l)</td>
			<td>0</td>
			<td>३.१२५</td>
			<td>६.२५</td>
			<td>१२.५</td>
			<td>25</td>
			<td>५०</td>
		</tr>
<tr>
<td>आईजीजी इव BSA (4 µ g/µ l)</td>
			<td>५०</td>
			<td>४६.८७५</td>
			<td>४३.७५</td>
			<td>३७.५</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>कुल</td>
			<td>५०</td>
			<td>५०</td>
			<td>५०</td>
			<td>५०</td>
			<td>५०</td>
			<td>५०</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2. तैयार नमूनों के लिए कमजोर पड़ने वाली योजना
<ol start="6"><li>5 मिनट के लिए ८५ ° c पर मिश्रण गर्मी ।</li>
</ol>4. QDB विश्लेषण की प्रक्रिया
<ol><li>
नमूना आवेदन
	<ol>
<li>मेज की सतह को छूने प्लेट के नीचे से बचने के लिए QDB प्लेट का समर्थन करें । उदाहरण के लिए, समर्थन के रूप में एक खाली पिपेट टिप बॉक्स का उपयोग करें ।</li>
		<li>QDB प्लेट के व्यक्तिगत इकाई के तल पर झिल्ली के केंद्र के लिए नमूने के 2 µ एल करने के लिए लोड ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>
प्लेट सुखाने
	<ol>
<li>कमरे शीतोष्ण (आरटी) में 1 ज के लिए भरी हुई QDB प्लेट छोड़ दो या एक विकल्प के रूप में एक अच्छी तरह हवादार अंतरिक्ष में 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर भरी हुई थाली छोड़ दें ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>
प्लेट को अवरुद्ध
	<ol>
<li>स्थानांतरण बफर में QDB प्लेट डुबकी (०.०३९ एम Glycine, ०.०४८ एम Tris, ०.३७% एसडीएस, 20% मिथाइल शराब) और धीरे से 10 एस के लिए थाली हिला ।</li>
		<li>TBST के साथ धीरे QDB प्लेट कुल्ला (Tris-खारा, ०.१% 20 के बीच) तीन बार, और फिर लगातार मिलाते के तहत TBST में 5 मिनट के लिए थाली धो लो ।</li>
		<li>अवरुद्ध बफर के साथ QDB प्लेट ब्लॉक (5% TBST में नोनफेट दूध (१०० µ एल/) 1 एच के लिए लगातार मिलाते के तहत ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>
प्राथमिक एंटीबॉडी की मशीन
	<ol>
<li>एक चुना एकाग्रता (1:500 से 1:5 000) में अवरुद्ध बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला, और एक साधारण ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक व्यक्ति के लिए १०० µ एल जोड़ें । ९६ अच्छी तरह से थाली में QDB प्लेट डालें और संयुक्त प्लेटें या तो या आरटी पर 2 एच के लिए रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर लगातार मिलाते के तहत ।</li>
		<li>वैकल्पिक रूप से, एक बॉक्स के अंदर QDB प्लेट रखें, और एक ही एंटीबॉडी पूरी थाली के लिए इस्तेमाल किया जाता है अगर प्लेट की झिल्ली हिस्से के ऊपर 2 से 3 मिमी अवरुद्ध बफर के साथ बॉक्स भरें । चुना एकाग्रता पर प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें, और लगातार झटकों के तहत द्वारा आरटी या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए या तो गर्मी ।</li>
		<li>तीन बार के लिए TBST से धोया पहले TBST के साथ प्लेट धीरे कुल्ला, लगातार झटकों के तहत 5 मिनट के लिए हर बार ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>
माध्यमिक एंटीबॉडी की मशीन
	<ol>
<li>चयनित एकाग्रता (1:1, 000 से 1:50, 000), और या तो aliquot १०० µ l/अच्छी तरह से एक ९६ प्लेट में या एक बॉक्स में खंड 4.4.2 में वर्णित के रूप में, और फिर QDB प्लेट के अंदर या तो भरी हुई है के रूप में एक बक्से में ब्लॉक बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला ते या बॉक्स के लिए 1 RT में लगातार मिलाते के तहत एच ।</li>
		<li>QDB प्लेट धीरे कुल्ला TBST के साथ 3 बार, तो 3 बार, 5 मिनट लगातार मिलाते के तहत TBST के साथ प्रत्येक के लिए थाली धो लो ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ठहराव
