Name: streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification at JoVE.com

אנחנו אסירי תודה ג'ייקובס Gerbren, Jurjen Broeke לקבלת סיוע טכני מומחה שלהם, כדי Prisca Leferink עבור תרומה של דור ואפיון של שתי שורות iPSC שליטה, וכדי ליסה Gasparotto הממחיש את הנהלים שלנו

<ol>
	<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2012).</li><li>Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebellar+neuron+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 290, 287-296 (2006).</li><li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons.">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).</li><li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrailed,+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain--hindbrain+development.">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development.</a> Trends Genet. 12, 15-20 (1996).</li><li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otx2,+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer.">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).</li><li>Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Development-The+Impact+of+Preterm+Birth+and+Comorbidities.">Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities.</a> Fetal and Neonatal Physiology. , (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12, 671-678 (2015).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium.">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6, 402-406 (2017).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened.">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells.">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li><li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6,+Tbr2,+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia,+intermediate+progenitor+cells,+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex.">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li><li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming.">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

המורכבות עלויות הגורמים הרלוונטיים עבור תא גזע חוקרים בעת בחירת או לפתח פרוטוקולים בידול בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. דבר זה נכון במיוחד כפי שהיא שאלה פתוחה של כמה שליטה חיצוני נדרש כדי ליצור סוגי התאים הרצוי, או — לדגמן את זה אחרת – כמה hPSCs המוסמכת לייצר סביבה התפתחותית משלהם, אם עזב אל עצמם עם מספיק חומרים מזינים. הקדמה של גורמים extrinsic במבחנה היטב יכולות להפיק מוצרים התא הרצוי, אך הם גם עלולה להפריע עם הקיבולות התפתחותי מהותי תאים שכישוריי ויוו. שיקולים כאלה הם חשובים, במיוחד אם המטרה היא שימוש iPSCs החולה-derived עבור מידול המחלה. שימוש נרחב המתבנת ו/או גורמי גדילה יכול להסוות מחלה פנוטיפים. הפרוטוקולים המפורטים בדוח זה להמשך המגמה של מחקרים קודמים כדי להפחית את המורכבות, עלות, ו/או השימוש המתבנת החיצוניים גורמים8,9.
