Name: high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av Taishan forskere bygging Engineering (gt), The Shandong utmerket unge vitenskapsmannen Award (ZR2016JL026 til G. T.), National Natural Science Foundation i Kina (31771284, 3167070448 og 81641108), Shandong provinsielle naturlig Science foundation (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provinsielle vitenskap og teknologi (J14LE01 og J15LK03), Yantai naturvitenskapelige plan(2015ZH083) og Binzhou medisinske universitet vitenskapelige forskningsmidler (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18) Svenske Forskningsrådet gir 621-2011-4423 og 2015-4870. Dette arbeidet er også sponset av "Yantai dobbel hundre Talent Plan" og "Yantai Hi-Tech sonen blå havet Talent Plan".

Alle dyr prosedyrer ble utført i tråd med Binzhou medisinske universitet dyr bruk direktivet og godkjent av etisk sikkerhet styrets Binzhou medisinske universitet.
1. sample forberedelse
<ol><li>Ta 50 mg musen vev en 1,5 mL Tube. Legge til 200 µL lyseringsbuffer (50 mM Hepes, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1% Triton X-100, 10% glyserol), supplert med protease og fosfatase hemmere (100 mM NaF, 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluor 5 µg/mL pepstatin 10 µg/mL leupeptin, 5 µg/mL aprotinin).</li>
	<li>Homogenize vev med en homogenizer for 1 min på is.</li>
	<li>Sentrifuge for 10 min 8 000 x g på 4 ° C.</li>
	<li>Samle nedbryting i nye rør (1,5 mL) og ta ut 1 µL for protein konsentrasjon analysen med BCA kit. Merk: Alle de brukte lysis bufferne for western blot analyse og Dot blot analyse kan brukes for QDB analyse.</li>
</ol>2. fastsettelse av spesifisitet av antistoffer
<ol><li>Forberede prøven lysates (20 µg) i delen 1.4, IgG gratis BSA (20 µg), standard protein (600 pg), for western blot analyse. Merk: IgG gratis BSA brukes som en negativ kontroll og standard protein brukes som en positiv. Spesifisitet av antistoffer er demonstrert ved å vise en gjeng riktig størrelse western blot analyse.</li>
</ol>3. definere lineær QDB analyse
<ol><li>Oppløse standard protein med ddH2O. Dilute protein til en konsentrasjon av 1200 pg/µL.</li>
	<li>Fortynne konsentrert protein fra forberedt eksemplene i delen 1.4 4 µg/µL.</li>
	<li>Oppløse BSA med ddH2O. Dilute protein til en konsentrasjon av 1200 pg/µL og 4 µg/µL.</li>
	<li>En rekke fortynning av standard protein og forberedt prøver var forberedt med veiledning av tabell 1 og tabell 2.</li>
	<li>Bland 10 µL fortynning standard protein eller fortynning forberedt prøver og 10 µL 2 x lasting buffer (120mM Tris-HCl pH 6.8, 20% glyserol, 4% SDS, 0,2% Bromphenol Blue, 200 mM DTT) sammen.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg/µl)</td>
			<td>S2 (33.3pg / µl)</td>
			<td>S3 (100pg/µl)</td>
			<td>S3 (300pg/µl)</td>
			<td>S5 (600pg/µl)</td>
			<td>S6 (1200pg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>standard protein(1200pg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>1.39</td>
			<td>4.17</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG gratis BSA (4pg/µl)</td>
			<td>50</td>
			<td>48.61</td>
			<td>45.83</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Fortynning ordningen for standard protein kurve.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0µg/µl)</td>
			<td>X2 (0.25µg / µl)</td>
			<td>X3 (0.5µg / µl)</td>
			<td>X4 (1µg/µl)</td>
			<td>X5 (2µg/µl)</td>
			<td>X6 (4 µg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sample(4µg/µL)</td>
			<td>0</td>
			<td>3.125</td>
			<td>6.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG gratis BSA(4µg/µl)</td>
			<td>50</td>
			<td>46.875</td>
			<td>43.75</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2. Fortynning ordningen for forberedt prøver
<ol start="6"><li>Varme blandinger på 85 ° C i 5 minutter.</li>
</ol>4. prosessen av QDB analyse
<ol><li>
Eksempelprogrammet
	<ol>
<li>Støtte QDB platen for å unngå bunnen av platen ta på tabellen. For eksempel bruke en tom pipette tips for som støtte.</li>
		<li>Laste opp til 2 µL av utvalget til midten av membranen i bunnen av personlige QDB platen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tørking platen
