Name: high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB at JoVE.com

Detta arbete stöds av Taishan forskare Construction Engineering (gt), The Shandong utmärkt ung vetenskapsman Award (ZR2016JL026 till G. T.), National Natural Science Foundation Kina (31771284, 3167070448 och 81641108), Shandong provinsiella naturlig Science foundation (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provinsiella vetenskap och teknik (J14LE01 och J15LK03), Yantai vetenskap och teknik plan(2015ZH083) och Binzhou medicinska universitet vetenskapliga forskningsmedel (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), Vetenskapsrådet beviljar 621-2011-4423 och 2015-4870. Detta arbete är också sponsrad av ”Yantai dubbel hundra talang Plan” och ”Yantai Hi-Tech Zone blå Ocean talang Plan”.

Alla djur förfaranden genomfördes i linje med Binzhou medicinska universitet djur användning direktiv och godkänts av etikprövningsnämnden Binzhou Medical University.
1. provberedning
<ol><li>Ta 50 mg mus vävnad i en 1,5 mL tub. Tillsätt 200 µL lyseringsbuffert (50 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1% Triton x-100, 10% glycerol), kompletterade med proteas och fosfatas-hämmare (100 mM NaF, 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluor, 5 µg/mL pepstatin, 10 µg/mL leupeptin, 5 µg/mL aprotinin).</li>
	<li>Homogenisera vävnaderna med en Homogenisatorer för 1 min på is.</li>
	<li>Centrifugera i 10 min vid 8 000 x g vid 4 ° C.</li>
	<li>Samla in supernatanten i nya rör (1,5 mL) och ta ut 1 µL för protein koncentration assay med BCA kit. Obs: Alla vanliga lysis buffertar för western blot och Dot blot analys kan användas för QDB analys.</li>
</ol>2. bestämma specificiteten av antikropp
<ol><li>Förbereda prov lysates (20 µg) i avsnitt 1.4, IgG gratis BSA (20 µg), standard protein (600 pg), för western blot analys. Obs: IgG gratis BSA används som en negativ kontroll och proteinet standard används som positiv kontroll. Antikroppens specificitet framgår av visar ett musikband av rätt storlek med hjälp av western blot-analys.</li>
</ol>3. definiera det linjära området QDB analys
<ol><li>Lös upp standard proteinet med ddH2O. Dilute proteinet till en koncentration av 1 200 pg/µL.</li>
	<li>Späd det koncentrerat proteinet från beredda proverna i avsnitt 1.4 till 4 µg/µL.</li>
	<li>Lös upp BSA med ddH2O. Dilute proteinet till en koncentration av 1 200 pg/µL och 4 µg/µL.</li>
	<li>En serie av förtunningen av standard protein och beredda proverna var förberedda med ledning av tabell 1 och tabell 2.</li>
	<li>Blanda 10 µL utspädning standard protein eller utspädning förberett prover och 10 µL 2 x laddar buffert (120mM Tris-HCl pH 6.8, 20% Glycerol, 4% SDS, 0,2% Bromphenol blå, 200 mM DTT) tillsammans.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>S1 (0pg/µl)</td>
			<td>S2 (33.3pg / µl)</td>
			<td>S3 (100pg/µl)</td>
			<td>S3 (300pg/µl)</td>
			<td>S5 (600pg/µl)</td>
			<td>S6 (1200pg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>standard protein(1200pg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>1,39</td>
			<td>4.17</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG gratis BSA (4pg/µl)</td>
			<td>50</td>
			<td>48.61</td>
			<td>45.83</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Utspädning system för standard protein kurva.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>X1 (0µg/µl)</td>
			<td>X2 (0.25µg / µl)</td>
			<td>X3 (0.5µg / µl)</td>
			<td>X4 (1µg/µl)</td>
			<td>X5 (2µg/µl)</td>
			<td>X6 (4 µg/µl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sample(4µg/µl)</td>
			<td>0</td>
			<td>3.125</td>
			<td>6.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG-gratis BSA(4µg/µl)</td>
			<td>50</td>
			<td>46.875</td>
			<td>43,75</td>
			<td>37,5</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2. Utspädning systemet för beredda prover
<ol start="6"><li>Värm blandningen vid 85 ° C i 5 min.</li>
</ol>4. bearbeta QDB analys
<ol><li>
Exempelprogrammet
	<ol>
<li>Stödja QDB plattan för att undvika botten av plattan att vidröra ytan av tabellen. Till exempel använda en tom pipett tip box som stöd.</li>
		<li>Ladda upp till 2 µL av provet till mitten av membranet längst ned på den enskilda enheten av QDB plattan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Torka plattan
	<ol>