	<ol>
<li>निर्माता के निर्देशों का पालन करके एन्हांस्ड chemiluminescence सब्सट्रेट (ECL) तैयार करें.</li>
		<li>एक ९६ अच्छी तरह से थाली में Aliquot ECL सब्सट्रेट (१०० µ एल/अच्छी तरह से) और लगातार मिलाते के तहत 2 मिनट के लिए ९६ अच्छी तरह से थाली के अंदर QDB प्लेट डालें ।</li>
		<li>९६ अच्छी तरह से थाली से QDB प्लेट निकालें और संक्षेप में शेक अतिरिक्त तरल हटाने के लिए । प्लेट को सफेद microtiter प्लेट पर रखें ।</li>
		<li>microplate रीडर पर बारी, और ठहराव के लिए microplate रीडर के अंदर संयुक्त प्लेटों (QDB प्लेट + सफेद प्लेट अनुकूलक) रखने से पहले यूजर इंटरफेस पर "कवर के साथ थाली" का चयन करें । नोट: थाली से किसी भी व्यवधान से बचने के लिए एक अनुकूलक के रूप में सफेद, गैर पारदर्शी microtiter प्लेट का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें । मशीन जब संयुक्त प्लेटें ठेला से बचने के लिए "कवर के साथ थाली" का चयन करने के लिए सुनिश्चित करें (QDB प्लेट + ९६ अच्छी तरह से प्लेट अनुकूलक) microplate रीडर के अंदर रखा जाता है ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proposal+for+validation+of+antibodies.">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li><li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies.">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li><li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA).+Quantitative+assay+of+immunoglobulin.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li><li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen,+immunoglobulin+G,+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes.">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li><li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front.">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li><li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+array:+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells.">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li><li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations.">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+dot+blot+analysis+(QDB),+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method.">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li></ol>

लेखक Yunyun झांग, Wenfeng झांग और Jiandi झांग Zestern की तकनीक के कर्मचारी हैं जो इस लेख में इस्तेमाल होने वाली QDB प्लेटों का उत्पादन करते हैं. Wenfeng झांग और Yunyun झांग हितों के टकराव की घोषणा, और Jiandi झांग पेटेंट आवेदन दायर किया है । दूसरों को कोई प्रतिस्पर्धी हितों का दावा नहीं है ।

एलिसा के अलावा प्रोटीन विश्लेषण के सभी मौजूदा उपलब्ध immunoassay तकनीकों के अलावा, QDB विश्लेषण एक उच्च प्रवाह प्रारूप में सेलुलर और ऊतक के स्तर पर एक विशिष्ट प्रोटीन की निरपेक्ष सामग्री को प्राप्त करने के लिए एकमात्र तरीका है । स्थिर आइसोटोप के साथ हालांकि-लेबल मानक, मास स्पेक्ट्रोमेट्री कुछ प्रोटीन के निरपेक्ष ठहराव को प्राप्त करने में सक्षम है, इस विधि अभी तक उच्च प्रवाह प्रदर्शन के लिए तैयार नहीं है. इस अध्ययन में, हम QDB विश्लेषण की प्रक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए CAPG गुर्दे, तिल्ली, और प्रोस्टेट सहित माउस के ऊतकों में प्रोटीन स्तर का पूर्ण निर्धारण प्राप्त करने के लिए. CAPG का स्तर २०० से ३६० स्नातकोत्तर के बीच होना पाया गया था, माउस गुर्दे के ऊतकों में, ४६० के लिए ६५० स्नातकोत्तर/जी, और माउस प्रोस्टेट ऊतकों में ३३० से ३९० स्नातकोत्तर/