	<ol>
<li>La lastet QDB platen 1t på rommet tempererte (RT) eller som et alternativ la lastet platen på 37 ° C i 15 min i et godt ventilert område.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blokkerer platen
	<ol>
<li>Dukkert QDB platen i overføring bufferen (0.039 M Glycine, 0.048 M Tris, 0,37% SDS, 20% metyl alkohol) og forsiktig risting platen i 10 s.</li>
		<li>Skyll QDB platen forsiktig med TBST (Tris-bufret saltvann, 0,1% mellom 20) tre ganger, og deretter vaske platen i 5 min i TBST under konstant risting.</li>
		<li>Blokkere QDB plate med blokkering buffer (5% nonfat melk i TBST (100 µL/vel) 1t under konstant risting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Primære antistoff inkubasjon
	<ol>
<li>Fortynne det primære antistoffet blokkerer bufferen på en valgt konsentrasjon (fra 1:500 til 1:5 000), og tilsett 100 µL hver enkelt brønn av en vanlig 96 godt plate. QDB platen inn 96 godt platen og ruge kombinert platene for 2t på RT eller over natten på 4 ° C under konstant risting.</li>
		<li>Alternativt sted QDB platen i en boks og fyll boksen med blokkering buffer 2 til 3 mm over membran delen av platen Hvis samme antistoffer brukes til hele platen. Legger til primære antistoffer valgte konsentrasjonen, og ruge platen for 2t på RT eller over natten på 4 ° C ved under konstant risting.</li>
		<li>Skyll platen forsiktig med TBST for tre ganger før det vasket med TBST for tre ganger, hver gang etter 5 min under konstant risting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sekundær antistoff inkubasjon
	<ol>
<li>Fortynne det sekundære antistoffet blokkerer bufferen på valgte konsentrasjonen (fra 1:1, 000 til 1:50, 000), og enten aliquot 100 µL/vel i en 96 godt tallerken eller i en boks som beskrevet i delen 4.4.2 og deretter ruge QDB platen inni heller lastet 96 godt pla te eller boksen 1t på RT under konstant risting.</li>
		<li>Skyll QDB platen forsiktig 3 ganger med TBST, så vaske platen i 3 ganger, 5 min hver med TBST under konstant risting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kvantifisering
	<ol>
<li>Utarbeide forbedrede chemiluminescence substrat (ECL) ved å følge instruksjonene fra produsenten.</li>
		<li>Aliquot ECL underlaget i en 96 godt plate (100 µL/vel) og sett inn QDB platen i 96 godt plate i 2 minutter under konstant risting.</li>
		<li>Fjern QDB platen fra 96 godt plate og riste kort for å fjerne overflødig væske. Plass platen på en hvit være ferdig innen tallerken.</li>
		<li>Slå på microplate leseren, og velg "plate med cover" brukergrensesnittet for før du plasserer kombinert platene (QDB plate + hvit plate adapter) inne microplate leseren for kvantifisering. Merk: Pass på å bruke hvit, ikke-gjennomsiktige være ferdig innen platen som en adapter for å unngå interferens fra platen. Pass på å velge "plate med lokk" for å unngå jamming maskinen kombinert plater (QDB plate + 96 godt plate adapter) er plassert på innsiden microplate leseren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proposal+for+validation+of+antibodies.">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li><li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies.">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li><li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA).+Quantitative+assay+of+immunoglobulin.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li><li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen,+immunoglobulin+G,+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes.">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li><li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front.">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li><li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+array:+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells.">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li><li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations.">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+dot+blot+analysis+(QDB),+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method.">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li></ol>