<li>Lämna laddade QDB plattan för 1 h på tempererade rum (RT) eller som ett alternativ lämna laddade plattan vid 37 ° C i 15 min i ett väl ventilerat utrymme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blockerar plattan
	<ol>
<li>Doppa QDB plattan i överföring bufferten (0,039 M glycin, 0,048 M Tris, 0,37% SDS, 20% metylalkohol) och skaka försiktigt plattan för 10 s.</li>
		<li>Skölj QDB plattan försiktigt med TBST (Tris-buffrad koksaltlösning, 0,1% Tween-20) tre gånger och sedan tvätta plattan för 5 min i TBST under ständig skakning.</li>
		<li>Blockera QDB plattan med blockerande buffert (5% nonfat mjölk i TBST (100 µL per brunn) för 1 h under ständig skakning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Primär antikropp inkubation
	<ol>
<li>Späd den primär antikroppen i blockerande buffert på en vald koncentration (från 1:500 till 1:5 000), och tillsätt 100 µL till varje enskild brunn av en vanlig 96 väl platta. Infoga QDB plattan i 96 väl plattan och inkubera kombinerade plattorna antingen för 2 h på RT eller över natten vid 4 ° C under ständig skakning.</li>
		<li>Alternativt placera QDB plattan inuti en låda och fylla lådan med blockerande buffert 2 till 3 mm över membranet portion av plattan om samma antikropp används för hela plattan. Lägg den primär antikroppen i vald koncentration och inkubera plattan antingen för 2 h på RT eller över natten vid 4 ° C av under ständig skakning.</li>
		<li>Skölj plattan försiktigt med TBST för tre gånger innan det tvättas med TBST för tre gånger, varje gång för 5 min under ständig skakning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sekundära antikroppar inkubation
	<ol>
<li>Späd den sekundära antikroppen i det blockerande buffert på den valda koncentrationen (från 1:1, 000 till 1:50 000), och antingen alikvotens 100 µL per brunn till en 96 väl platta eller i en låda som beskrivs i avsnitt 4.4.2 och sedan Inkubera QDB plattan släpper antingen lastade 96 väl pla te eller rutan för 1 h på RT under ständig skakning.</li>
		<li>Skölj QDB plattan försiktigt 3 gånger med TBST och sedan tvätta plattan för 3 gånger, 5 min varje med TBST under ständig skakning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rapporteringsgräns
	<ol>
<li>Förbereda förbättrade chemiluminescence substrat (ECL) genom att följa tillverkarens instruktioner.</li>
		<li>Alikvotens ECL substrat i en 96 väl platta (100 µL per brunn) och infoga QDB plattan släpper 96 väl plattan för 2 min under ständig skakning.</li>
		<li>Ta bort QDB plattan från 96 väl plattan och skaka kort för att ta bort överflödig vätska. Placera plattan på en vit mikrotiterplattan.</li>
		<li>Aktivera den microplate reader och välj ”tallrik med lock” på användargränssnittet innan du placerar kombinerade plattorna (QDB plåt + vit platta adapter) inuti mikroplattan läsaren för kvantifiering. Obs: Se till att använda vita, ogenomskinliga mikrotiterplattan som en adapter för att undvika eventuella störningar från plattan. Se till att välja ”tallrik med lock” för att undvika störning maskinen när kombinerade plattor (QDB plattan + 96 väl plattan adapter) är placerade inuti mikroplattan läsaren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proposal+for+validation+of+antibodies.">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li><li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies.">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li><li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA).+Quantitative+assay+of+immunoglobulin.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li><li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen,+immunoglobulin+G,+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes.">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li><li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front.">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li><li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+phase+protein+array:+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells.">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li><li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations.">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li><li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+dot+blot+analysis+(QDB),+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method.">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li></ol>

