Name: streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Gerbren Jacobs og Jurjen Broeke deres teknisk ekspertbistand til Prisca Leferink for at bidrage til generation og karakterisering af to kontrol iPSC linjer og Lisa Gasparotto for at vise vores procedurer.

<ol>
	<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2012).</li><li>Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebellar+neuron+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 290, 287-296 (2006).</li><li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons.">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).</li><li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrailed,+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain--hindbrain+development.">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development.</a> Trends Genet. 12, 15-20 (1996).</li><li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otx2,+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer.">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).</li><li>Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Development-The+Impact+of+Preterm+Birth+and+Comorbidities.">Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities.</a> Fetal and Neonatal Physiology. , (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12, 671-678 (2015).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium.">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6, 402-406 (2017).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened.">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells.">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li><li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6,+Tbr2,+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia,+intermediate+progenitor+cells,+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex.">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li><li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming.">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Kompleksitet og omkostninger er relevante faktorer for stamcelleforskning forskere ved at vælge eller udvikle differentiering protokoller. Dette gælder især, da det er et åbent spørgsmål om hvor meget ekstern kontrol er nødvendige for at generere ønskede celletyper, eller — at udgøre det anderledes – hvordan kompetente hPSCs til at producere deres egen udviklingsmæssige miljø, hvis overladt til sig selv med tilstrækkelig næringsstoffer. Indførelsen af ydre faktorer i vitro kan meget godt producere ønskede celle produkter, men de kan også interferere med de iboende udviklingsmæssige kapacitet celler ville have udstillet i vivo. Sådanne overvejelser er vigtige, især hvis målet er brugen af patient-afledte iPSCs for sygdom modellering. Omfattende brug af mønstre og/eller vækstfaktorer kunne maskere sygdom fænotyper. De protokoller, der er beskrevet i denne betænkning følger udviklingen i tidligere undersøgelser til at reducere kompleksiteten, omkostningerne og/eller brug af ydre mønstre faktorer8,9.
Baseret på resultaterne rapporteres af Muguruma et al., og vores egne nylige undersøgelse, det ser ud til at det er muligt at opnå differentiering mod cerebellare skæbner uden en samordnet indsats at gengive i vivo betingelser, som tidligere undersøgelser har gjort 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. den spændende del er, at de to studier brugte forskellige sæt af vækstfaktorer, hvilket tyder på, at hverken sæt var nødvendig, selvom begge brugt FGF2. Vi kørte yderligere prøver, hvor FGFs blev selektivt udelukket fra protokollen, og viste, at celler var i stand til at generere de samme produkter uden ydre FGFs10. Forskelle mellem vores undersøgelser var kvalificeret ved, at vi brugte forskellige hPSC linjer og kultur metoder, induceret neurale differentiering med RA og omfattede komponenter til at understøtte granula celle overlevelse og modning (BDNF, GDNF, SAG og KCL)11 -14. Derudover blev en mindre komplekse start metode, sammenlignet med Muguruma et al., ansat. Deres protokol begyndte ved at generere ensartet EBs i 96WPs, hvilket afskar dem fysisk og kemisk fra hinanden. Protokol her havde alle PSC'er relativt stuvet sammen i 6WPs under EB dannelse, som tillod dem at kommunikere frit. Hvordan kan dette varierende har påvirket de fysiske og kemiske miljø af EBs og senere organoids (herunder iboende produktion af signalering forbindelser) er ukendt, og kan udforskes. Også, mens vi viser udtrykket af gener forbundet med — og så tyder på – cerebellare oprindelse, ligger inden for strukturer morfologisk ligner dem rapporteret af Muguruma et al., vi ikke kan udelukke generation af neuronal-lignende strukturer, er af ikke-cerebellare identitet. Fremtidige undersøgelser, ved hjælp af et stort panel af antistoffer som rapporteret af Muguruma et al. (dvs., ATOH1, CALB, osv.) ville gøre disse opgaver og sammenligning mellem produkter af begge protokoller, mere afgørende.
