Name: streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification at JoVE.com

نحن ممتنون جاكوبس جيربرين وبرويكي جورجين لمساعدتها التقنية الخبراء، إلى بريسكا ليفيرينك للمساهمة في توليد وتوصيف لمراقبة اللجنة التوجيهية سطرين، وليزا جاسباروتو لإظهار إجراءاتنا.

<ol>
	<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2012).</li><li>Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebellar+neuron+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 290, 287-296 (2006).</li><li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons.">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).</li><li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrailed,+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain--hindbrain+development.">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development.</a> Trends Genet. 12, 15-20 (1996).</li><li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otx2,+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer.">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).</li><li>Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Development-The+Impact+of+Preterm+Birth+and+Comorbidities.">Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities.</a> Fetal and Neonatal Physiology. , (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12, 671-678 (2015).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium.">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6, 402-406 (2017).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened.">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells.">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li><li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6,+Tbr2,+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia,+intermediate+progenitor+cells,+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex.">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li><li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming.">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

التعقيدات والتكاليف هي من العوامل ذات الصلة للباحثين الخلايا الجذعية عند اختيار أو وضع بروتوكولات التمايز. وهذا ينطبق بشكل خاص حيث أنها مسألة مفتوحة لمقدار التحكم الخارجي مطلوب لتوليد أنواع الخلايا المطلوب، أو – أنها تشكل بطريقة مختلفة – كيف هبسكس المختصة في إنتاج البيئة الإنمائية الخاصة بها، إذا ما تركت لنفسها كافية، مع المواد الغذائية. الأخذ بعوامل خارجية في المختبر جيد جداً قد تنتج منتجات الخلايا المطلوب، ولكن أيضا يمكن أن تتداخل مع القدرات التنموية الذاتية أن أظهرت الخلايا في الجسم الحي. هذه الاعتبارات هامة، لا سيما إذا كان الهدف استخدام إيبسكس المستمدة من المريض للنمذجة المرض. الاستخدام الواسع النطاق للزخرفة و/أو عوامل النمو يمكن أن تخفي تعمل المرض. البروتوكولات بالتفصيل في هذا التقرير اتبع هذا اتجاه الدراسات السابقة للحد من التعقيد والتكلفة، و/أو استخدام الزخرفة الخارجية عوامل8،9.