Författarna Yunyun Zhang, Wenfeng Zhang och Jiandi Zhang är anställda av Zestern Biotechniques som producerar QDB plattor används i denna artikel. Wenfeng Zhang och Yunyun Zhang förklarar intressekonflikt och Jiandi Zhang har lämnat in patentansökningar. Den andra hävdar inga konkurrerande intressen.

Bland alla aktuella tillgängliga immunoassay tekniker för proteinanalys utom ELISA är QDB analys det enda sättet att uppnå absolut innehåll av ett specifikt protein på cellulär och vävnad i en hög genomströmning format. Visserligen med stabil isotop-märkt standard, masspektrometri kunna uppnå absolut kvantifiering av några proteiner, är denna metod ännu inte avsedd för hög genomströmning prestanda. I denna studie visade vi processen för QDB analys att uppnå absolut bestämning av CAPG proteinnivå i mus vävnader inklusive njure, mjälte och prostata. CAPG konstaterades vara mellan 200 till 360 pg/g i mus njure vävnad, 460 till 650 pg/g i mus mjälte och 330 till 390 pg/g i mus prostata vävnader.
Jämfört med ELISA, kräver QDB analysen minsta ansträngningar att utvecklas i en vanlig labb. Första är QDB plattan en utifrån en nitrocellulosa-membran för att eliminera steget beläggning i ELISA. Det andra kräver QDB analys endast en istället för två specifika antikroppar i en sandwich-ELISA. Tredje, höga bindande kapacitet av nitrocellulosa membran jämfört med ELISA platta ytan kan även membranet klarar stränga tvätt stegen används vanligtvis i immunoblot analys för att minska bakgrunden störningar. Denna funktion är mycket användbar i att analysera komplicerade lysates beredd från celler och vävnader. Däremot på grund av den relativt låga bindande kapaciteten av ELISA-plattorna blir minskning av bakgrunden när analysera komplicerade cellulära och vävnad lysates en verklig utmaning i utvecklings processen.
QDB analys kan antas lätt i någon lab med åtkomst till en specifik antikropp. Det är dock viktigt att nämna att antikroppens specificitet är en relativ term, begränsas av faktorer, inklusive arterna och vävnadstyper celltyper. Som visas i figur 1A, CAPG antikropp är specifik när analysera lysat från mus njure, mjälte och prostata, och ändå blir icke-specifik när analysera mus lever. I själva verket fann vi rutinmässigt en antikropp vara specifika för en vävnadstyp, men inte alltid specifika för andra vävnadstyp från samma art. Tidigare western blot analys är således nödvändigt att säkerställa specificitet QDB analysen. I själva verket kan den relativa specificiteten av antikropp vara orsaken till falska resultat ofta förknippas med ELISA analys, som oavsett hur mycket arbete det tillverkande företaget kan ha tillbringat för att säkerställa specificiteten av analysen, de inte kan uttömma alla tänkbara typer av prover användarna kan välja att analysera med hjälp av sina ELISA produkter.
Som med alla immunanalyser, är ett potentiellt problem med analysmetoden som QDB bristen på konsekvens av kvaliteten på den kommersiella antikroppen. Även om den skenbara kvaliteten av en antikropp från samma företag (samma katalog nummer, etc.) används, kan det vara stora skillnader från ett köp till en annan på grund av sats till sats variabilitet. Därför, om inte fullt förtroende uppnås av antikroppen tillgängliga kvalitet, åter kännetecknar antikroppen vid varje köp är viktigt.
Sammanfattningsvis ger vi här ett detaljerat protokoll och ett exempel när du använder metoden QDB analys för att uppnå absolut kvantitativ bestämning av ett specifikt protein på nivån vävnad. Vi visar att analysmetoden som QDB är ett bekvämt verktyg för alla som är intresserade av hög genomströmning, kvantitativa immunoblot analys. Dess förmåga att uppnå absolut bestämning av halten av ett visst protein på cellulär och vävnaden nivå också skilja denna teknik från traditionella immunoblot tekniker. Denna funktion möjliggör kombinationen och jämförelse av resultat från flera analyser, ett steg som är nödvändiga särskilt i större befolkningsstudier och förverkligandet av relevanta associationsstudier på proteinnivå inom en snar framtid.