Inden for 3D-protokollen, det er vigtigt at starte med og opretholde et tilstrækkeligt antal celler i kultur til at sikre tilstrækkelig antal slutprodukter til analyse. Givet betydelige die-off tidligt i protokollen, anbefaler vi at starte med mere end 500 EBs/godt i de første 3 dage i kultur (figur 1). Dette bør ikke være svært at opnå en given koloni størrelser for hPSCs i feeder-fri kultur, men måske ikke være så let for dem, der stadig bruger feeder-afhængige metoder. I betragtning af det store antal celler, er det vigtigt at holde øje med farveskift i medium (med angivelse af pH-ændringer) og ophobning af døde celler. Begge skal rettes for at forhindre sammenbrud i kulturen. Der kan også være sammenklumpning af celler og aggregater i massive strukturer. Selv om det kan stadig resultere i aggregeringer, der kan analyseres, vil produktantal blive stærkt reduceret, så bryde dem i mindre aggregater med blid ændring kan være nyttige. Men undgå foruroligende normale aggregater, der selv kan vokse til store størrelser (figur 4). Hvis aggregater bliver alt for sparsomme, anbefales det at kombinere brønde, så aggregater ikke er helt isoleret. Produkt variation (i antal, størrelse og morfologi) er et velkendt problem i 3D cellekultur, herunder for de protokoller, begyndende med isolerede, ensartet EB dannelse trin, tyder på, at en mindre komplekse startprocedure (som protokol beskrevet her ) kunne være mere praktisk8,15. Mens denne heterogenitet er noget forskere skal holde sig for øje, navnlig under analysen, genereret rapporterede protokollen produkter i overensstemmelse med dem, der findes i andre 3D protokoller8,9,15. Baseret på størrelse og morfologi, falder de inden for intervallet af neurale roset til cerebral organoid, som beskrevet i en nylig gennemgang af Kelava og Lancaster15, med de mest passende klassificering af klumpformet. Særlig bemærkelsesværdig, er tilstedeværelsen af 3D strukturer tyder på neurale rosetter med lumen, (sub) ventrikulær zoner og rombeformede læbe ligesom funktioner (figur 5 og figur 6) som identificeret af andre grupper8 , 15 , 16 , 17. da hvert eksperiment produceret mindst én samlet med formodede VZ/SVZs og cerebellare-associerede markører (ZIC1, KIRREL2), dem er nyttige kriterier til bestemmelse af succes af en 3D differentiering ved hjælp af vores protokol, med RL-lignende funktioner, der giver ekstra støtte. Udvide varigheden af kultur sidste 35 dage blev ikke testet, men kunne forfølges for at bestemme det maksimale omfang af vækst, kompleksitet og modenhed tillader denne teknik.
2D-protokollen bruger de samme ikke-tilhænger EB dannelse og neurale induktion processen som 3D-protokollen og så den bemærkninger ovenfor gælder også. Når forgyldt, bør et andet sæt overvejelser overvejes. EBs bør overholde hurtigt for celler til at formere sig udad på pladen. Hvis der er problemer med tilslutning, tilsætning af RI (hvis ikke allerede bruges), reduceret omfanget af medium, eller eksperimentelle ændringer i PLO/LAM koncentration kan anvendes. Det er vigtigt at holde celler fra vokser alt for tætte eller sparsomme (helst voksne mellem 20-80% confluency) i brøndene; daglig overvågning og rettidig passaging er vigtigt, at undgå over-confluency eller flydende celler. I modsætning til 3D-protokol, bør der ikke være betydelig die-off under kultur, selvom der kan være områder med dårlig vækst, eller en opbremsning af spredning priser. Passaging påvirker tilstanden modning af celler (f.eks. fjernelse af celle processer og udviklede netværk mellem celler) og bør holdes for øje, når man nærmer sig punkter hvor celler vil blive indsamlet eller analyseres på anden måde. For eksempel, for calcium er imaging det meget vigtigt at passage celler mellem 2-6 dage før analyse. Passaging for tæt på kan analyse betyde celler ikke har haft tid til at oprette forbindelse og/eller ældre, og for langt, kan resultere i celler overbelægning, vanskeliggør billeddannelse. Selv om variabilitet mellem eksperimenter kan eksistere, stemmer resultater overens med rapporteret i oprindelige 2D cerebellare protokoller1,2. ICC farvning og gen expression analyse bekræfte tilstedeværelsen af celler positive for granula celle markør ZIC1, mens også identificere datamærker forbundet med andre neurale og cerebellare identiteter (figur 7 og figur 8). Calcium billeddannelse, som omfatter elektrisk stimulation af cellerne inkuberes med fluor5 farvestof, anført funktionel neuronal aktivitet (figur 9, supplerende figur 1og supplerende figur 2), men det ikke er bekræftet hvis disse var granula celler. Det kan diskuteres, at ved at give celler mere tid til at modnes ved at forlænge varigheden af kultur sidste 35 dage, mængden af funktionelle neuronal aktivitet bør øge. Dette potentiale kunne udforskes nærmere i fremtiden.