Forfatterne Yunyun Zhang, Wenfeng Zhang og Jiandi Zhang er ansatte i Zestern Biotechniques som produserer QDB platene brukes i denne artikkelen. Wenfeng Zhang og Yunyun Zhang erklære interessekonflikter, og Jiandi Zhang har arkivert patentsøknader. Andre hevder ingen konkurrerende interesser.

Blant alle nåværende tilgjengelige immunanalyse teknikker av protein analyse unntatt ELISA er QDB analyse den eneste metoden for å oppnå absolutt innholdet i et bestemt protein mobilnettet og vev nivåer i høy gjennomstrømning format. Selv med stabil isotop-merket standard, massespektrometri er dugelig å oppnå absolutt kvantifisering av noen proteiner, er ikke denne metoden ennå utformet for høy gjennomstrømming ytelse. I denne studien viste vi prosessen med QDB analyse å oppnå absolutt vilje CAPG protein nivå i musen vev inkludert nyre, milt og prostata. CAPG nivåer ble funnet for å være mellom 200 til 360 pg/g i mus nyre vev, 460 til 650 pg/g i musen spleens og 330 til 390 pg/g i musen prostate vev.
Sammenlignet med ELISA, krever QDB analyse minimum innsats skal utvikles i en vanlig lab. Først er QDB platen basert på en nitrocellulose membran å eliminere belegg trinnet i ELISA. Andre krever QDB analyse bare en i stedet for to spesifikke antistoffer i en sandwich ELISA. Tredje kan høy bindende kapasitet nitrocellulose membran sammenlignet med ELISA tallerken overflaten også membranen tåle strenge vask fremgangsmåten brukes vanligvis i immunoblot analyse for å redusere bakgrunnen forstyrrelser. Denne funksjonen er svært nyttig i å analysere komplisert lysates celler og vev. Derimot på grunn av den relativt lave innbindingen behandlingskapasitet av ELISA plater blir reduksjon av bakgrunnen når du analyserer komplisert cellular og vev lysates en skikkelig utfordring i utviklingsprosessen.
QDB analyse kan vedtas lett i enhver lab med tilgang til et spesifikt antistoff. Men er det viktig å nevne at spesifisitet av antistoffer er et relativt begrep, begrenset av faktorer, inkludert arter, vev typer og celletyper. Som vist i figur 1A, CAPG antistoffer er bestemt når du analyserer lysate fra mus nyre, milt og prostata, og ennå blir uspesifisert når du analyserer musen leveren. Faktisk vi rutinemessig fant en antistoff å være spesifikke for en vev type, men ikke alltid spesifikke til andre vev type fra samme art. Dermed er tidligere western blot analyse nødvendig for å sikre spesifisitet av QDB analyse. Faktisk, kan relativ spesifisitet av antistoffer være årsaken til falske resultater ofte assosiert med ELISA analyse, som uansett hvor mye arbeid på produksjonsbedrift kan ha brukt slik spesifisitet av analysen, ikke kan de eksos alle mulige typer prøver brukerne kan velge å analysere benytter deres ELISA produktene.
Som med alle immunanalyser, er et problem med metoden QDB analyse mangel på konsistens av kvaliteten på kommersielle antistoffer. Selv om tilsynelatende kvaliteten på et antistoff fra samme brukes selskap (samme katalog tall, etc.), kan det være store forskjeller fra ett kjøp til et annet fordi parti til parti variasjon. Derfor ikke full tillit er oppnådd i kvaliteten på antistoffer tilgjengelig, er nytt karakteriserer antistoffer ved hvert innkjøp viktig.
I sammendraget gir vi her en detaljert protokoll og et eksempel når du bruker metoden QDB analyse for å oppnå absolutt kvantitative fastsettelse av et bestemt protein på vev nivå. Vi viser at metoden QDB analyse er et praktisk verktøy for alle som er interessert i høy gjennomstrømning, kvantitativ immunoblot analyse. Dens evne til å oppnå absolutt vilje av innholdet i et bestemt protein på en mobilnettet og vev også skille denne teknikken fra tradisjonelle immunoblot teknikker. Denne funksjonen gir kombinasjonen og sammenligning av resultatene fra flere analyser, et skritt nødvendige spesielt i større befolkningsstudier og realisering av relevante association studier på protein nivå i nær fremtid.