בהתבסס על תוצאות שדווחו על-ידי. Muguruma et al., והלימוד האחרונה שלנו, נראה שאפשר להשיג בידול כלפי גורלם אסטרוציטומה ללא מאמצים למיגור להתרבות ויוו תנאים, כפי שעשו מחקרים מוקדמים יותר 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. החלק מסקרן הוא שמשתמשים המחקרים שני סטים שונים של גורמי גדילה, רומז כי אף קבוצה היו נחוצים, אם כי שניהם להשתמש FGF2. . הרצנו בדיקות נוספות, איפה FGFs היו באופן סלקטיבי נכללו הפרוטוקול, הראה כי התאים היו מסוגל לייצר את אותם מוצרים ללא FGFs חיצוני10... ההבדלים בין המחקרים שלנו היו מוסמכים על ידי העובדה כי אנחנו בשימוש קווים hPSC שונים ופעולות תרבות המושרה בידול עצביים עם RA, כולל רכיבים כדי לתמוך הישרדות cell גרגר ועם בגרות (BDNF GDNF, סאג, אשלגן כלורי)11 –14. בנוסף, שיטת ההפעלה פחות מורכב, בהשוואה ל- Muguruma. et al., הועסק. פרוטוקול שלהם החלה על ידי יצירת EBs אחיד ב- 96WPs, אשר מבודדים אותם פיזית, כימית אחד מהשני. הפרוטוקול פה היה מגירסה יחסית צפוף יחד 6WPs במהלך היווצרות EB, אשר אפשרה להם לפעול בחופשיות. איך זה ייתכן באופן שונה השפיעו על סביבה הפיסיקליות והכימיות של EBs מאוחר יותר organoids (כולל ייצור מהותי של איתות תרכובות) אינה ידועה, יכולה להיחקר. בנוסף, בעוד אנו מציגים את הביטוי של גנים הקשורים — ו שבחבורה של — מקור אסטרוציטומה, ממוקם בתוך מבנים מורפולוגית דומים לאלה שדווחו על-ידי Muguruma. et al., אנחנו לא יכולים להוציא מהדור עצביים כמו מבני זה הן זהות שאינה אסטרוציטומה. מחקרים עתידיים, באמצעות פאנל גדול של נוגדנים כאלה שדווחו על-ידי. Muguruma et al. (כלומר, ATOH1, CALB, וכו) יעשה כזה הקצאות, השוואה בין מוצרים של פרוטוקולים, יותר חד משמעיות.
בתוך פרוטוקול 3D, זה חשוב כדי להתחיל עם, לשמור על מספר מספיק של תאים בתרבות כדי להבטיח מספר מספיק של מוצרי קצה לניתוח. בהתחשב die-off משמעותי מוקדם בפרוטוקול, מומלץ להתחיל עם יותר מ-500 EBs/טוב במהלך 3 הימים הראשונים בתרבות (איור 1). זה לא צריך להיות בקשיים להשיג המושבה נתון גדלים עבור hPSCs בתרבות נטולת מזין, אבל לא יכול להיות קל עבור אלה עדיין בשיטות תלויי-מזין. לאור המספר הגדול של תאים, חשוב לשמור על שינוי הצבע בינוני (המציין שינוי ה-pH), ואת הצטברות של תאים מתים. שניהם חייבים לתקן כדי למנוע התמוטטות של התרבות. יתכן שיש גם הצליעה של תאים, אגרגטים לתוך מבנים גדולים. למרות שזה עלול לגרום עדיין אגרגטים מסוגל לנתח, כמות המוצר תהיה פחותה בהרבה, כך נפרדים אותם לתוך אגרגטים קטנים יותר עם trituration עדין יכול להיות שימושי. אולם, להימנע מטרידה אגרגטים נורמלי, אשר עצמם יכולים לגדול במידות גדולות (איור 4). אם אגרגטים להיות דליל מדי, מומלץ לשלב בארות כך אגרגטים אינם מבודדים לגמרי. המוצר השתנות (ב מספר, גודל ומורפולוגיה) זו בעיה ידועה היטב בתרבות תא תלת-ממד, לרבות עבור פרוטוקולים אלה החל שלבי היווצרות EB מבודדת, אחיד, המציעה כי הליך הפעלה פחות מורכבים (כגון פרוטוקול המתוארים כאן ) יכול להיות יותר מעשי8,15. הטרוגניות זו אמנם משהו החוקרים צריכים לזכור, במיוחד במהלך ניתוח, פרוטוקול דיווח שנוצר מוצרים בקנה אחד עם אלה שנמצאו9,8,15אחרים פרוטוקולים 3D. בהתבסס על גודל, מורפולוגיה, הם נופלים בטווח של רוזט עצבית תא צורב המוח כפי שתואר בסקירה האחרונה על ידי Kelava ו לנקסטר15, עם הכי מתאים את הסיווג של ספרואיד. בולטים במיוחד, הן הנוכחות של