Ud over linjer af forskning ovenfor foreslåede, ville det være af interesse at bestemme forskellene i produkt identiteter (mængde og kvalitet) mellem 2D- og 3D-protokoller. Betydningen af ydre FGFs var ikke testet i 2D-protokollen, og det ville være nyttigt at vide, hvis manglende 3D struktur efter plating, og så den tilknyttede signaling veje, ville gøre 2D kulturer mere eller mindre afhængig af dem tidligt mønster forbindelser. Mere skrabet protokoller (f.eks.ingen RA, BDNF, SAG) er lige så plausible linjer til yderligere undersøgelse. Endelig, fremtidige undersøgelser kunne drage fordel af nye forskningsværktøjer til bedre karakterisere (og vurdere generation effektivitet) human-specifikke cerebellare neuronal undertyper.
Med de givne forbehold in mente rapporterede begge protokoller kan anvendes til cerebellare differentieringer, med produkterne passer til forskellige formål. De kan tjene som praktisk udgangspunkter for forskere foretage pilotundersøgelser, test levedygtighed af cellelinjer til sådanne differentieringer, eller som en grundlæggende model for andre typer af målrettede neurale differentiering.

In vitro protokoller for differentiere hPSCs mod cerebellare lineages oprindeligt drives på princippet om efterligne i vivo cerebellare udvikling1,2,3,4. Som sådan, krævede de en lang række faktorer indført på bestemte tidspunkter til at køre pro-cerebellare mønstre og modning. Chief blandt disse var WNT, ben morfogenetiske proteiner (BMP), og fibroblast vækstfaktorer (FGFs) med kendte roller i midten baghjernen udvikling og dannelse af isthmic organizer5,6,7. Selvfølgelig hver ekstra skridt og faktor betyder en stigning i arbejdskrævende manipulationer og større udgift for forskeren, og så udvikle enklere protokoller i stand til at opnå lige resultater er af interesse. Dette praktiske spørgsmål passer pænt med det hypotetiske spørgsmål, om cellerne kræver sådanne stramme, ekstern kontrol over deres udvikling i vitro.
Cerebellare differentiering rettet en protokol, der er offentliggjort i 2015 nødvendigheden af ved hjælp af en omfattende række vækstfaktorer ved hjælp af kun FGF2, FGF19 og stromale celle-afledte faktor 1 (SDF1) til mønster formål8. Denne undersøgelse også afveg fra forudgående cerebellare protokoller, ved hjælp af en frit svævende 3D kultur system. Ud over producerende celler positiv for cerebellare markører, blev hjernen "organoids" oprettet af deres teknik vist at udstille relevante morfologi, ikke tilgængelig i traditionelle 2D éncellelag kulturer, som rombeformede læbe-lignende strukturer. Selv om mindre komplicerede og bekostelige med hensyn til vækstfaktorer, andre funktioner såsom dannelsen af ensartet embryoid organer (EBs) og kultur i 96-brønd plader (96WPs), gjorde det proceduremæssigt komplekse under indledende skridt. En anden 3D protokol udgivet samme år, rapporterede vellykket differentiering til neurale lineages ved hjælp af fælles og billig celle kultur teknikker9. Selv om denne gruppe var at undersøge kortikale snarere end cerebellare differentiering, bør anvendelsen af deres koncept for cerebellare differentiering ikke diskonteres.