Tillsammans med spännande framsteg inom genomisk forskning under de senaste åren, vittnen biomedicinsk forskningsfältet också betydande framsteg inom proteomiska forskning. Med ökande ansamling av biologiska data både genomisk och proteomiska nivåer, använda bioinformatiska verktyg för att analysera dessa data har blivit fokus för biomedicinsk forskning i uppfattbar framtiden. Följaktligen, framgången för bioinformatiska forskning höjer efterfrågan på mer och bättre kvalitet på data från gemenskapens biologisk och biomedicinsk forskning, en uppgift kan endast uppnås genom teknik befordran på genomisk och proteomiska nivåer.
Masspektrometri (MS) och immunoblot analys är två rådande tekniker för proteinanalys för närvarande. MS har dominerat proteomiska forskningen under de senaste åren att möjliggöra analys av tusentals enskilda proteiner samtidigt. De immunoblot-baserade tekniker, inklusive western blot och dot blot, däremot, har också spelat en betydande roll i protein forskningen även sedan dess uppfinning1,2,3,4, 5. Enzym kopplad immunosorbent assay (ELISA)5,6,7 och omvänd fas protein microarray (RPPM)8,9 kan anses hög genomströmning formatet för immunoblot analys. Men mäta alla dessa immunoassay metoder, utom ELISA, relativ uttryck ett specifikt protein. Den relativa naturen av dessa metoder blir ett verkligt problem för befolkningsstudier, analysen måste göras samtidigt, förhindrar alla ansträngningar för att öka storleken på poolen genom flera analyser. Resultaten från dessa studier är dessutom endast semikvantitativt, således komplicerande någon bioinformatik ansträngningar i dataanalysen. Under tiden, även om ELISA lämpar sig väl för hög genomströmning absolut analys av protein prover, denna teknik verkar möta utmaningar i komplexa miljöer såsom celler eller vävnader på grund av dess låga bindande kapacitet och multiplexing10.
Vi har utvecklat en immunoblot metod lämplig för befolkningsstudier med de viktigaste egenskaperna för att vara bekväm, hög genomströmning, kvantitativa, och lämplig för absoluta bestämning av proteinhalten, och heter denna teknik kvantitativa dot blot analys (QDB)11. I denna studie vi presentera ett detaljerat protokoll för QDB analys och demonstrera metoden genom bestämning av absoluta proteininnehållet av ett specifikt protein, CAPG, i tre olika mus vävnader inklusive njure, mjälte och prostata. Vi tror att detta detaljerade protokoll väl illustrerar genomförbarhet och bekvämlighet av denna metod, och ger vägledning om hur man undviker de potentiella fallgroparna i praktiken av denna metod.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:911px;" width="910">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:220px;">Tecan</td>
			<td style="width:177px;">Tecan Infinite 200 PRO</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:283px;">QDB plate</td>
			<td style="width:220px;">Yantai Zestern Co.Ltd</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:231px;">Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:283px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)</td>
			<td style="width:220px;">jackson</td>
			<td style="width:177px;">&#160;711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Enhanced chemiluminesence substrate</td>
			<td style="width:220px;">Thermo</td>
			<td style="width:177px;">32134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Rabbit anti-CAPG&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-T52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">CAPG protein</td>
			<td style="width:220px;">Sino Biologic Inc</td>
			<td style="width:177px;">14213-HNAE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hepes</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Nacl</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">10461220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:283px;">Mgcl2</td>
			<td style="width:220px;">Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td style="width:177px;">20120802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EDTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">E9884-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">EGTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">BNN1913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Na2P2O7</td>
			<td style="width:220px;">Haituo Chinese medicine test</td>
			<td style="width:177px;">20160914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Glycerol</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">P7626-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pepstatin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">Z290033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">leupeptin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aprotinin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">A3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Tris-Hcl</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">T6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">SDS</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">L5750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">DTT</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Bromphenol Blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">B-0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">NaF</td>
			<td style="width:220px;">Sigma</td>
			<td style="width:177px;">S7920</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput, absolute determination of the content of a selected protein at tissue levels using quantitative dot blot analysis (qdb)

