Name: streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification at JoVE.com

Vi er takknemlige for Gerbren Jacobs og Jurjen Broeke for deres ekspert teknisk assistanse, til Prisca Leferink for å bidra til generasjon og karakterisering av to kontroll iPSC linjer og Lisa Gasparotto for å vise våre prosedyrer.

<ol>
	<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2012).</li><li>Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebellar+neuron+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 290, 287-296 (2006).</li><li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons.">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).</li><li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrailed,+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain--hindbrain+development.">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development.</a> Trends Genet. 12, 15-20 (1996).</li><li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otx2,+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer.">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).</li><li>Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Development-The+Impact+of+Preterm+Birth+and+Comorbidities.">Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities.</a> Fetal and Neonatal Physiology. , (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12, 671-678 (2015).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium.">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6, 402-406 (2017).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened.">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells.">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li><li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6,+Tbr2,+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia,+intermediate+progenitor+cells,+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex.">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li><li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming.">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Kompleksiteten og kostnadene er relevante faktorer for stem cell forskere når velger eller utvikling differensiering. Dette gjelder særlig som det er et åpent spørsmål til hvor mye ekstern kontroll er nødvendig for å generere ønsket celletyper, eller -å utgjøre det annerledes — hvordan kompetent hPSCs er til å produsere sine egne oppvekstmiljø, hvis igjen til seg selv med tilstrekkelig næringsstoffer. Innføring av extrinsic faktorer i vitro kan godt gi ønsket celler, men de kan også forstyrre med iboende utviklingsmessige kapasiteten ville celler har utstilt i vivo. Slik er viktig, spesielt hvis målet er bruk av pasient-avledede iPSCs for sykdom modellering. Utstrakt bruk av mønstre og/eller vekst faktorer kan maskere sykdom fenotyper. Protokollene i denne rapporten følger trenden i tidligere studier å redusere kompleksitet, kostnader eller bruk av ytre mønstre faktorer8,9.
Basert på resultatene Muguruma et al., og vår egen fersk studie, virker det som det er mulig å oppnå differensiering mot lillehjernen skjebne uten anstrengelser for å reprodusere i vivo forhold, som tidligere studier har gjort 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. den spennende delen er at de to studiene brukt ulike sett av vekstfaktorer, tyder på at verken sett var nødvendig, selv om begge brukte FGF2. Vi kjørte flere tester, hvor FGFs var selektivt ekskludert fra protokollen, og viste at celler var generere samme produkter uten ytre FGFs10. Forskjeller mellom våre studier var kvalifisert av det faktum at vi brukt ulike hPSC linjer og kultur metoder, indusert nevrale differensiering med RA og inkludert komponenter for å støtte granule celle overlevelse og modning (BDNF, GDNF, SAG og KCL)11 -14. I tillegg var en mindre komplekse oppstartsmetode, sammenlignet med Muguruma et al., ansatt. Deres protokollen begynte ved å generere enhetlig EBs i 96WPs, som isolert dem fysisk og kjemisk fra hverandre. Protokollen her hadde klientstøtte relativt overfylt sammen i 6WPs under EB formasjon, som tillot dem å kommunisere fritt. Hvordan dette kan ha ulikt påvirket fysiske og kjemiske miljøet EBs og senere organoids (inkludert innebygde produksjon signalnettverk forbindelser) ukjent, og kan bli utforsket. Også, vi viser uttrykket av gener forbundet med – og så kan tyde på-lillehjernen opprinnelse, ligger strukturer morphologically ligner de som rapportert av Muguruma et al., vi ikke kan utelukke generasjon av neuronal-lignende strukturer som er ikke-lillehjernen identitet. Fremtidige studier, en stor panelet av antistoffer som rapportert av Muguruma et al. (dvs., ATOH1, CALB, etc.) vil gjøre slike tildelinger og sammenligning mellom produkter av begge protokollene, mer avgjørende.