एलिसा की तुलना में, QDB विश्लेषण एक नियमित प्रयोगशाला में विकसित किए जाने के लिए ंयूनतम प्रयासों की आवश्यकता है । सबसे पहले, QDB प्लेट एक nitrocellulose झिल्ली पर आधारित एलिसा में कोटिंग कदम को खत्म करने के लिए है । दूसरा, QDB विश्लेषण केवल एक सैंडविच एलिसा में दो विशिष्ट एंटीबॉडी के बजाय एक की आवश्यकता है । तीसरे, एलिसा प्लेट सतह की तुलना में nitrocellulose झिल्ली की उच्च बाध्यकारी क्षमता भी झिल्ली कड़े धुलाई कदम आम तौर पर immunoblot विश्लेषण में इस्तेमाल के लिए पृष्ठभूमि हस्तक्षेप को कम करने की अनुमति देता है । यह सुविधा कोशिकाओं और ऊतकों से तैयार जटिल lysates का विश्लेषण करने में बहुत उपयोगी है । इसके विपरीत, एलिसा प्लेटों के अपेक्षाकृत कम बाध्यकारी क्षमता के कारण, जब जटिल सेलुलर और ऊतक lysates विश्लेषण पृष्ठभूमि की कमी विकास की प्रक्रिया में एक असली चुनौती बन जाता है ।
QDB विश्लेषण एक विशिष्ट एंटीबॉडी की पहुंच के साथ किसी भी प्रयोगशाला में आसानी से अपनाया जा सकता है । हालांकि, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि एंटीबॉडी की विशिष्टता एक सापेक्ष शब्द है, प्रजातियों सहित कारकों द्वारा सीमित, ऊतक प्रकार और कोशिका प्रकार. के रूप में 1 चित्रामें दिखाया गया है, CAPG एंटीबॉडी विशिष्ट जब माउस गुर्दे, तिल्ली, और प्रोस्टेट से lysateकाविश्लेषण है, और अभी तक गैर विशिष्ट जब माउस जिगर का विश्लेषण हो जाता है । वास्तव में, हम नियमित रूप से एक एंटीबॉडी एक ऊतक प्रकार के लिए विशिष्ट हो पाया है, लेकिन हमेशा एक ही प्रजाति से अंय ऊतक प्रकार के लिए विशिष्ट नहीं है । इस प्रकार, पूर्व पश्चिमी दाग विश्लेषण QDB विश्लेषण की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । वास्तव में, एंटीबॉडी के सापेक्ष विशिष्टता गलत अक्सर एलिसा विश्लेषण के साथ जुड़े परिणामों का कारण हो सकता है, कोई बात नहीं के रूप में कितना प्रयास विनिर्माण कंपनी के लिए परख की विशिष्टता सुनिश्चित खर्च कर सकते हैं, वे सभी संभव निकास नहीं कर सकते नमूने के प्रकार उपयोगकर्ताओं को अपनी एलिसा उत्पादों का उपयोग कर विश्लेषण चुन सकते हैं ।
सभी immunoassays के साथ के रूप में, QDB विश्लेषण विधि के साथ एक संभावित समस्या वाणिज्यिक एंटीबॉडी की गुणवत्ता की निरंतरता की कमी है । यहां तक कि अगर एक ही कंपनी (एक ही सूची संख्या, आदि) से एक एंटीबॉडी की स्पष्ट गुणवत्ता का प्रयोग किया जाता है, वहां बड़े मतभेद एक खरीद से एक और बैच के लिए बैच परिवर्तनशीलता के कारण हो सकता है । इसलिए, जब तक पूर्ण विश्वास उपलब्ध एंटीबॉडी की गुणवत्ता में प्राप्त है, फिर से हर खरीद पर एंटीबॉडी निस्र्पक महत्वपूर्ण है ।
संक्षेप में, हम यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल और एक उदाहरण प्रदान करते है जब QDB विश्लेषण विधि का उपयोग करने के लिए ऊतक के स्तर पर एक विशिष्ट प्रोटीन का निरपेक्ष मात्रात्मक निर्धारण प्राप्त करते हैं । हम बताते है कि QDB विश्लेषण विधि उच्च प्रवाह, मात्रात्मक immunoblot विश्लेषण में रुचि रखते है जो किसी के लिए एक सुविधाजनक उपकरण है । इसकी क्षमता एक सेलुलर और ऊतक स्तर पर एक विशिष्ट प्रोटीन की सामग्री का निरपेक्ष संकल्प को प्राप्त करने के लिए भी पारंपरिक immunoblot तकनीकों से इस तकनीक को भेद । इस सुविधा के संयोजन और कई विश्लेषण से परिणामों की तुलना के लिए अनुमति देता है, एक विशेष रूप से बड़ी आबादी के अध्ययन में आवश्यक कदम, और निकट भविष्य में प्रोटीन के स्तर पर प्रासंगिक संबद्धता अध्ययन की प्राप्ति.