מבנים תלת-ממד רמיזות של עצבי רוזטות עם לומן, אזורי חדרית (sub) ומעוינים-lip כמו תכונות (איור 5 ו איור 6) כפי שזוהו על ידי קבוצות השני8 , 15 , 16 , 17. מאז בכל ניסוי המיוצר לפחות אחד צבירה עם VZ בשם/SVZs אסטרוציטומה הקשורים סמנים (ZIC1, KIRREL2), אלו קריטריונים שימושי לקביעת ההצלחה של הבחנה תלת-ממד באמצעות הפרוטוקול שלנו עם דמוי-RL כולל מתן תמיכה נוספת. להאריך את משך תרבות העבר 35 ימים לא נבחנה, אבל יכול להיות נרדף לקבוע את גודל מרבי של צמיחה, מורכבות ובגרות מורשה על-ידי טכניקה זו.
פרוטוקול 2D משתמש באותה צורה EB שאינם מחסידי ותהליך אינדוקציה עצביות כמו פרוטוקול תלת-ממד, אז חלים גם דבריו לעיל. ברגע מצופה, קבוצה שונה של שיקולים שיש לשקול. EBs צריך לדבוק במהירות עבור תאים להתרבות החוצה לצלחת. אם יש בעיות עם הדבקות, תוספת של RI (אם כבר לא בשימוש), צמצום נפח בינוני, או ניתן להחיל שינויים ניסיוני בריכוז אש ף/לאם. זה חשוב לשמור תאים לגדול מדי צפוף או דלילים (רצוי בוגר בין 20-80% confluency) ב הבארות; פיקוח יומי, בזמן passaging חשוב להימנע תאים מעל-confluency או צף. בניגוד פרוטוקול תלת-ממד, לא אמור die-off משמעותית במהלך תרבות, אם כי ייתכנו אזורים של צמיחה המסכן, או על האטה של התפשטות המחירים. Passaging משפיע על המדינה ההבשלה של תאי (לדוגמה, הסרת התא תהליכי ורשתות המפותח בין תאים), יש לשמור בראש כשאתם מתקרבים נקודות איפה שנאסף או ניתח בצורה כלשהי תאים. לדוגמה, עבור סידן הדמיה זה חשוב מאוד לתאים המעבר בין 2-6 ימים לפני הניתוח. Passaging קרוב ניתוח המשמעות של תאים לא הספיקו כדי לחבר ו/או בוגר, רחוק מדי עלולה לגרום בתאים צפיפות יתר, מקשה על הדמיה. למרות השתנות בין ניסויים יכול להתקיים, התוצאות הן עקביות ביחס לאלה דיווח ראשוני פרוטוקולים אסטרוציטומה 2D1,2. ICC מכתים ג'ין ביטוי וניתוח לאמת את נוכחותם של תאים חיוביים עבור סמן תא גרגר ZIC1, בזמן גם זיהוי סמנים המשויך זהויות עצבית, אסטרוציטומה אחרות (איור 7 , איור 8). הדמיית סידן, אשר מערבת גירוי חשמלי של תאים מודגרות עם צבע fluor5, ציינו פונקציונלי פעילות. עצבית (איור 9 משלימה איור 1, משלימה איור 2), למרות שזה לא נכון אם אלה היו תאים גרגר. לנתיחה על ידי מתן התאים יותר זמן להבשיל על-ידי הרחבת האורך של תרבות העבר 35 ימים, מידת פעילות. עצבית תפקודית צריך להגדיל את זה פוטנציאל זה יכול להיחקר בעתיד.
בנוסף השורות של מחקר שהוצעו לעיל, זה יהיה עניין לקבוע הבדלים זהויות המוצר (בכמות ובאיכות) בין הפרוטוקולים 2D and 3D. חשיבותה של FGFs החיצוניים לא נבדקה בפרוטוקול 2D, וזה יהיה שימושי לדעת אם חוסר במבנה התלת-ממדי לאחר ציפוי, אז משויך איתות המסלולים, יגרום תרבויות 2D פחות או יותר תלוי אלה מוקדם תכנים תרכובות. פרוטוקולים בפרשן יותר (למשל, לא רה, BDNF, סאג) הם באותה מידה סביר קוי לחקירה נוספת. בסופו של דבר, מחקרים עתידיים עשויים להפיק תועלת כלי מחקר חדש כדאי לאפיין (והערכת יעילות הדור) יחוברו עצביים אסטרוציטומה אדם ספציפי.
עם ההליכים נתון בראש, שניהם דיווח פרוטוקולים עשוי לשמש differentiations אסטרוציטומה, עם מוצרים המותאמים למטרות שונות. הם עשויים לשמש נקודות המוצא מעשי לחוקרים מחקרים פיילוט, בדיקות הכדאיות של שורות תאים כאלה differentiations, או כמודל בסיסי עבור סוגים אחרים של בידול עצבית יישוב.