استناداً إلى النتائج التي أبلغت عنها موجوروما et al., ودراستنا الأخيرة، يبدو أنه من الممكن تحقيق التمايز تجاه مصائر الدماغ دون بذل جهود متضافرة لاستنساخها في فيفو الظروف، كما قامت بدراسات سابقة 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10-الجزء مثيرة للاهتمام أن الدراستين تستخدم مجموعات مختلفة من عوامل النمو، مما يوحي بأن أي مجموعة من الضروري، على الرغم من استخدام كل من FGF2. هربنا اختبارات إضافية، فيها تتعامل بشكل انتقائي مستبعدة من البروتوكول، وبينت أن الخلايا قادرة على توليد نفس المنتجات دون اقتراحاتك الخارجية10. الفروق بين الدراسات لدينا مؤهلة بحقيقة أن استخدمنا خطوط هبسك مختلفة وأساليب الثقافة، الناجم عن تمايز العصبية مع جمهورية أرمينيا، وتشتمل على عناصر لدعم بقاء الخلايا الحبيبية والنضج (بدنف، جدنف وتبلد وبوكل)11 –14. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت أسلوب بدء تشغيل أقل تعقيداً، بالمقارنة مع موجوروما et al.. وبدأ على البروتوكول بتوليد الحديدية موحدة في 96WPs، الذي معزولة لهم جسديا وكيميائيا عن بعضها البعض. وكان البروتوكول هنا كافة PSCs نسبيا مزدحمة معا في 6WPs أثناء تكوين المجلس التنفيذي، والتي سمحت لهم بالتفاعل بحرية. كيف هذا خلطات أثرت على البيئة الفيزيائية والكيميائية الحديدية وأورجانويدس فيما بعد (بما في ذلك إنتاج الجوهرية مما يشير إلى مركبات) غير معروف، ويمكن استكشافها. أيضا، في حين أننا إظهار التعبير عن الجينات المرتبطة ب — وتوحي بذلك – الأصل الدماغ، تقع داخل هياكل شكلياً مشابهة لتلك التي أوردها موجوروما et al.، لا يمكننا أن نستبعد جيل من الخلايا العصبية تشبه الهياكل التي هي الهوية غير الدماغ. الدراسات المستقبلية، استخدام لوحة كبيرة من الأجسام المضادة مثل تلك التي أوردها موجوروما et al. (أي، ATOH1، كالب، إلخ) من شأنه أن يجعل هذه الإحالات، والمقارنة بين المنتجات لكلا البروتوكولين، أكثر حسما.
ضمن البروتوكول ثلاثية الأبعاد، ومن المهم البدء والاحتفاظ بعدد كاف من الخلايا في الثقافة لضمان إعداد كافية من المنتجات النهائية للتحليل. نظراً ليموت قبالة كبيرة مبكرا في البروتوكول، نوصي بدءاً بأكثر من 500 بئر الحديدية/خلال أول 3 أيام في الثقافة (الشكل 1). هذا لا ينبغي أن صعوبة تحقيق أحجام مستعمرة المعطى هبسكس في ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق، ولكن قد لا يكون سهلاً لتلك التي لا تزال تستخدم أساليب تعتمد على التغذية. ونظرا للعدد الكبير من الخلايا، من المهم أن يشاهد لتغيير اللون في المتوسطة (التي تشير إلى تغيرات درجة الحموضة)، وتراكم الخلايا الميتة. ويجب تصحيح على حد سواء لمنع انهيار ثقافة. قد يكون هناك أيضا التثاقل من الخلايا والمجاميع في الهياكل الضخمة. على الرغم من أنه قد لا يزال إلى المجاميع التي يمكن تحليلها، كمية المنتج إلى حد كبير يخفض، حتى كسر منهم إلى مجاميع أصغر مع لطيف تريتوريشن يمكن أن تكون مفيدة. ومع ذلك، تجنب الخلطات طبيعية مثيرة للقلق، هي نفسها يمكن أن تنمو إلى أحجام كبيرة (الشكل 4). إذا أصبحت المجاميع قليلة جداً، فمن المستحسن للجمع بين الآبار بحيث لا تكون المجاميع معزولة تماما. تقلب المنتج (في عدد وحجم ومورفولوجيا) قضية معروفة في الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك تلك البروتوكولات بدءاً من خطوات تشكيل المجلس التنفيذي معزولة، موحدة، مما يوحي بأن إجراء بدء تشغيل أقل تعقيداً (مثل بروتوكول الموصوفة هنا ) يمكن أن تكون العملية أكثر8،15. بينما هذا التغاير هو شيء الباحثين بحاجة إلى أن نضع في اعتبارنا، لا سيما أثناء التحليل، المبلغ عنها البروتوكول إنشاء المنتجات بما يتفق مع تلك التي وجدت في الأخرى البروتوكولات 3D8،،من915. استناداً إلى حجم ومورفولوجيا، أنها تقع ضمن نطاق روزيت العصبية الدماغية أورجانويد، كما هو موضح في استعراض أجرى مؤخرا من كيلفى وجامعة لانكستر15، مع الأكثر من المناسب تصنيف كروي. ملحوظة خاصة، هي وجود هياكل ثلاثية الأبعاد توحي بمأخذ العصبية مع التجويف ومناطق البطين (الفرعية) ومعيني الشكل الشفة مثل ميزات (الشكل 5 و الشكل 6) كما حددتها جماعات أخرى8 , 15 , 16 , 17-حيث تنتج كل تجربة واحدة على الأقل التجميعية مع المفترضة VZ/سفزس وعلامات مرتبطة بالدماغ (ZIC1، KIRREL2)، تلك معايير مفيدة لتحديد نجاح التفريق 3D استخدام لدينا البروتوكول، مع مثل RL ميزات توفير دعم إضافي. تمديد طول ثقافة الماضي 35 يوما كان لم تختبر، ولكن يمكن اتباعها لتحديد أقصى حد من النمو والتعقيد، والنضج يسمح بهذا الأسلوب.