हाल के वर्षों में जीनोमिक अनुसंधान में रोमांचक प्रगति के साथ साथ, बायोमेडिकल रिसर्च फील्ड भी proteomic अनुसंधान में महत्वपूर्ण प्रगति गवाह । दोनों जीनोमिक और proteomic के स्तर पर जैविक डेटा की बढ़ती संचय के साथ, इन आंकड़ों का विश्लेषण करने के लिए bioinformatic उपकरण का उपयोग कर, अनुभव भविष्य में जैव चिकित्सा अनुसंधान का ध्यान केंद्रित हो गया है । नतीजतन, bioinformatical अनुसंधान की सफलता जैविक और जैव चिकित्सा अनुसंधान समुदाय से डेटा की अधिक और बेहतर गुणवत्ता के लिए मांग उठाती है, एक काम केवल जीनोमिक और proteomic के स्तर पर तकनीक उंनति के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है ।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) और immunoblot विश्लेषण वर्तमान में प्रोटीन विश्लेषण के दो प्रचलित तकनीक हैं । सुश्री हाल के वर्षों में proteomic अनुसंधान पर हावी है एक साथ व्यक्तिगत प्रोटीन के हजारों का विश्लेषण सक्षम है । दूसरी ओर, पश्चिमी दाग और बिंदी ब्लाटर सहित immunoblot आधारित तकनीक ने भी प्रोटीन रिसर्च में अहम भूमिका निभाई है क्योंकि इसके आविष्कार1,2,3,4, 5. एंजाइम लिंक्ड immunosorbent परख (एलिसा)5,6,7 और रिवर्स चरण प्रोटीन microarray (RPPM)8,9 immunoblot का उच्च प्रवाह स्वरूप माना जा सकता है विश्लेषण. हालांकि, एलिसा को छोड़कर इन सभी immunoassay विधियों, एक विशिष्ट प्रोटीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर को मापने । इन तरीकों के सापेक्ष प्रकृति जनसंख्या अध्ययन के लिए एक वास्तविक समस्या बन जाएगा, के रूप में विश्लेषण एक ही समय में किया जाना चाहिए, किसी भी कई विश्लेषण के माध्यम से पूल आकार बढ़ाने के प्रयासों को रोकने । इसके अलावा, इन अध्ययनों से व्युत्पंन परिणाम केवल अर्द्ध मात्रात्मक हैं, इस प्रकार डेटा विश्लेषण में किसी भी bioinformatics प्रयासों उलझी । इस बीच, हालांकि एलिसा प्रोटीन के नमूनों के उच्च प्रवाह निरपेक्ष विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, इस तकनीक की वजह से अपनी कम बाध्यकारी क्षमता और मल्टीप्लेक्स10के कोशिकाओं या ऊतकों के रूप में जटिल वातावरण में चुनौतियों को पूरा लगता है ।
हम एक immunoblot के प्रमुख विशेषताओं के साथ जनसंख्या अध्ययन के लिए उपयुक्त विधि विकसित किया जा रहा है सुविधाजनक, उच्च प्रवाह, मात्रात्मक, और प्रोटीन सामग्री के पूर्ण निर्धारण के लिए उपयुक्त है, और इस तकनीक मात्रात्मक डॉट दाग का नाम विश्लेषण (QDB)11. इस अध्ययन में, हम QDB विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद है और एक विशिष्ट प्रोटीन की पूर्ण प्रोटीन सामग्री का निर्धारण करके विधि का प्रदर्शन, CAPG, गुर्दे सहित तीन अलग माउस के ऊतकों में, तिल्ली, और प्रोस्टेट. हमें लगता है कि इस विस्तृत प्रोटोकॉल अच्छी तरह से व्यवहार्यता और इस विधि की सुविधा दिखाता है, और कैसे इस पद्धति के अभ्यास में संभावित नुकसान से बचने के लिए पर मार्गदर्शन प्रदान करते हैं ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:911px;" width="910">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:220px;">Tecan</td>
			<td style="width:177px;">Tecan Infinite 200 PRO</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:283px;">QDB plate</td>