Saknar ett bekvämt, försvårar kvantitativa, hög genomströmning immunoblot metod för absoluta bestämning av halten av ett visst protein på cellulär och vävnaden nivå avsevärt framstegen i proteomiska forskning. Resultaten härrör från tillgängliga immunoblot tekniker är också relativ, förhindra alla ansträngningar för att kombinera oberoende studier med en omfattande analys av protein prover. I denna studie visar vi processen för kvantitativa dot blot analys (QDB) för att uppnå absolut kvantifiering i en hög genomströmning format. Använder en kommersiellt tillgänglig protein standard, har vi möjlighet att fastställa absoluta innehållet i tak aktin protein, gelsolin-liknande (CAPG) i protein prov beredd från tre olika mus vävnader (njure, mjälte och prostata) tillsammans med en detaljerad förklaring av de experimentella detaljerna. Vi föreslår QDB analysen som en bekväm, kvantitativa, hög genomströmning immunoblot metod för absolut kvantifiering av enskilda proteiner på cellulär och vävnaden nivå. Denna metod kommer väsentligt stöd biomarkör validering och pathway verifiering inom olika områden av biologisk och biomedicinsk forskning.

Bestämning av absoluta mängden något protein inklusive det CAPG proteinet i mus vävnad krävs både en specifik antikropp och ett renat protein som standard. Det linjära området av analyser av både proteinet standard och lysates måste också fastställas innan någon storskalig analys. Det linjära området av antikropp är starkt beroende av antikroppen i sig, och lämplig utspädning spänna av en specifik antikropp behöver kontrolleras av varje enskild användare.
Vi först bestäms specificitet CAPG antikroppen i mus njure, mjälte och prostata vävnader med western blot analys med negativ kontroll (IgG gratis BSA) och positiv kontroll (kommersiellt tillgängliga CAPG protein) (figur 1A). Den anti-CAPG antikroppen var specifikt mot lysates från mus mjälte, hjärta, muskler och prostata (ett band upptäckt). Icke-specifika band observerades i lysates från njurar och lever. Men i njurarna lysate var icke-specifik banden betydligt svagare än de särskilda band, vilket tyder på antikroppen är lämplig för njure vävnadsanalys. Därefter bestämdes det linjära området av proteinet standard och mängden lysates för analyser av två sida vid sida dos kurvor. Ett kommersiellt tillgängliga CAPG protein var seriellt spädas som anges i tabell 1 baserat på våra tidigare erfarenheter och den vävnad lysates mus njure, mjälte och prostata späddes även baserat på mängden totala protein i de lysates som bestäms av ett BCA totalprotein fastställande kit. Två studier var utförs sida vid sida och ritade ihop i figur 1B. Lämplig mängd lysates mus njure, mjälte och prostata valdes utifrån QDB signalerna mätt mikroplattan läsaren i godtyckligt enhet. Den ursprungliga behandlingen för detta experiment visas i tabell 3.
I det sista steget, seriellt utspädda CAPG protein standarden och lysates från mus njure lastades mjälte och prostata på QDB plattan. I det här fallet valde vi laddar 0,3 µg/prov för lysates från mus njure och mjälte och 1 µg/prov för lysates från mus prostata analys, som på dessa nivåer, den QDB behandlingen var på minst 20 gånger över bakgrunden medan väl inom intervallet linjär analys baserat på dos kurvan för både lysates och proteinet standard. Plattan har utsatts för protokollet beskrivs QDB innan plattan kvantifierades direkt av mikroplattan läsaren. Använda proteinet seriellt utspädd renad CAPG, kunde vi konstatera en dos-respons kurva, ekvation