يستخدم بروتوكول ثنائي الأبعاد بنفس تشكيل المجلس التنفيذي غير ملتصقة وعملية الاستقراء العصبية كبروتوكول ثلاثي الأبعاد وحتى تنطبق أيضا التعليقات الواردة أعلاه. وبمجرد مطلي، ينبغي النظر في مجموعة مختلفة من الاعتبارات. الحديدية ينبغي أن يتقيد بسرعة للخلايا تنتشر إلى الخارج على اللوحة. إذا كانت هناك مشاكل مع الالتزام، بالإضافة لري (إذا لم تكن قد استخدمت)، خفض حجم متوسط، أو قد يتم تطبيق تغييرات تجريبية في تركيز منظمة التحرير الفلسطينية/لام. من المهم أن تبقى الخلايا من زراعة كثيفة أو قليلة جداً (يفضل أن تكون نمت بين 20-80% كونفلوينسي) في الآبار؛ الرصد اليومي وباساجينج في الوقت المناسب من المهم تجنب الخلايا كونفلوينسي أكثر أو عائمة. خلافا للبروتوكول ثلاثي الأبعاد، لا ينبغي يموت قبالة كبيرة خلال الثقافة، على الرغم من أنه قد تكون هناك مناطق ضعف النمو، أو تباطؤ معدلات انتشار. باساجينج يؤثر على حالة نضوج الخلايا (على سبيل المثال، إزالة عمليات الخلية والشبكات المتقدمة بين الخلايا) وينبغي أن يوضع في الاعتبار عند الاقتراب من النقاط حيث سيتم جمع الخلايا أو تحليلها على نحو ما. على سبيل المثال، للكالسيوم التصوير فإنه من المهم جداً خلايا المرور بين 2-6 أيام قبل التحليل. باساجينج قريبة جداً من التحليل قد يعني الخلايا لم يتح الوقت للاتصال و/أو ناضجة، وبعيدا جداً قد تؤدي إلى خلايا الاكتظاظ، مما يجعل التصوير صعباً. على الرغم من أن قد يوجد تباين بين التجارب، نتائج تتسق مع تلك التي أبلغ عنها في البروتوكولات الدماغ الأولية في 2D1،2. تحليل التعبير تلطيخ والجينات في المحكمة الجنائية الدولية تؤكد وجود خلايا إيجابية بالنسبة لعلامة خلية الحبيبية ZIC1، بينما أيضا تحديد علامات المرتبطة مع الهويات الأخرى العصبية والدماغ (الشكل 7 و الشكل 8). تصوير الكالسيوم، الذي ينطوي على التحفيز الكهربائي للخلايا المحتضنة مع صبغة fluor5، أشارت إلى نشاط الخلايا العصبية الوظيفية (الشكل 9و تكميلية الرقم 1، و الإضافي رقم 2)، على الرغم من أنه لم يتم تأكيد إذا كانت هذه وكانت الخلايا الحبيبية. ويمكن القول أن بإعطاء المزيد من الوقت خلايا ناضجة بتمديد فترة ثقافة الماضي 35 يوما، ينبغي زيادة حجم نشاط الخلايا العصبية الوظيفية. ويمكن استكشاف هذه الإمكانية في المستقبل.
بالإضافة إلى خطوط البحوث المقترحة أعلاه، سيكون من اهتمام لتحديد الاختلافات في الهويات المنتج (كمية ونوعية) بين البروتوكولات 2D و 3D. أهمية اقتراحاتك الخارجية كان لم تختبر في 2D البروتوكول، وسيكون من المفيد أن نعرف إذا كان الافتقار إلى هيكل ثلاثي الأبعاد بعد الطلاء، وحتى مسارات الإشارات المرتبطة بها، أن تجعل الثقافات 2D أكثر أو أقل اعتماداً على تلك الزخرفة أوائل المركبات. أكثر البروتوكولات تجريد لأسفل (مثل، لا جمهورية أرمينيا، بدنف، تبلد) بنفس القدر خطوط معقولة لإجراء مزيد من التحقيقات. وأخيراً، الدراسات المستقبلية قد تستفيد من أدوات البحث الجديدة لأفضل وصف (وتقييم كفاءة توليد) المخططات العصبية الدماغ الخاصة بالإنسان.
مع تحذيرات معينة في الاعتبار، سواء ذكرت يمكن استخدام بروتوكولات للاختلاف الدماغ، مع منتجات ملائمة لأغراض مختلفة. أنها قد تخدم كنقطة انطلاق عملية للباحثين إجراء الدراسات التجريبية واختبار صلاحية خطوط الخلايا لمثل هذا الاختلاف، أو كنموذج أساسي لأنواع أخرى من تمايز العصبية المستهدفة.