			<td style="width:220px;">Yantai Zestern Co.Ltd</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:231px;">Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:283px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)</td>
			<td style="width:220px;">jackson</td>
			<td style="width:177px;">&#160;711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Enhanced chemiluminesence substrate</td>
			<td style="width:220px;">Thermo</td>
			<td style="width:177px;">32134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Rabbit anti-CAPG&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-T52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">CAPG protein</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-HNAE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hepes</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Nacl</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">10461220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Mgcl2</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">20120802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EDTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">E9884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EGTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">BNN1913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Na2P2O7</td>
			<td style="width:220px;">Haituo Chinese medicine test</td>
			<td style="width:177px;">20160914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Glycerol</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">P7626-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pepstatin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">Z290033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">leupeptin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aprotinin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">A3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris-Hcl</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">SDS</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L5750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">DTT</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Bromphenol Blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">B-0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">NaF</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)

एक सुविधाजनक, मात्रात्मक, सेलुलर और ऊतक स्तर पर एक विशिष्ट प्रोटीन की सामग्री के निरपेक्ष निर्धारण के लिए उच्च प्रवाह immunoblot विधि की कमी काफी proteomic अनुसंधान में प्रगति में बाधा । वर्तमान में उपलब्ध immunoblot तकनीक से व्युत्पंन परिणाम भी सापेक्ष हैं, किसी भी प्रोटीन नमूनों की एक बड़े पैमाने पर विश्लेषण के साथ स्वतंत्र अध्ययन गठबंधन करने के प्रयासों को रोकने । इस अध्ययन में, हम एक उच्च प्रवाह प्रारूप में निरपेक्ष ठहराव प्राप्त करने के लिए मात्रात्मक डॉट दाग विश्लेषण (QDB) की प्रक्रिया का प्रदर्शन । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन मानक का उपयोग करना, हम actin प्रोटीन कैपिंग की निरपेक्ष सामग्री का निर्धारण करने में सक्षम हैं, gelsolin की तरह (CAPG) प्रोटीन नमूनों में तीन अलग माउस के ऊतकों से तैयार (गुर्दे, तिल्ली, और प्रोस्टेट) एक साथ एक विस्तृत प्रायोगिक विवरणों का स्पष्टीकरण । हम सेलुलर और ऊतक के स्तर पर व्यक्तिगत प्रोटीन के निरपेक्ष ठहराव के एक सुविधाजनक, मात्रात्मक, उच्च प्रवाह immunoblot विधि के रूप में QDB विश्लेषण का प्रस्ताव । इस विधि को काफी जैविक और जैव चिकित्सा अनुसंधान के विभिंन क्षेत्रों में एक से अधिक मार्कर सत्यापन और मार्ग सत्यापन सहायता करेगा ।

माउस ऊतक में CAPG प्रोटीन सहित किसी भी प्रोटीन की निरपेक्ष राशि का निर्धारण दोनों एक विशिष्ट एंटीबॉडी और मानक के रूप में एक शुद्ध प्रोटीन की आवश्यकता है । दोनों प्रोटीन मानक और lysates के विश्लेषण की रैखिक रेंज भी बड़े पैमाने पर विश्लेषण करने से पहले स्थापित करने की आवश्यकता है । एंटीबॉडी के रेखीय रेंज एंटीबॉडी प्रति एसई पर अत्यधिक निर्भर है, और एक विशिष्ट एंटीबॉडी की उपयुक्त कमजोर पड़ने रेंज प्रत्येक व्यक्ति उपयोगकर्ता द्वारा सत्यापित करने की आवश्यकता है ।
हम पहले माउस गुर्दे, तिल्ली और प्रोस्टेट ऊतक नकारात्मक नियंत्रण (आईजीजी मुक्त BSA) और सकारात्मक नियंत्रण (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध CAPG प्रोटीन) (चित्रा 1एक) के साथ पश्चिमी दाग विश्लेषण का उपयोग करने में CAPG एंटीबॉडी की विशिष्टता निर्धारित किया है । विरोधी CAPG एंटीबॉडी माउस तिल्ली, दिल, मांसपेशियों से lysates के खिलाफ विशिष्ट था, और प्रोस्टेट (एक बैंड का पता चला). गैर विशिष्ट बैंड गुर्दे और जिगर से lysates में मनाया गया । हालांकि, गुर्दे lysate में, गैर विशिष्ट बैंड काफी कमजोर थे, जो सुझाव है कि एंटीबॉडी गुर्दे के ऊतकों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है । अगला, प्रोटीन मानक के रैखिक रेंज और विश्लेषण के लिए lysates की राशि पक्ष खुराक curves द्वारा दो पक्ष द्वारा निर्धारित किया गया. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध CAPG के रूप में अपने पिछले अनुभवों के आधार पर तालिका 1 में दर्शाया गया प्रश्नपत्र पतला था, और चूहे के ऊतक lysates गुर्दे, तिल्ली और प्रोस्टेट भी lysates निर्धारित में कुल प्रोटीन की मात्रा के आधार पर पतला किया गया एक बीसीए कुल प्रोटीन निर्धारण किट द्वारा । दो गुनी पढ़ाई की ओर से प्रदर्शन किया गया और चित्र 1बीमें एक साथ साजिश रची । lysates की उचित मात्रा में माउस गुर्दे, तिल्ली और प्रोस्टेट की मनमानी इकाई में microplate पाठक द्वारा मापी गई QDB संकेतों के आधार पर चुना गया. इस प्रयोग के लिए मूल पढ़ना तालिका 3में दिखाया गया है ।
अंतिम चरण में, प्रश्नपत्र पतला CAPG प्रोटीन मानक और माउस गुर्दे, तिल्ली और प्रोस्टेट से lysates QDB प्लेट पर लोड किया गया । इस मामले में हम माउस से lysates के लिए ०.३ µ g/नमूना लोड करने के लिए चुना है गुर्दे और तिल्ली और 1 µ g/माउस से lysates के लिए नमूना राज्य विश्लेषण, के रूप में इन स्तरों पर, QDB पढ़ने कम से 20 पृष्ठभूमि पर गुना था, जबकि अच्छी तरह से विश्लेषण के रैखिक श्रेणी के भीतर दोनों lysates और प्रोटीन मानक की खुराक वक्र पर आधारित है । थाली से पहले वर्णित QDB प्रोटोकॉल के अधीन किया गया था प्लेट सीधे microplate पाठक द्वारा quantified था । प्रश्नपत्र पतला शुद्ध CAPG प्रोटीन का प्रयोग, हम एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र स्थापित कर सकता है, समीकरण, और R2 सरल प्रतिगमन के द्वारा उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण (उदा. Microsoft office excel) । माउस गुर्दे, तिल्ली और QDB के lysates से संकेतों को स्थापित समीकरण का उपयोग कर इन lysates में CAPG प्रोटीन की निरपेक्ष मात्रा में परिवर्तित किया गया था, और परिणाम कुल प्रोटीन राशि द्वारा सही किए गए थे, इस मामले में, ०.