och R2 med enkel regressionsanalys med hjälp tillgänglig programvara (t.ex. Microsoft office excel). QDB signaler från lysates mus njurar, mjälte och prostata konverterades till det absoluta beloppet av CAPG protein i dessa lysates med hjälp av etablerade ekvation och resultaten korrigerades av totalprotein beloppet, i detta fall 0.3 µg för lysates från mus mjälte och njurar, och 1 µg för lysates från mus prostata, för den slutliga koncentrationen av CAPG protein i dessa vävnader som pg/µg. Resultaten visas i figur 1C med den ursprungliga behandlingen som visas i tabell 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg"> Figur 1 . Representativa resultat av en QDB-analys för att bestämma de absoluta CAPG nivåerna i tre mus vävnader (njure, mjälte och prostata). A. undersöka specificiteten av kanin-anti-CAPG antikropp använder mus vävnad lysates beredd från mjälte, hjärta, muskler, njurar, lever, och prostata med western blot analys med negativ kontroll (IgG gratis BSA) och positiv kontroll (kommersiellt tillgängliga CAPG protein). B. definiera linjära utbud av QDB analyserna av kanin anti-CAPG antikroppar med hjälp av lysates beredd från prostata, renat njure, mjälte och använder rekombinant CAPG protein standard. Resultaten var i genomsnitt exemplar. C. absoluta bestämning av CAPG nivåer i lysates beredd från mus njurar, mjälte och prostata. Varje stapel representerar en vävnad från en individuell mus. Resultaten var genomsnittet av tre exemplar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg"> Tabell 3: Resultat från microplate reader dos studier med både seriellt spädas, poolade lysates från mus mjälte, njurar, och prostata och renat rekombinant CAPG protein.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg">
Tabell 4: Resultat från microplate reader QDB analysen av den absoluta CAPG-nivån i mus njurar (8), mjälte (4) och prostata (5) med hjälp av ett rekombinant CAPG protein som standard.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB at JoVE.com

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Här visar vi en detaljerad process av kvantitativa dot blot analys (QDB) genom att fastställa absoluta innehållet i ett riktade protein, tak aktin protein, gelsolin-liknande (CAPG), i tre olika mus vävnader. Vi visar en hög genomströmning, bekväm, kvantitativa immunoblot teknik för biomarkör validering på cellulär och vävnaden nivå.

Hög genomströmning, absolut bestämning av halten av ett Protein som är valda på vävnad nivåer med hjälp av kvantitativa Dot Blot analys (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Ett protein framställningsmetod för hög kapacitet Identifiering av proteiner interagerar med en kärnteknisk Cofactor Använda LC-MS / MS-analys

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestämning av glykogeninnehållet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestämning av Phycobiliprotein innehåll i Cyanobakterien Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Anrikning av Native Lipoproteinpartiklar med mikroRNA och efterföljande bestämning av deras absoluta/relativa mikroRNA innehåll och deras cellulära överföringshastigheten

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

Användning av mikroskala termofores för att mäta protein-lipidinteraktioner

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Ett ekonomiskt och mångsidigt proteinreningssystem med hög genomströmning med en plattadapter med flera kolumner

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...