البروتوكولات في المختبر للتفرقة بين هبسكس تجاه الأنساب الدماغ في البداية تعمل على مبدأ محاكاة3،2، في فيفو التنمية الدماغ1،4. على هذا النحو، أنها تتطلب سلسلة عوامل التي أدخلت في أوقات محددة محرك الزخرفة برو-الدماغ والنضج. كانت WNT، العظام ومن أهم هذه البروتينات مورفوجينيتيك (BMPs)، وعوامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (تعملك) مع أدوار معروفة في منتصف هيندبرين التنمية وتشكيل منظم البرزخية5،،من67. وبطبيعة الحال، كل خطوة إضافية وعامل يعني زيادة في التلاعب كثيفة العمالة وزيادة المصروفات للباحث، وحتى وضع بروتوكولات أبسط قادرة على تحقيق نتائج المساواة من مصلحة. هذه المسألة العملية ممزوج لطيف مع مسألة افتراضية، ما إذا كانت الخلايا تتطلب مثل هذا ضيق، والخارجية السيطرة على التنمية في المختبر.
للتفريق بين الدماغ، موجهة بروتوكول نشر في عام 2015 بضرورة استخدام عدد وافر من عوامل النمو باستخدام فقط FGF2، FGF19، وعامل المستمدة من الخلايا اللحمية 1 (SDF1) لأغراض8الزخرفة. كما تختلف هذه الدراسة البروتوكولات الدماغ السابقة، باستخدام نظام التعويم حر ثقافة 3D. بالإضافة إلى إنتاج الخلايا إيجابية لعلامات الدماغ، والدماغ "أورجانويدس" التي تم إنشاؤها بواسطة التقنية عرضت يحمل مورفولوجيا ذات الصلة، غير متوفرة في ثقافات أحادي الطبقة 2D التقليدية، مثل الهياكل الشبيهة بشفة معيني الشكل. على الرغم من أن أقل تعقيداً وتكلفة فيما يتعلق بعوامل النمو، ميزات أخرى مثل تشكيل الهيئات امبريويد موحدة (EBs) وثقافة في لوحات 96-جيدا (96WPs)، جعلت من الناحية الإجرائية المعقدة خلال الخطوات الأولية. بروتوكول ثلاثي الأبعاد آخر نشر في نفس العام, حسبما ذكرت التمايز ناجحة للأنساب العصبية باستخدام خلية مشتركة وغير مكلفة الثقافة تقنيات9. على الرغم من أن هذا الفريق كان يحقق القشرية بدلاً من التمايز الدماغ، يمكن أن لا تكون مخفضة تطبيق مفهومها للتمايز الدماغ.
أبلغنا مؤخرا بروتوكول تمايز الدماغ ثلاثي الأبعاد باستخدام عدد أقل من العوامل الزخرفة (أي، FGF2، 4 و 8)، فضلا عن إعداد مبسط بإبقاء الخلايا في لوحات 6-جيدا (6WPs) في جميع أنحاء التقليل إلى أدنى حد من متطلبات متوسطة10. مساعدة إنتاج الخلايا الحبيبية، استخدمت مؤثر طرية (تبلد) أثناء الخطوة النضج النهائي. تبلد هو بديل أقل تكلفة المواد كيميائية للقنفذ سونيك (SHH)، التي كانت تستخدم في وقت سابق الدماغ البروتوكولات، نظراً لدورها في تعزيز نمو الحبيبية خلية السلائف (أوتوماتية) في فيفو1،2، 11،،من1213. تمايز المنتجات كانت متسقة مع تلك من بروتوكولات أخرى ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك وجود علامات مرتبطة بالدماغ في الهياكل ذات الصلة شكلياً8،9. مثل هذه النتائج تعزيز الرسالة السابقة التي مفصلة تقليد في فيفو البيئة قد لا تكون ضرورية لبروتوكولات معقدة ثلاثية الأبعاد في المختبر التمايز.
ويصف هذا التقرير بالإضافة إلى البروتوكول 3D، بروتوكول ثنائي الأبعاد، مصمم بنفس الإعداد السريع، المواد الأساسية، وخفض عدد من عوامل النمو. هو قادر على إنتاج الخلايا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) أو بفعل الخلايا الجذعية pluripotent (هيبسكس)، وإيجابية للعلامات المرتبطة بوقت مبكر العصبية، والدماغ، والخلايا الحبيبية الهويات. وباﻹضافة إلى ذلك، تصوير الكالسيوم يدل على وجود الخلايا العصبية البشرية الفنية. القدرة على الاختيار بين البروتوكولات، ويضيف قدرا من المرونة للباحثين، للراغبين في أما: خلية معينة (1) توليد أنواع، ونمو الدماغ البشري (2) النمذجة والهياكل، (3) تحليل الأمثل في أحادي الطبقة المرتبطة إعدادات (مثلاً، تسجيلات المشبك التصحيح)، أو (4)-خلية التفاعلات في الثقافات العصبية مختلطة. طبيعتها بسيطة ومنخفضة التكلفة، يجعل منها موجوداً للباحثين الذين جديدة إلى الميدان هبسك، أو تحتاج إلى إجراءات هبسك قاعدة لاستكشاف المزيد من خيارات التفريق منه.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>glutamine fortified DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>neural basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Imgen</td>
			<td>PT468-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>aka Poly-Hema</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium and supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>hPSC medium and supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>SelleckChem</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 um filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM996</td>
			<td>wrap for culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>368632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>trypsin-based dissociation agent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>100-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-8B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic Factor 3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened Agonist (SAG)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11914</td>
			<td>CAS 912545-86-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 40C microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging - image aquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0996</td>
			<td>centrifuge for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>3623140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESCs</td>
			<td>WiCELL</td>
			<td></td>
			<td>line H01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification

الحد من التعقيد والتكلفة من البروتوكولات التفريق مهم للباحثين. يناسب هذا الاهتمام بالشواغل المتعلقة بالآثار غير المقصودة أن العوامل الخارجية الزخرفة يمكن إدخال الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسك) نماذج نمو الدماغ أو الفيزيولوجيا المرضية، مثل إخفاء المرض النمط الظاهري. وهنا، نقدم البروتوكولين التمايز الدماغ هبسكس، مصممة مع أبسط طريقة لبدء تشغيل، عوامل الزخرفة أقل، وأقل المتطلبات المادية من البروتوكولات السابقة. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير إجراءات الثقافة، التي تولد التعويم الحر المنتجات ثلاثي الأبعاد (3D) يتفق مع البروتوكولات الأخرى "أورجانويد" في الدماغ، بما في ذلك مورفولوجيس معيني الشكل وذات الصلة للنمذجة نمو الدماغ مثل المنطقة الفرعية/البطين- الهياكل الشبيهة بشفة. والثاني يستخدم إجراء أحادي الطبقة ملتصقة، 2D للتفريق الكامل، الذي يظهر قادرة على توليد الخلايا العصبية الدماغ الوظيفية، منتجات إيجابية للعلامات المرتبطة بالدماغ، ويحمل تدفق الكالسيوم تشبه الخلايا العصبية. معا، هذه البروتوكولات تقدم العلماء خياراً خيارات مناسبة لأغراض بحثية مختلفة، فضلا عن نموذج أساسي لاختبار أنواع أخرى من الاختلاف العصبية مبسطة.