במבחנה פרוטוקולים עבור המבדילים hPSCs לכיוון שושלות אסטרוציטומה בתחילה פעלו על עקרון מחקה ויוו פיתוח אסטרוציטומה1,2,3,4. וככזה, נדרש רצף של גורמים הציג במועדים ספציפיים לנהוג המתבנת pro-אסטרוציטומה ועם בגרות. בין אלה היו ונ ט, עצם morphogenetic חלבונים (BMPs), ו פקטורי גדילה פיברובלסט (FGFs) עם תפקידים ידוע בתחום הפיתוח hindbrain אמצע היווצרות של מארגן isthmic5,6,7. כמובן, כל צעד נוסף, גורם פירושו עלייה מניפולציות עתירי עבודה, הוצאות גדול עבור החוקר, אז פיתוח מסוגל בהשגת תוצאות שוות יותר פשוט פרוטוקולים הוא עניין. בעיה מעשית זו משתלב יפה עם השאלה ההיפותטית, אם תאים דרושה כזה חזק, חיצוני שליטה שלהם פיתוח חוץ גופית בתוך.
עבור בידול אסטרוציטומה, פרוטוקול שפורסם בשנת 2015 התייחס בצורך של באמצעות מספר רב של גורמי גדילה באמצעות רק FGF2, FGF19 ואת גורם לתא-derived סטרומה 1 (SDF1) עבור תכנים למטרות8. מחקר זה גם נבדל פרוטוקולים אסטרוציטומה מוקדמת, באמצעות מערכת תרבות לתרשים תלת-ממדי. בנוסף לייצור תאים חיובית עבור סמני אסטרוציטומה, המוח "organoids" שנוצר על ידי הטכניקה שלהם הוצגו שהפגינו מורפולוגיה הרלוונטיים, זמין בתרבויות מסורתיות טפט 2D, כגון מבנים דמויי-שפתיים ומעוינים. למרות פחות מורכבות ויקרות ביחס גורמי גדילה, תכונות אחרות כגון היווצרות אחיד embryoid (EBs) וגופי תרבות ב 96-ובכן צלחות (96WPs), עשה את זה לפי התהליכים מורכבים במהלך שלבים התחלתיים. פרוטוקול תלת-ממד נוסף שפורסם באותה השנה, דיווח על בידול מוצלחת שושלות עצביים באמצעות טכניקות תרבות תא נפוצה וזולה9. למרות קבוצה זו חקר קליפתי ולא בידול אסטרוציטומה, יישום של התפיסה שלהם עבור בידול אסטרוציטומה יכול לא להיות מוזלים.
לאחרונה דיווחנו פרוטוקול בידול אסטרוציטומה תלת-ממד באמצעות מספר מצומצם של גורמים המתבנת (כלומר, FGF2, 4 ו- 8), כמו גם התקנה פשוטה על ידי שמירה על תאים ב- 6-ובכן צלחות (6WPs) בכל כדי למזער את דרישות בינוני10. כדי לסייע ייצור תאי גרגר, smoothened אגוניסט (סאג) שימש במהלך השלב הסופי ההבשלה. סאג היא אלטרנטיבה כימי פחות יקר סוניק הקיפוד (ששש), אשר היה בשימוש לפני כן אסטרוציטומה בפרוטוקולים, בשל תפקידה לקדם את הצמיחה של גרגר תא מבשרי (GCPs) אין ויוו1,2, 11,12,13. בידול מוצרי היו בקנה אחד עם אלה של פרוטוקולים תלת-ממדיים אחרים, כולל הנוכחות של סמנים אסטרוציטומה הקשורים הרלוונטיים מורפולוגית מבנים8,9. תוצאות כאלה לחזק את המסר קודמות זה מפורט חיקוי של ה- ויוו הסביבה לא יהיה צורך מורכבים 3D במבחנה בידול פרוטוקולים.
בנוסף לפרוטוקול תלת-ממד, דו ח זה מתאר פרוטוקול 2D, נועד עם אותה התארגנות מהירה, חומרים בסיסיים, ואת מספר מופחת של גורמי גדילה. הוא מסוגל לייצר תאים של תאי גזע עובריים (hESCs) או המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs), חיובית עבור סמני המשויך מוקדם עצבית, אסטרוציטומה, גרגר תא זהויות. בנוסף, הסידן הדמיה מצביעה על הנוכחות של נוירונים אנושיים פונקציונלי. היכולת לבחור בין פרוטוקולים, מוסיפה רמה של גמישות לחוקרים, עבור מי שמעוניין גם: (1) ביצירת תאים מסוים יקליד, התפתחות המוח האנושי (2) דוגמנות ומקושרת מבנים, (3) ניתוח באופן חד שכבתי מיטבי הגדרות (למשל, תיקון-קלאמפ הקלטות), או אינטראקציות תא-תא (4) בתרבויות מעורבות עצבית. הטבע שלהם נמוכים ופשוט עושה אותם נגישים לחוקרים חדש בתחום hPSC, או צריך הליכים hPSC בסיס שממנו ניתן לחקור יותר אפשרויות בידול.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>glutamine fortified DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>neural basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Imgen</td>
			<td>PT468-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>aka Poly-Hema</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium and supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>hPSC medium and supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>SelleckChem</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 um filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM996</td>
			<td>wrap for culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>368632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>trypsin-based dissociation agent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>100-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-8B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic Factor 3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened Agonist (SAG)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11914</td>
			<td>CAS 912545-86-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 40C microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging - image aquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0996</td>
			<td>centrifuge for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>3623140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESCs</td>
			<td>WiCELL</td>
			<td></td>
			<td>line H01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification

להפחית את המורכבות ואת העלות של בידול פרוטוקולים חשוב לחוקרים. עניין זה מתאים עם חששות לגבי תופעות לא מכוונות אפשריות המתבנת החיצוניים גורמים עשוי להציג לתוך תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC) מודלים של התפתחות המוח או פתופיזיולוגיה, כגון מיסוך פנוטיפ המחלה. כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים בידול אסטרוציטומה עבור hPSCs, נועד עם שיטת ההפעלה פשוטה, גורמים פחות המתבנת, פחות דרישות החומרים ממספר הפרוטוקולים הקודמים. לאחרונה פיתחנו לתרבות הליכים, המניבות לתרשים תלת-ממדי (3D) מוצרים בקנה אחד עם פרוטוקולים "תא צורב" מוח אחרים, כולל מורפולוגיות הרלוונטיים דוגמנות התפתחות המוח כגון אזור sub/חדרית -, ומעוינים מבנים דמויי-שפתיים. השני משתמש הליך חד שכבתי חסיד, 2גרפיקה דו-ממדית כדי התמיינות להשלים, אשר מוצג מסוגל לייצר נוירונים אסטרוציטומה פונקציונלי, כפי חיוביים עבור סמני אסטרוציטומה הקשורים מוצרים, התערוכה נוירון כמו סידן influxes. יחד, פרוטוקולים אלה מציעים מדענים מגוון של אפשרויות מתאים למטרות מחקריות שונות, כמו גם מודל בסיסי לבדיקת סוגים אחרים של differentiations עצבית יעילה.