३ µ g से lysates के लिए माउस तिल्ली और गुर्दे, और माउस की स्थिति से lysates के लिए 1 µ जी, CAPG प्रोटीन की अंतिम एकाग्रता के लिए इन ऊतकों में स्नातकोत्तर के रूप में µ जी. परिणाम तालिका 4 में दिखाए गए मूल पठन के साथ चित्रा 1C में दिखाया गया है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> चित्रा 1 . एक QDB विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम तीन माउस के ऊतकों में पूर्ण CAPG स्तर निर्धारित करने के लिए (गुर्दे, तिल्ली और प्रोस्टेट). A. खरगोश विरोधी CAPG एंटीबॉडी की विशिष्टता की जांच माउस ऊतक lysates तिल्ली, हृदय, मांसपेशी, गुर्दे, जिगर से तैयार का उपयोग कर, और प्रोस्टेट नकारात्मक नियंत्रण (आईजीजी मुक्त BSA) और सकारात्मक नियंत्रण के साथ पश्चिमी दाग विश्लेषण का उपयोग कर (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध CAPG प्रोटीन) । ख. QDB का विश्लेषण के रैखिक सीमा खरगोश विरोधी CAPG एंटीबॉडी प्रोस्टेट, गुर्दे, तिल्ली से तैयार lysates का उपयोग कर, और शुद्ध रिकॉमबिनेंट CAPG प्रोटीन मानक का उपयोग कर परिभाषित. परिणाम triplicates के एक औसत थे । C. माउस गुर्दे, तिल्ली, और CAPG से तैयार lysates में स्तरों का निरपेक्ष निर्धारण. प्रत्येक बार एक व्यक्ति माउस से एक ऊतक का प्रतिनिधित्व करता है । परिणाम तपसिल के औसत थे । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> तालिका 3: खुराक अध्ययन के microplate रीडर से परिणाम दोनों धारावाहिक पतला, माउस तिल्ली, गुर्दे, और ख़ामोश और शुद्ध रिकॉमबिनेंट CAPG प्रोटीन से परित lysates का उपयोग कर ।
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
तालिका 4: माउस गुर्दे (8), तिल्ली (4) और (5) में निरपेक्ष CAPG स्तर के QDB विश्लेषण के microplate रीडर से मानक के रूप में एक रिकॉमबिनेंट CAPG प्रोटीन का उपयोग कर परिणाम.

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High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

यहां हम मात्रात्मक डॉट दाग विश्लेषण की एक विस्तृत प्रक्रिया का प्रदर्शन (QDB) एक लक्षित प्रोटीन की निरपेक्ष सामग्री का निर्धारण, actin प्रोटीन कैपिंग, gelsolin की तरह (CAPG), तीन अलग माउस के ऊतकों में । हम सेलुलर और ऊतक के स्तर पर एक उच्च प्रवाह, सुविधाजनक, मात्रात्मक immunoblot तकनीक के लिए एक अगोचर सत्यापन का प्रदर्शन ।

उच्च प्रवाह, मात्रात्मक डॉट दाग विश्लेषण का उपयोग ऊतक के स्तर पर एक चयनित प्रोटीन की सामग्री का निरपेक्ष निर्धारण (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1 और TRIP8b बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु inhibitors की पहचान के लिए विधि

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एक प्रोटीन प्रोटीन की उच्च throughput पहचान नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण का प्रयोग एक परमाणु cofactor साथ बातचीत के लिए तैयारी विधि

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