Vi har for nylig rapporteret en 3D cerebellare differentiering protokollen ved hjælp af et reduceret antal mønstre faktorer (nemlig, FGF2, 4 og 8), samt en forenklet setup ved at holde cellerne i 6-godt plader (6WPs) i hele at minimere medium krav10. For at hjælpe produktionen af granula celler, blev glittesinden agonist (SAG) brugt under trinnet endelige modning. SAG er en billigere kemiske alternativ til sonic hedgehog (SHH), som havde været anvendt i tidligere cerebellare protokoller, på grund af sin rolle i at fremme væksten af granulet celle prækursorer (GCPs) i vivo1,2, 11,12,13. Differentiering produkter var i overensstemmelse med dem fra andre 3D protokoller, herunder tilstedeværelse af cerebellare-associerede markører i morfologisk relevante strukturer8,9. Sådanne resultater styrke den tidligere meddelelse, der detaljeret mimicry i vivo miljø må ikke være nødvendig for komplekse 3D in vitro- differentiering protokoller.
Ud over 3D-protokollen, denne rapport beskriver en 2D protokol, designet med den samme hurtig opsætning, grundlæggende materialer, og reduceret antallet af vækstfaktorer. Det er i stand til at producere celler fra menneskelige embryonale stamceller (hESCs) eller induceret pluripotente stamceller (hiPSCs), positiv for datamærker forbundet med tidligt neurale, cerebellare, og granulet celle identiteter. Derudover indikerer calcium imaging tilstedeværelsen af funktionelle menneskelige neuroner. Mulighed for at vælge mellem protokoller, tilføjer en grad af fleksibilitet for forskere, for der er interesseret i enten: (1) generere specifikke celle typer, (2) modellering menneskelige hjerne udvikling og tilhørende strukturer, (3) analyse optimeret i éncellelag indstillinger (f.eks., patch-clamp optagelser), eller (4) celle-celle interaktioner i blandet neurale kulturer. Deres enkle og prisbillige natur gør dem tilgængelige for forskere, der er nye til feltet hPSC, eller har brug for base hPSC procedurer at udforske yderligere differentiering indstillinger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>glutamine fortified DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>neural basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Imgen</td>
			<td>PT468-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>aka Poly-Hema</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium and supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>hPSC medium and supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>SelleckChem</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 um filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM996</td>
			<td>wrap for culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>368632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>trypsin-based dissociation agent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>100-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-8B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic Factor 3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened Agonist (SAG)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11914</td>
			<td>CAS 912545-86-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 40C microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging - image aquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0996</td>
			<td>centrifuge for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>3623140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESCs</td>
			<td>WiCELL</td>
			<td></td>
			<td>line H01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification

Reducere kompleksiteten og omkostningerne ved differentiering protokoller er vigtig for forskere. Denne interesse passer med bekymringer om mulige utilsigtede effekter at extrinsic mønstre faktorer kan indføre i humane pluripotente stamceller (hPSC) modeller af hjernens udvikling eller Patofysiologi, som f.eks masking sygdom fænotype. Vi præsenterer her, to cerebellare differentiering protokoller til hPSCs, designet med enklere start metode, færre mønstre faktorer, og mindre materielle krav end tidligere protokoller. For nylig har udviklet vi kultur procedurer, som skaber frit svævende 3-dimensionelle (3D) produkter i overensstemmelse med andre hjerne "organoid" protokoller, herunder morfologier relevante for modellering hjernens udvikling som sub/ventrikulær zone- og rhombisk læbe-lignende strukturer. Andet bruger en vedhængende, 2D éncellelag procedure til komplet differentiering, der er vist i stand til at generere funktionelle cerebellare neuroner, som produkter er positive for cerebellare-associerede markører, og udstille neuron-lignende calcium tilstrømning. Sammen, tilbyder disse protokoller forskere et valg af muligheder, der passer til forskellige forskningsformål samt en grundlæggende model for prøvning af andre strømlinet neurale differentieringer.