Sammen med spennende fremskritt i genomisk forskning i de siste årene, vitner biomedisinsk forskning feltet også til betydelig fremgang i proteomic forskning. Med økende akkumulering av biologiske data på både genomisk og proteomic nivåer, bruker bioinformatic verktøy for å analysere disse dataene har blitt fokus for biomedisinsk forskning i den oppfattes fremtiden. Følgelig suksessen bioinformatical forskning øker etterspørselen etter mer og bedre kvaliteten på data fra biologiske og biomedisinsk forskning samfunnet, en aktivitet kan bare oppnås gjennom teknikk fremgang på genomisk og proteomic.
Massespektrometri (MS) og immunoblot analyse er i dag to rådende teknikker av protein analyse. MS har dominert proteomic forskning i de siste årene å aktivere analyse av individuelle proteiner samtidig. Immunoblot-baserte teknikker, inkludert western blot og dot blot, derimot, har også spilt en viktig rolle i protein forskningen selv siden sin oppfinnelse1,2,3,4, 5. Enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA)5,6,7 og omvendt fase protein microarray (RPPM)8,9 kan betraktes høy gjennomstrømning formatet på immunoblot analyse. Men måle alle disse immunanalyse metoder, unntatt ELISA, relative uttrykk nivået av et bestemt protein. Relativ natur disse metodene vil bli et reelt problem for befolkningsstudier, som analyse må gjøres samtidig, forhindrer ethvert forsøk på å øke utvalgsstørrelsen gjennom flere analyser. Videre er resultatene fra disse studiene bare semi kvantitativ, dermed kompliserer anstrengele bioinformatikk i dataanalyse. I mellomtiden, selv om ELISA er godt egnet for høy gjennomstrømning absolutt analyse av protein prøver, denne teknikken synes å møte utfordringene i komplekse miljøer som eller vev på grunn av sin lave innbindingen behandlingskapasitet og multipleksing10.
Vi har utviklet en metode for immunoblot som er egnet for befolkningsstudier med de viktigste kjennetegnene ved å være praktisk, høy gjennomstrømning, kvantitativ, og passer for absolutt fastsettelse av proteininnhold, og heter denne teknikken kvantitative dot blot analyse (QDB)11. I denne studien vi presentere en detaljert protokoll for QDB analyse og demonstrere metoden ved å bestemme absolutt proteininnholdet i et bestemt protein, CAPG, i tre ulike musen vev inkludert nyre, milt og prostata. Vi tror at denne detaljerte protokollen godt illustrerer gjennomførbarhet og bekvemmeligheten av denne metoden, og gi veiledning om hvordan du unngår potensielle fallgruvene i praksis av denne metoden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:911px;" width="910">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:220px;">Tecan</td>
			<td style="width:177px;">Tecan Infinite 200 PRO</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:283px;">QDB plate</td>
			<td style="width:220px;">Yantai Zestern Co.Ltd</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:231px;">Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:283px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)</td>
			<td style="width:220px;">jackson</td>
			<td style="width:177px;">&#160;711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Enhanced chemiluminesence substrate</td>
			<td style="width:220px;">Thermo</td>
			<td style="width:177px;">32134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Rabbit anti-CAPG&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-T52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">CAPG protein</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-HNAE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hepes</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Nacl</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">10461220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Mgcl2</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">20120802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EDTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">E9884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EGTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">BNN1913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Na2P2O7</td>
			<td style="width:220px;">Haituo Chinese medicine test</td>
			<td style="width:177px;">20160914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Glycerol</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">P7626-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pepstatin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">Z290033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">leupeptin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aprotinin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">A3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris-Hcl</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">SDS</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L5750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">DTT</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Bromphenol Blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">B-0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">NaF</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)

Mangler en praktisk, vanskeliggjør kvantitativ, høy gjennomstrømming immunoblot metoden for absolutt vilje av innholdet i et bestemt protein mobilnettet og vev vesentlig fremdriften i proteomic forskning. Resultatene fra tilgjengelig immunoblot teknikker er også forhold, hindre ethvert forsøk på å kombinere uavhengige studier med en omfattende analyse av protein prøver. I denne studien viser vi prosessen med kvantitative dot blot analyse (QDB) å oppnå absolutt kvantifisering i høy gjennomstrømning format. Bruke en kommersielt tilgjengelig protein standard, er vi finne absolutt innholdet capping utgangen protein, gelsolin-lignende (CAPG) i protein prøver forberedt fra tre forskjellige mus vev (nyre, milt og prostata) sammen med en detaljert forklaring av eksperimentelle detaljene. Vi foreslår QDB analysen som praktisk, kvantitativ, høy gjennomstrømming immunoblot absolutt kvantifisering av personlige proteiner på mobilnettet og vev. Denne metoden vil vesentlig hjelpe biomarkør validation og bekreftelsen av veien i ulike områder av biologiske og biomedisinsk forskning.