نظرة عامة مرئية لانخفاض النمو عامل بروتوكولات التمايز الدماغ في 2D و 3D ويبين الشكل 1 بالجدول الزمني الشامل للبروتوكولات التمايز الدماغ 2D و 3D، تحديد الوقت للطلاء وعوامل خارجية. التقدم نموذجية هبسكس تمر التمايز الدماغ ثلاثي الأبعاد هو مبين في الشكل 2: مع خط هيس H01 ابتداء المستعمرات في ثقافة خالية من التغذية في اليوم 0 (أعلى يسار الشكل)؛ يخضع تشكيل المجلس التنفيذي بحلول يوم 2 (العلوي الأوسط)؛ تتحول إلى أكبر خلية المجاميع مع التجويف الظاهر بعد التعريفي العصبية مع جمهورية أرمينيا و FGF8 في يوم 14 (أعلى اليمين)؛ تشكيل المجاميع متفاوتة الحجم والشكل في يوم 28 (أدنى اليسار)؛ النامية في التعقيد مع هياكل مختلفة مجموع واحد المبين في يوم 28 (الشرق الأدنى)؛ ومع استمرار التغيرات المورفولوجية للهياكل نفسها في يوم 35 (أسفل اليمين). التقدم نموذجية هبسكس تمر 2D التمايز الدماغ هو مبين في الشكل 3: مع هيس خط H01 كمستعمرات في ثقافة خالية من التغذية في اليوم 0 (الأيمن العلوي من الشكل، مع الدائرة التي تشير إلى منطقة خلايا المتمايزة بين المستعمرات هيس) ; يخضع تشكيل المجلس التنفيذي بحلول يوم 2 (العلوي الأوسط)؛ تتحول إلى أكبر خلية المجاميع مع التجويف الظاهر بعد التعريفي العصبية مع جمهورية أرمينيا و FGF8 في يوم 13 (أعلى اليمين)؛ تنتشر كخلايا ملتصقة بعد الطلاء في يوم 14 (أدنى اليسار)؛ ومن ثم كأحادي الطبقة الخلايا التي تحتوي على مورفولوجيا أكثر نضجاً/مجمع في اليوم 35 تحت منخفض (الشرق الأدنى) وتضخم عالية (أسفل اليمين).
منتجات 3D يحمل علامات وهياكل نيوروبيثيليوم المبكر الشكل 2 (الصورة اليسرى السفلي) وإظهار الرقم 4 إلى التباين في مورفولوجيا التجميعية 3D ينظر في جميع أنحاء استزراع، نظراً لاختلاف النمو و/أو معدلات النضج، فضلا عن دمج العشوائية أو كسر بعيداً من المجاميع. وعلى الرغم من عدم التجانس، تنتج كل تفرقة المجاميع العارضة أوائل علامات العصبية والخلايا العصبية، بما في ذلك علامة الحبيبية للدماغ ZIC1، كما أشار إيمونوسيتوتشيميستري (المحكمة الجنائية الدولية) تلطيخ في الشكل 5. الأهم من ذلك، الرقم 5 و الرقم 6 تشير إلى أن ثقافة 3D بسيطة، مع تقليل عوامل النمو، قادرة على توليد المجاميع مع الهياكل المعقدة المتصلة بنمو الدماغ مثل نيوروبيثيليوم المبكر والشفة معيني الشكل.
منتجات 2D يحمل علامات الدماغ ونشاط الخلايا العصبية الوظيفية بينما لا يمكن استنساخ الثقافات 2D الهياكل ثلاثية الأبعاد المعقدة، فقادرة على توليد الخلايا العارضة أوائل علامات العصبية والخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا الحبيبية للدماغ علامة ZIC1، كما هو مبين تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية في الشكل 7. تحليل التعبير الجيني عن طريق الرايت-بكر، كما هو مبين في الشكل 8، وتؤيد نتائج المصبوغة المحكمة الجنائية الدولية، على الرغم من وجود علامة الخلايا الحبيبية المبكر ATOH1 متغير بين التجارب وخطوط. تصوير الكالسيوم تتم بسهولة أكثر في 2D الثقافة. كما يتضح في الشكل 9و التكميلي فيديو 1 التكميلي فيديو 2، تظهر الخلايا كهربائياً حفز تدفق الكالسيوم التي نموذجية من أنماط الخلايا العصبية إطلاق النار، مما يوحي بجيل من الخلايا العصبية الوظيفية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> رقم 1: الجدول الزمني للبروتوكول التمايز (بدءاً من اليوم 0 من التمايز). تشير خانات خط متصل إلى عندما تضاف عوامل محددة إلى متوسط الثقافة، وتشير خانات الخط المنقط إلى لوحة-طلاء لتعديل اختياري في 2D. FGF2، يشير السهم إلى الأسفل لتركيزات أقل (4 نانوغرام/مليلتر)، ويشير السهم إلى تركيزات أعلى (20 نانوغرام/ملليلتر). وقد تم تعديل هذا الرقم من هولمز وهاينه10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> رقم 2: الصور برايتفيلد ممثل عن البروتوكول 3D- المستعمرات هيس في d0، الحديدية في d2، المجاميع بعد التعريفي d14، ومجاميع مختلفة الحجم ومورفولوجيا (مرقمة 1-5) في d28، تجميع واحد مع ميزات فريدة من نوعها، شخصية (المشار إليها بالحروف –ج) في d28، و تغييرات مرئية في نفس الميزات في d35. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من هولمز وهاينه10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> الشكل 3: الصور برايتفيلد ممثل عن البروتوكول 2D. المستعمرات هيس d0، الحديدية في d2، المجاميع بعد التعريفي في d13، بعد تصفيح المجاميع في d14، بعد نضوج في d35 كما رأينا في 5 x التكبير، والتكبير x 20. الدائرة البيضاء في اللوحة اليسرى العلوية يظهر مجال الخلايا المتمايزة بين المستعمرات هيس. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> الشكل 4: صور برايتفيلد تظهر متفاوتة الحجم والتعقيد في الثقافة 3D- المجاميع في اليوم (أ) 8 (هيسكس)، و d35 (ب) (هيبسكس). الصورة الأخيرة تتكون من ثلاث صور منفصلة لإظهار الكامل التجميعية. كل المجاميع قد تأثرت بدمج المجاميع أو الخسارة (قطع) هياكل أصغر. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يتم إعادة نشر هذا الرقم من هولمز وهاينه10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> الرقم 5: المحكمة الجنائية الدولية صور المنتجات ثلاثية الأبعاد تظهر علامات ذات الصلة وهياكل- في ثقافة d35، معرض المنتجات ثلاثية الأبعاد: PAX6 (أخضر) و TBR2 (أحمر) من التجويف من العصبية مثل روزيت تشكيل (الصف الأول)؛ DCX (الأخضر) و NeuN (أحمر) تنتشر من منطقة البطين الحافة الخارجية (VZ)-مثل هيكل (الصف الثاني)؛ KIRREL2، علامة المرتبطة نيوروبيثيليوم الدماغ (الثالث للصف، اليسار)؛ والخلايا ZIC1 علامة المقترنة الحبيبية للدماغ (الصف الثالث، حق). أجريت التجربة عدة مرات باستخدام أربعة خطوط هبسك مختلفة: هيس خط H01 (ن = 5)، و hvs88 الخطوط التوجيهية (n = 4)، hvs60 (ن = 3)، و hvs51 (n = 1). تشير الأسهم إلى الشفة معيني الشكل (RL)-مثل الهيكل. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يتم إعادة نشر هذا الرقم من هولمز وهاينه10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> رقم 6: بنية شبيهة بمنطقة البطين واسعة النطاق في المنتج 3D. في ثقافة d35، تجميع المستمدة من هيس الإيجابية PAX6 (الأخضر) والمرتبطة عادة بالخلايا العصبية المبكرة وجدت داخل بطيني (فزس) ومناطق سوبفينتريكولار (سفزس)، في فيفوTBR2 (أحمر). (أعلى) علامات نجمية (*) الجانب قمي من منطقة VZ مثل تشغيل على طول حافة الإجمالية، مع الأقواس تشير إلى عمق/شعبة VZ/إشارات سفزس. (الأوسط) ممزوج إظهار الأجزاء المتناثرة من PAX6 +/TBR2-الخلايا زيادة في حجم تجاه الطرف الأيمن العلوي من VZ. (أسفل) صورة التكبير أعلى المقطع أشارت إلى مستطيل في وسط الفريق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من هولمز وهاينه10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> رقم 7: صور غرفة التجارة الدولية للمنتجات 2D إظهار علامات ذات الصلة- في ثقافة d35، معرض المنتجات 2D، هيسكس (الصف العلوي) وهيبسكس (الصف السفلي)، الخلايا إيجابية بالنسبة: علامة خلية الحبيبية ZIC1 والمهاجرة العصبية الدماغ علامة TAG1 (العمود الأيمن)؛ وعلامة العصبية نيوروفيلامينت (NF) و TAG1 (العمود الأيمن). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> الشكل 8: RT-PCR في 2D المنتجات. تحليل التعبير مرناً لخط هيس H01 (الصف العلوي) وهيبسك خط hvs60 (الصف السفلي) في نهاية 2D يوضح البروتوكول المنتجات مع التفريد جل ل: الحبيبية علامة خلية ZIC1، علامة خلية الحبيبية ATOH1، والهجرة العصبية الدماغ علامة TAG1، بوركنجي علامة كالبيندين (كالب)، قناة الكالسيوم تعتمد على الجهد CACNA1A من خلية (ج-1A)، CACNA1E (ج-1E)، مستقبلات حمض غاما – أمينوبوتيريك (GABA) ب 1 (ز-Br1)، والتدبير المنزلي الجين EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> الشكل 9: تصوير الكالسيوم/تحليل منتجات 2D. في ثقافة d35، سجلت هبسك تمايز المنتجات لمدة 2 دقيقة تحت المجهر، بعد الحضانة مع صبغة fluor5. في 30 ثانية، حفز الخلايا كهربائياً لمدة 10 s في 10 هرتز-(أ) لا تزال صور هيسكس تظهر في 0 s (يسار) وبعد بدء التحفيز الكهربائي في 30 s (يمين). تشير الأسهم إلى المنطقة للفائدة (ROI) لتحليل تدفق الكالسيوم. (ب) تحليل رسومي يظهر التغيير في الأسفار النسبي مقابل الوقت للعائد على الاستثمار (تغيير في الأسفار = &/F (F-F0)0, حيث و0 = (∑F1-n)/n)، مع طفرات مثل الخلايا العصبية التي تحدث قبل وأثناء وبعد التحفيز. شريط أسود يشير إلى طول التحفيز الكهربائي. مقياس بار (أبيض) = 50 ميكرومتر. كامل التسجيل لهيس (كما يتضح هنا) وخط هيبسك (غير معروضة) توجد في التكميلي فيديو 1 و 2 الفيديو التكميلية، على التوالي. تسجيلات في شكل أفي، سرعة 4 x. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
1 الفيديو التكميلي: الكالسيوم التصوير الفيديو في 2D المنتج من سطر هيس H01. في ثقافة d35، صبغ تمايز المنتجات من خط هيس H01 سجلت لمدة 2 دقيقة تحت المجهر، بعد الحضانة مع fluor5. في 30 ثانية، حفز الخلايا كهربائياً لمدة 10 s في 10 هرتز-التسجيلات المحرز في إطارات 2/s، ومعالجتها إلى فيديو AVI ~ 7 إطارات في الثانية، إنتاج شريط فيديو دائم ~ 30 ثانية، سرعة ~ 4 x. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
2 الفيديو التكميلي: الكالسيوم التصوير الفيديو في 2D المنتج من هيبسك خط hvs51- في ثقافة d35، سجلت تمايز المنتجات من هيبسك خط hvs51 لمدة 2 دقيقة تحت المجهر، بعد الحضانة مع صبغة fluor5. في 30 ثانية، حفز الخلايا كهربائياً لمدة 10 s في 10 هرتز-التسجيلات المحرز في إطارات 2/s، ومعالجتها إلى فيديو AVI ~ 7 إطارات في الثانية، إنتاج شريط فيديو دائم ~ 30 ثانية، سرعة ~ 4 x. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification at JoVE.com