Visuel oversigt over nedsat vækst faktor 2D og 3D cerebellare differentiering protokoller Figur 1 viser den generelle tidslinje for protokollerne 2D og 3D cerebellare differentiering identifikation af ydre faktorer og tidspunktet for plating. Den typiske fremskridt for hPSCs gennemgår 3D cerebellare differentiering er afbildet i figur 2: med menneskelige stamceller linje H01 starter som kolonier i feeder-fri kultur på dag 0 (øverste venstre hjørne af figur); gennemgår EB dannelsen af dag 2 (øverste midten); vokser i større celle aggregater med tilsyneladende lumen efter neurale induktion med RA og FGF8 på dag 14 (øverst til højre); danner aggregater af varierende størrelse og form på dag 28 (lavere venstre); udvikling i kompleksitet med forskellige strukturer i en enkelt samlet anført i dag 28 (lavere midten); og med fortsat morfologiske ændringer til de samme strukturer i dag 35 (nederst til højre). Den typiske fremskridt for hPSCs gennemgår 2D cerebellare differentiering er afbildet i figur 3: med menneskelige stamceller linje H01 som kolonier i feeder-fri kultur på dag 0 (øverst til venstre på figur, med cirkel med angivelse af området for differentierede celler blandt menneskelige stamceller kolonier) ; gennemgår EB dannelsen af dag 2 (øverste midten); vokser i større celle aggregater med tilsyneladende lumen efter neurale induktion med RA og FGF8 på dag 13 (øverst til højre); prolifererende som vedhængende celler efter plating på dag 14 (lavere venstre); og derefter som en éncellelag af celler med mere komplekse/modne morfologi i dag 35 under low (lavere midten) og høj forstørrelse (nederst til højre).
3D produkter udstille markører og strukturer af tidlige Neuroepithelium Figur 2 (nederste venstre billedet) og figur 4 viser heterogenitet af 3D aggregerede morfologi set hele dyrkning, på grund af varierende vækst og/eller modning priser samt den stokastiske fletning eller bryde fra hinanden af aggregater. Trods heterogenitet producerer hver differentiering aggregater udstiller tidlige neurale og neuronal markører, herunder cerebellare granulet markør ZIC1, som angivet ved immuncytokemi (ICC) farvning i figur 5. Endnu vigtigere, tyder figur 5 og figur 6 på, at en simpel 3D kultur, med reducerede vækstfaktorer, er i stand til at generere aggregater med komplekse strukturer vedrørende hjernens udvikling som tidlig neuroepithelium og rombeformede læbe.