מבט כולל ויזואלי על צמיחה מופחת גורם פרוטוקולים בידול אסטרוציטומה 2D and 3D איור 1 מציג את ציר הזמן הכולל עבור הפרוטוקולים בידול אסטרוציטומה 2D and 3D, זיהוי גורמים extrinsic והשעה של ציפוי. התקדמות אופיינית עבור hPSCs שעברו התמיינות אסטרוציטומה 3D מתוארת באיור2: עם קו hESC H01 החל בתור מושבות בתרבות נטולת מזין ביום 0 (השמאלית העליונה של דמות); בתהליך היווצרות EB ביום 2 (האמצעי העליון); גדל לתוך אגרגטים תאים גדולים עם לומן לכאורה בעקבות אינדוקציה עצביים עם RA ו FGF8 ביום 14 (מימין); ויוצרים אגרגטים של משתנה גודל וצורה -28 יום (השמאלית התחתונה); פיתוח של מורכבות עם מבנים שונים של צבירה יחיד, ציין ביום 28 (באמצע התחתון); והמשיך עם שינויים מורפולוגיים למבנים באותו יום 35 (הימנית התחתונה). התקדמות אופיינית עבור hPSCs שעברו התמיינות אסטרוציטומה 2D מתואר באיור3: עם hESC קו H01 בתור מושבות בתרבות נטולת מזין ביום 0 (השמאלית העליונה של דמות עם מעגל המציין אזור של תאים הבדיל בין מושבות hESC) ; בתהליך היווצרות EB ביום 2 (האמצעי העליון); גדל לתוך אגרגטים תאים גדולים עם לומן לכאורה בעקבות אינדוקציה עצביים עם RA ו FGF8 ביום 13 (מימין); מתרבים כמו תאים חסיד לאחר ציפוי ביום 14 (השמאלית התחתונה); ואז כמו טפט של תאים עם יותר בוגר/מתחם מורפולוגיה ביום 35 תחת נמוך (באמצע התחתון), בהגדלה (הימנית התחתונה).
סמני תערוכת מוצרים תלת-ממד ומבנים של Neuroepithelium מוקדם איור 2 (התמונה השמאלית התחתונה) ולהראות את הטרוגניות 3D מורפולוגיה צבירה לראות בכל רחבי culturing, משתנה צמיחה ו/או המחירים ההבשלה, כמו גם מיזוג סטוכסטי או מתפרקת של אגרגטים של איור 4 . למרות הטרוגניות, בידול כל מפיק אגרגטים מפגין סמנים עצביים ו עצביים מוקדם, כולל גרגר אסטרוציטומה סמן ZIC1, כפי שמציין immunocytochemistry (ICC) צביעת באיור5. וחשוב מכך, איור 5 ו- 6 איור מראים כי תרבות 3D פשוטה, עם גורמי גדילה מופחתת, הוא מסוגל לייצר אגרגטים עם מבנים מורכבים הקשורים להתפתחות המוח כגון neuroepithelium מוקדם, שפתיים ומעוינים.
סמני אסטרוציטומה של התערוכה מוצרים 2D ופעילות. עצבית תפקודית בעוד תרבויות 2D לא יכול לשחזר מבנים תלת-ממדיים מורכבים, הם מסוגל לייצר תאים מפגין סמנים עצביים ו עצביים מוקדם, כולל גרגר אסטרוציטומה סמן תא ZIC1, כפי שמציין ICC מכתים איור7. ניתוח ביטוי גנטי באמצעות RT-PCR, כפי שניתן לראות באיור 8, תומך תוצאות מכתימים ICC, למרות נוכחותם של גרגר מוקדם תא סמן ATOH1 הוא משתנה בין ניסויים וקווים. הדמיית סידן מתבצע בקלות רבה יותר בתרבות 2D. כפי שניתן לראות באיור 9, משלימה Video 1ו 2 הסרטונים משלימה, תאים חשמלית מגורה להראות influxes סידן האופייניים של דפוסי הירי עצביים, רומז הדור של נוירונים פונקציונלי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> איור 1: ציר הזמן של פרוטוקול בידול (החל מיום התמיינות 0). קו מלא תיבות מציינות כאשר גורמים ספציפיים נוספים המדיום תרבות, קו מנוקד תיבות מצביעים על הצלחת ציפוי ולשנותן 2D אופציונלי. עבור FGF2, החץ למטה מתייחס ריכוז נמוך יותר (4 ng/mL), ואת החץ למעלה מתייחס ריכוז גבוה (20 ng/mL). דמות זו שונתה הולמס ואת היינה10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> איור 2: נציג brightfield תמונות של פרוטוקול 3D. hESC המושבות ב d0, EBs-d2, אגרגטים בעקבות אינדוקציה d14, אגרגטים של גודל שונה, מורפולוגיה (ממוספרים 1-5)-d28, צבירה יחיד עם ייחודי, המאפשר זיהוי תכונות (שצוין על-ידי האותיות –c) d28, ו השינויים גלויים ב- אותן תכונות ב- d35. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה הולמס ואת היינה10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> איור 3: נציג brightfield תמונות של פרוטוקול 2D- hESC המושבות d0, EBs-d2, אגרגטים לאחר אינדוקציה-d13, לאחר ציפוי אגרגטים-d14, לאחר ההבשלה-d35 כפי שניתן לראות ב 5 x הגדלה, 20 x הגדלה. העיגול הלבן בחלונית השמאלית העליונה מציגה האזור של תאים בין מושבות hESC. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> איור 4: תמונות Brightfield מציג בגדלים והמורכבות בתרבות 3D. (א) ביום 8 (hESCs), אגרגטים (B) d35 (hiPSCs). התמונה השנייה מורכבת משלוש תמונות נפרדות כדי להציג את כל הצבירה. שניהם אגרגטים שסבורים כי הושפעו על-ידי מיזוג של אגרגטים קטנים יותר או אובדן (שובר) של מבנים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. איור זה פרסום מחדש של הולמס והיינה10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> איור 5: ICC תמונות של מוצרים תלת-ממד מראים סמנים רלוונטיות ומבנים. על התרבות d35, תערוכת מוצרים תלת-ממד: PAX6 (ירוק), TBR2 (אדום) על ידי לומן היווצרות שושנת עלים דמויי עצבית (בשורה הראשונה); DCX (ירוק), NeuN (אדום) הפצת מאזור חדרית הקצה החיצוני (VZ)-כמו מבנה (שורה שנייה); KIRREL2, סמן המשויך neuroepithelium אסטרוציטומה (שורה שלישית נשאר); ZIC1 סמן המשויך גרגר אסטרוציטומה תאים (שורה שלישית, נכון). הניסוי נערך פעמים רבות באמצעות ארבע שורות hPSC שונים: קו hESC H01 (n = 5), ואת iPSC קווים hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), ו- hvs51 (n = 1). חצים הצבע לשפה ומעוינים (RL)-כמו מבנה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. איור זה פרסום מחדש של הולמס והיינה10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> איור 6: בקנה מידה גדול, כמו אזור חדרית המבנה במוצר 3D. תרבות d35, צבירה הנגזרות hESC הוא חיובי PAX6 (ירוק), TBR2 (אדום) הקשורים בדרך כלל מוקדם נוירונים בתוך אזורי חדרית (VZs) ואזורי subventricular (SVZs), בתוך vivo. (למעלה) כוכבית (*) מסמן את הצד הפסגה של אזור VZ דמוי פועל בשולי הצבירה, עם סוגריים המציינת את עומק/חלוקת VZ / SVZs-(באמצע) ממוזג אותות הראה פזורים סעיפים PAX6 / TBR2-תאים הגדלת גודל לכיוון לקצה הימני העליון של VZ. (למטה) תמונת הגדלה גבוהה יותר של המקטע המצוין על-ידי מלבן בחלונית האמצעית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. דמות זו שונתה הולמס ואת היינה10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> איור 7: ICC תמונות של מוצרים 2D הצג סמני רלוונטי. על התרבות d35, בתערוכה למוצרי 2D, hESCs (שורה עליונה), hiPSCs (שורה תחתונה), תאים חיובית: סמן תא גרגר ZIC1 וסמן נוירון אסטרוציטומה נודדות TAG1 (העמודה משמאל). ו neurofilament סמן עצביים (NF) ו TAG1 (בעמודה הימנית). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> איור 8: RT-PCR של מוצרים 2D- ניתוח ביטוי mRNA של hESC קו H01 (שורה עליונה) ו- hiPSC קו hvs60 (שורה תחתונה) בסוף דו-ממדי פרוטוקול מציגה מוצרים עם אלקטרופורזה בג'ל עבור: גרגר תא סמן ZIC1, גרגר סמן תא ATOH1, נוירון אסטרוציטומה נודדות סמן TAG1, Purkinje סמן תא Calbindin (CALB), סידן תלוית מתח ערוץ CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), קולטן B גאמא אמינו בוטירית (GABA) 1 (G-Br1), ואת משק הגן EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> איור 9: סידן הדמיה/ניתוח של מוצרים 2D- על התרבות d35, hPSC בידול מוצרי נרשמו למשך 2 דקות תחת המיקרוסקופ, לאחר דגירה עם צבע fluor5. 30 s, התאים היו מגורה חשמלית 10 s-10 Hz. (א) תמונות סטילס הצג hESCs ב 0 s (משמאל) ואחרי תחילת גירוי חשמלי 30 s (מימין). חיצים מציינים אזור בעל עניין (ROI) לניתוח של סידן זרם. שינוי מראה גרפי ניתוח (B) זריחה היחסי לעומת הזמן של רועי (שינוי פלורסצנטיות = /F (F-F0)0, איפה F0 = (∑F1-n) / n), עם קוצים כמו נוירון המתרחשים לפני, במהלך, ואחרי גירוי. פס שחור מציין אורך גירוי חשמלי. קנה המידה של בר (לבן) = 50 מיקרומטר. מלאה הקלטה עבור hESC (כפי שניתן לראות כאן) קו hiPSC (לא מוצג) הינם זמינים משלים Video 1 ו- 2 וידאו משלימים, בהתאמה. הקלטות הם בפורמט AVI, במהירות 4 x. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
משלימה 1 וידאו: סידן הדמיה וידאו של 2D המוצר מקו hESC H01. על התרבות d35, בידול מוצרים מקו hESC H01 הוקלטו 2 דקות תחת המיקרוסקופ, לאחר דגירה עם fluor5 לצבוע. 30 s, התאים היו מגורה חשמלית 10 s ב- 10 Hz. הקלטות היו נעשים ב- 2 מסגרות/s, מעובד וידאו AVI-~ 7 מסגרות/s, הפקת וידאו שנמשך ~ 30 s, במהירות x ~ 4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
משלימה 2 וידאו: סידן הדמיה וידאו של 2D המוצר של hiPSC קו hvs51. על התרבות d35, בידול מוצרי hiPSC קו hvs51 נרשמו למשך 2 דקות תחת המיקרוסקופ, לאחר דגירה עם צבע fluor5. 30 s, התאים היו מגורה חשמלית 10 s ב- 10 Hz. הקלטות היו נעשים ב- 2 מסגרות/s, מעובד וידאו AVI-~ 7 מסגרות/s, הפקת וידאו שנמשך ~ 30 s, במהירות x ~ 4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification at JoVE.com

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

אנו מתארים מדיום פרוטוקול מוגדרים hPSCs, באמצעות בידול 3D פשוטה, צמצום גורמי גדילה, מסוגל לייצר תא אגרגטים במבנים neuroepithelial מוקדם וחיובי אסטרוציטומה הקשורים סמנים, כמו גם אפשרי נוסף שינוי 2D עבור המבדילים תאים כמו טפט ליצירת נוירונים פונקציונלי.

פרוטוקול בידול אסטרוציטומה 3D יעיל בשינוי 2D אופציונלי

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protocol עבור הבחנה של תאים גזעיים Pluripotent Indoced האדם לתוך תרבויות מעורבות של נוירונים וגליה עבור בדיקה נוירוטוקסיות

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

לדוגמות כימיים בתאי גזע Pluripotent האנושית המקובלת למצב תמים כמו עם העוצמה התמיינות משופרת Multilineage

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

הטיפול הארעי של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית עם DMSO כדי לקדם בידול

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...