Fastsettelse av den absolutte mengden alle protein inkludert CAPG proteinet i musen vev krever både et spesifikt antistoff og en renset protein som standard. Lineær rekke analyser av både protein standard og lysates også må opprettes før noen omfattende analyse. Lineær rekke antistoffer er svært avhengig av antistoffer per se, og aktuelle fortynning omfanget av et spesifikt antistoff må verifiseres av hver enkelt bruker.
Vi først bestemt spesifisitet av antistoffer CAPG i mus nyre, milt og prostate vev bruker western blot analyse med negativ kontroll (IgG gratis BSA) og positiv kontroll (kommersielt tilgjengelig CAPG protein) (figur 1A). Anti-CAPG antistoffer var bestemt mot lysates fra musen milt, hjerte, muskler og prostata (ett band oppdaget). Non-spesifikke band ble observert i lysates fra nyre og lever. Men i nyre lysate var ikke-spesifikk band betydelig svakere enn de spesifikke band, som antyder antistoffer er egnet for nyre vev analyse. Neste, lineær rekke protein standard og mengden av lysates for analyser ble fastsatt av to sidestilt dose kurver. Et kommersielt tilgjengelig CAPG protein var serielt utvannet som vist i tabell 1 basert på våre tidligere erfaringer og vev lysates av mus nyre, milt og prostata var også utvannet basert på mengden av totale protein i lysates bestemt ved en BCA totale protein besluttsomhet kit. To dose studier ble utført side ved side og tegnet sammen i figur 1B. Riktig mengde lysates mus nyre, milt og prostata ble valgt basert på QDB signaler målt ved microplate leseren i vilkårlig enhet. Opprinnelige lesing for dette eksperimentet er vist i tabell 3.
I det siste trinnet, serielt utvannet CAPG protein standarden og lysates fra mus nyre, ble milt og prostata lastet opp på QDB platen. I dette tilfellet valgte vi å laste 0,3 µg/utvalg for lysates fra mus nyre og milt og 1 µg/utvalg for lysates fra musen prostates analyse, som på disse nivåene, QDB lesing var på minst 20-fold over bakgrunnen mens godt innen lineær analyse basert på dose kurven både i lysates og protein standard. Platen ble utsatt for beskrevet QDB protokollen før platen ble kvantifisert direkte av microplate leseren. Bruker serielt utvannet renset CAPG protein, kunne vi etablere en dose-respons kurve, ligningen og R2 av enkel regresjonsanalyse med tilgjengelig programvare (f.eks Microsoft office excel). QDB signaler fra lysates av musen nyrene, spleens og prostates ble konvertert til den absolutte mengden CAPG protein i disse lysates ved hjelp av etablerte formelen og resultatet ble korrigert av totale protein beløpet, i dette tilfellet 0,3 µg for lysates fra mus spleens og nyrer, og 1 µg for lysates fra musen prostates, for siste konsentrasjonen av CAPG protein i disse vev som pg/µg. Resultatene vises i figur 1C med opprinnelige lesing i Tabell 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> Figur 1 . Representant resultatet av en QDB-analyse for å fastslå de absolutte CAPG nivåene i tre mus vev (nyre, milt og prostata). A. å undersøke spesifisiteten av kanin anti-CAPG antistoff bruker musen vev lysates forberedt fra milt, hjerte, muskler, nyre, lever og prostata bruker western blot analyse med negativ kontroll (IgG gratis BSA) og positiv kontroll (kommersielt tilgjengelig CAPG protein). B. definere lineær utvalg av QDB analysene kanin anti-CAPG antistoff bruker lysates utarbeidet av prostata, renset nyre, milt og bruke rekombinant CAPG protein standard. Resultatene var gjennomsnittlig triplicates. C. absolutt fastsettelse av CAPG i lysates musen nyrene, spleens og prostates. Hver stolpe representerer én vev fra en enkelt mus. Resultatene var gjennomsnittet av tre eksemplarer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> Tabell 3: Resultatet microplate leser av dose studiene med både serielt fortynnet, gruppert lysates musen spleens, nyrer, prostates og renset rekombinant CAPG protein.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
Tabell 4: Resultatet fra microplate leser av QDB analyse av absolutt CAPG nivået i musen nyrene (8), spleens (4) og prostates (5) bruker en rekombinant CAPG protein som standard.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB at JoVE.com

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Her viser vi detaljerte prosessen med kvantitative dot blot analyse (QDB) ved å bestemme absolutt innholdet i en målrettet protein, capping utgangen protein, gelsolin-lignende (CAPG), i tre ulike musen vev. Vi viser en høy gjennomstrømning, praktisk, kvantitativ immunoblot teknikk for biomarkør validering på mobilnettet og vev.

Høy gjennomstrømning, absolutt vilje av innholdet i et valgt Protein på vev nivåer ved hjelp av kvantitative Dot Blot analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

En Protein Forberedelse metode for High-throughput identifisering av proteiner samspill med et kjernefysisk kofaktor Bruke LC-MS / MS-analyse

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometri fastsettelse av Phycobiliprotein innhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Berikelse av Native lipoprotein partikler med microRNA og påfølgende fastsettelse av deres Absolute/relative microRNA innhold og deres Cellular overføringshastighet

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Bruk av mikroskala termoforese for å måle protein-lipid interaksjoner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Et økonomisk og allsidig proteinrensesystem med høy gjennomstrømning ved hjelp av en adapter med flere kolonner

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...