2D produkter udstille cerebellare markører og funktionelle Neuronal aktivitet Mens 2D kulturer ikke kan reproducere komplekse 3D strukturer, er de i stand til at generere celler udstiller tidlige neurale og neuronal markører, herunder cerebellare granula celle markør ZIC1, som angivet af ICC farvning i figur 7. Gen expression analyse via RT-PCR, understøtter som det ses i figur 8, ICC farvning resultater, selv om tilstedeværelsen af tidlige granula celle markør ATOH1 er variabel mellem eksperimenter og linjer. Calcium imaging er mere let håndteres i 2D kultur. Som det ses i figur 9, supplerende Video 1og supplerende Video 2, viser elektrisk stimuleret celler calcium tilstrømning, der er typiske for neuronal affyring mønstre, tyder på generation af funktionelle neuroner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> Figur 1: tidslinje for differentiering protokol (startende fra dag 0 af differentiering). Solid line kasser angiver når specifikke faktorer føjes til substratet, og stiplede linje kasser angive plade-belægning for valgfri 2D ændring. For FGF2, pil ned henviser til lavere koncentrationer (4 ng/mL) og pil op henviser til højere koncentrationer (20 ng/mL). Dette tal er blevet ændret fra Holmes og Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> Figur 2: repræsentant brightfield billeder af 3D protokol. menneskelige stamceller kolonier på d0, EBs på d2, aggregater efter induktion på d14, aggregater i forskellige størrelse og morfologi (nummereret 1-5) på d28, en enkelt aggregat med unikke og identificerbare funktioner (angivet med bogstaver en-c) på d28, og synlige ændringer i de samme funktioner på d35. Skalalinjen = 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra Holmes og Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> Figur 3: repræsentant brightfield billeder i 2D protokol. menneskelige stamceller kolonier en d0, EBs på d2, aggregater efter induktion på d13, efter plating aggregater på d14, efter modning på d35, som det ses på 5 x forstørrelse og 20 x forstørrelse. Den hvide cirkel i øverste venstre panel viser området af differentierede celler blandt menneskelige stamceller kolonier. Skalalinjen = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> Figur 4: Brightfield billeder viser varierende størrelse og kompleksitet i 3D kultur. Aggregater på (A) dag 8 (hESCs) og (B) d35 (hiPSCs). Sidstnævnte billedet består af tre separate billeder at vise hele samlede. Begge aggregater kan være blevet påvirket ved sammenlægning af mindre aggregater eller tab (afbryde) af strukturer. Skalalinjen = 200 µm. Dette tal er genudgives fra Holmes og Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> Figur 5: ICC billeder af 3D produkter viser relevante markører og strukturer. På kultur d35, 3D produkter udstiller: PAX6 (grøn) og TBR2 (rød) af lumen af neurale roset-lignende formation (første række); DCX (grøn) og NeuN (rød) breder sig fra yderkanten ventrikulær zone (VZ)-lignende struktur (anden række); KIRREL2, en markør tilknyttet cerebellare neuroepithelium (tredje række, venstre); og ZIC1 en markør tilknyttet cerebellare granula celler (tredje række, højre). Eksperimentet blev udført flere gange ved hjælp af fire forskellige hPSC linier: menneskelige stamceller linje H01 (n = 5), og iPSC linjer hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), og hvs51 (n = 1). Pilene peger rombeformede lip (RL)-gerne struktur. Skalalinjen = 100 µm. Dette tal er genudgives fra Holmes og Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> Figur 6: stor skala ventrikulær zone-lignende struktur i 3D produkt. På kultur d35 er menneskelige stamceller-afledt samlet positive for PAX6 (grøn) og TBR2 (rød) ofte forbundet med tidlig neuroner findes inden for ventrikulær zoner (VZs) og subventricular zoner (SVZs), in vivo. (Top) En stjerne (*) markerer den apikale side af et VZ-lignende område kører langs kanten af samlet, med kantede parenteser angiver samtidig dybde/fordeling af VZ / SVZs. (midten) fusioneret signaler Vis spredte dele af PAX6 +/ TBR2-celler vokser i størrelse mod den øverste højre ende af VZ. (Nederst) Højere forstørrelse billede af afsnittet angivet af et rektangel i det midterste panel. Skalalinjen = 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra Holmes og Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> Figur 7: ICC billeder af 2D produkter viser relevante markører. På kultur d35, 2D produkter udstille, fra hESCs (øverste række) og hiPSCs (nederste række), celler positive for: granula celle markør ZIC1 og vandrende cerebellare neuron markør TAG1 (venstre kolonne); og neuronal markør neurofilament (NF) og TAG1 (højre kolonne). Skalalinjen = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> Figur 8: RT-PCR 2D produkters. mRNA udtryk analyse af menneskelige stamceller linje H01 (øverste række) og hiPSC line hvs60 (nederste række) i slutningen af 2D protokollen viser produkter med gelelektroforese for: granula celle markør ZIC1, granula celle markør ATOH1, vandrende cerebellare neuron markør TAG1, Purkinje celle markør Calbindin (CALB), spænding-afhængige calcium kanal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), gamma - aminosmørsyre (GABA) B receptor 1 (G-Br1), og husholdning gen EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> Figur 9: Calcium imaging/analyse af 2D produkter. På kultur d35, blev hPSC differentiering produkter optaget i 2 min. under mikroskopet, efter inkubation med fluor5 farvestof. På 30 s, celler blev elektrisk stimuleret for 10 s på 10 Hz. (A) stillbilleder Vis hESCs på 0 s (venstre) og efter starten af elektrisk stimulation på 30 s (til højre). Pilene angiver region af interesse (ROI) for analyse af calcium tilstrømning. (B) grafisk analyse viser ændringen i relative fluorescens versus tid for ROI (ændre i fluorescens = (F-F0) f0, hvor F0 = (∑F1-n) / n), med neuron-lignende pigge sker før, under og efter stimulation. Sort bar angiver længden af elektrisk stimulation. Skalere bar (hvid) = 50 µm. fuld registrering for menneskelige stamceller (som ses her) og en hiPSC linje (ikke vist) er tilgængelige i supplerende Video 1 og supplerende Video 2, henholdsvis. Optagelser er i AVI-format, med 4 x hastighed. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende Video 1: Calcium imaging video af 2D produkt fra menneskelige stamceller linje H01. På kultur d35, differentiering produkter fra menneskelige stamceller linje H01 blev optaget i 2 min. under mikroskopet, efter inkubation med fluor5 farve. På 30 s, celler blev elektrisk stimuleret for 10 s på 10 Hz. optagelser blev lavet på 2 rammer/s, og forarbejdes til AVI video på ~ 7 rammer/s, producerer en video varighed ~ 30 s ~ 4 x hastighed. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende Video 2: Calcium imaging video af 2D produkt fra hiPSC linje hvs51. På kultur d35, blev differentiering produkter fra hiPSC linje hvs51 optaget i 2 min. under mikroskopet, efter inkubation med fluor5 farvestof. På 30 s, celler blev elektrisk stimuleret for 10 s på 10 Hz. optagelser blev lavet på 2 rammer/s, og forarbejdes til AVI video på ~ 7 rammer/s, producerer en video varighed ~ 30 s ~ 4 x hastighed. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification at JoVE.com

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Vi beskriver et forenklet 3D differentiering protokol for hPSCs, bruger defineret medium og reduceret vækstfaktorer, frembringe celle aggregater med tidlige neuroepithelial strukturer og positiv for cerebellare-associerede markører, samt en valgfri 2D modifikation for differentiere celler som en éncellelag til at generere funktionelle neuroner.

Strømlinet 3D cerebellare differentiering protokol med valgfri 2D ændring

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D organotypisk co-kultur Model Støtte medullær thymusepitelmonolag celleproliferation, differentiering og Promiskuøs Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Kultur Chick cerebellare Skiver og Rumligt Målrettet Elektroporation af granulat celleforstadier

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storstilet produktion af cardiomyocytter fra menneskelige pluripotente stamceller Ved hjælp af en meget reproducerbar lille molekyle-Based Differentiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protokol for differentieringen af ​​humane inducerede pluripotente stamceller i blandede kulturer af neuroner og glia til neurotoksicitetstestning

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tre-dimensionelle gengivelse og analyse af Immunolabeled, klarere menneskelige placenta villøs vaskulære netværk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-medieret tab af funktion analyse i cerebellare granula celler ved hjælp af In Utero elektroporation-baseret overførsel af gener

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Kemiske Reversion af konventionelle humane pluripotente stamceller til en naiv-lignende tilstand med forbedret Multilineage differentiering potens

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptic dataloger modellering med 3D Cocultures astrocytter og neuroner fra humane pluripotente stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Forbigående behandling af humane pluripotente stamceller med DMSO for at fremme differentiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...