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

ونحن تصف متوسطة بروتوكول هبسكس، باستخدام تعريف تمايز 3D مبسطة وتخفيض عوامل النمو، قادرة على توليد المجاميع الخلية مع أوائل نيوروبيثيليال الهياكل وإيجابية بالنسبة لعلامات مرتبطة بالدماغ، فضلا عن اختياري 2D التعديل للتفريق بين الخلايا كأحادي الطبقة لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية.

بروتوكول التمايز الدماغ 3D مبسطة مع التعديل 2D اختياري

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D عضوي النمط المشارك الثقافة نموذج دعم النخاع التوتة الظهارية تكاثر الخلايا، التمايز ومختلط التعبير الجيني

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

فيفو السابقين الثقافة من الفرخ مخيخي شرائح المستهدفة ومكانيا Electroporation للمن الحبيبة السلائف الخلية

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

بروتوكول لتمييز الخلايا الجذعية المحفزة البشرية المستحثة في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية والجلد للاختبار العصبي

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

التقديم ثلاثي الأبعاد وتحليل إيمونولابيليد، أوضح البشري شبكات الأوعية الدموية فيلوس المشيمية

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

فقدان وظيفة تحليل في الحبيبية للدماغ كريسبر بوساطة خلايا تستخدم في الرحم على أساس انهانسر نقل الجينات

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

الارتداد الكيميائية للخلايا الجذعية Pluripotent البشرية التقليدية إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع التمايز مولتيلينيجي تحسين فاعلية

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

النمذجة سليكون متشابك مع 3D كوكولتوريس أستروسيتيس والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

العلاج العابر للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى مع DMSO لتعزيز التمايز

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...