I 3D-protokollen, det er viktig å starte med og opprettholde et tilstrekkelig antall celler i kultur for å sikre tilstrekkelig antall produkter for analyse. Gitt betydelige die-off tidlig i protokollen, anbefaler vi starter med mer enn 500 EBs/godt under de første 3 dagene kultur (figur 1). Dette bør ikke være vanskelig å oppnå gitt kolonien størrelser for hPSCs i arkmateren-fri kultur, men kanskje ikke så lett for de som fortsatt bruker mater-avhengige metoder. Gitt det store antallet celler, er det viktig å se etter endring i medium (som viser pH endringer) og akkumulering av døde celler. Begge må rettes for å hindre kollaps av kulturen. Det kan også være klumper av celler og aggregat i massive strukturer. Selv om det kan fortsatt føre aggregater som kan analyseres, vil Produktmengde bli sterkt redusert, bryte dem opp i mindre mengder med mild føden kan være nyttig. Imidlertid unngå urovekkende normal aggregater, som selv kan vokse til store størrelser (Figur 4). Hvis aggregatene blir for sparsom, anbefales det å kombinere brønner slik at aggregater ikke er helt isolert. Produktvariasjon (i antall, størrelse og morfologi) er et kjent problem i 3D cellekultur, inkludert for disse protokollene starter med isolert, uniform EB formasjon skritt, tyder på at en mindre komplekse startprosedyre (for eksempel protokollen beskrevet her ) kan være mer praktisk8,15. Mens denne heterogene er noe forskning nød å huske, spesielt under analyse, generert rapporterte protokollen produkter samsvar med de som finnes i andre 3D protokoller8,9,15. Basert på størrelse og morfologi, faller de innen nevrale rosett til et organoid, som beskrevet i en fersk vurdering av Kelava og Lancaster15, med mest passende klassifisering av formet. Særlig kjent, er tilstedeværelsen av 3D strukturer suggestiv av nevrale rosetter lumen, (sub) ventrikkel soner og rhombic leppe som funksjoner (figur 5 og figur 6) som er identifisert av andre grupper8 , 15 , 16 , 17. siden hvert eksperiment produsert minst én samlet med antatte VZ/SVZs og lillehjernen-assosiert indikatorer (ZIC1, KIRREL2), de er nyttige kriterier for avgjør suksessen for en 3D differensiering med våre protokollen, RL-lignende funksjoner gir ekstra støtte. Utvide lengden på kultur siste 35 dager ble ikke testet, men kan gjennomføres for å fastslå grad av vekst, kompleksitet og modenhet som tillates av denne teknikken.
2D protokollen bruker samme ikke-tilhenger EB dannelse og neural induksjon prosessen som 3D protokoll og så kommentarene ovenfor også gjelder. Når belagt, bør et annet sett med hensyn vurderes. EBs bør følge raskt for cellene å spre utover på platen. Hvis det er problemer med etterlevelse, tillegg av RI (hvis ikke allerede brukes), redusert volum av medium eller eksperimentelle endringer i PLO/LAM konsentrasjon kan brukes. Det er viktig å holde celler fra voksende for tett eller sparsom (fortrinnsvis voksne mellom 20-80% confluency) i brønnene; daglig overvåking og rettidig passaging er viktig å unngå over-confluency eller flytende celler. I motsetning til 3D protokollen, bør det ikke være betydelig die-off under kultur, men det er dårlig vekstområder eller en bremse på spredning priser. Passaging påvirker modning delstaten celler (for eksempel fjerne celleprosesser og utviklet nettverk mellom celler) og bør holdes i bakhodet når du nærmer deg poeng der celler blir samlet eller analysert på noen måte. For eksempel for kalsium er imaging det svært viktig å passering celler mellom 2-6 dager før analyse. Passaging for nært til kan analyse bety celler ikke har hatt tid til å koble og/eller eldre, og også langt kan føre celler overbefolkning, gjør imaging vanskelig. Selv om variasjon mellom eksperimenter kan eksistere, er resultatene konsistente med de rapporterte i første 2D lillehjernen protokoller1,2. ICC flekker og gene expression analyse bekrefte tilstedeværelse av celler positivt for granule cellen merket ZIC1, samtidig identifisere markører knyttet til andre nevrale og lillehjernen identiteter (figur 7 og Figur 8). Kalsium bildebehandling, som innebærer elektrisk stimulering av celler inkubert med fluor5 fargestoff, angitt funksjonelle neuronal aktivitet (figur 9, supplerende figur 1og supplerende figur 2), men det ikke er bekreftet hvis disse var granule celler. Det er arguable at ved å gi celler mer tid å modne ved å forlenge lengden på kultur siste 35 dager, mengden funksjonelle neuronal aktivitet bør øke. Dette potensialet kan utforskes i fremtiden.
I tillegg til linjene av forskning foreslo over, ville det være av interesse å finne forskjeller i produktet identiteter (kvantitet og kvalitet) mellom 2D og 3D protokollene. Betydningen av ytre FGFs ble ikke testet i 2D-protokollen, og det ville være nyttig å vite om mangel på 3D struktur etter plating, og så de tilknyttede signalveier, ville gjøre 2D kulturer mer eller mindre avhengig av de tidlig mønstre forbindelser. Nedstrippet protokoller (f.eksingen RA, BDNF, SAG) er like sannsynlig linjer for videre etterforskning. Til slutt, fremtidige studier kan ha nytte av ny forskningsverktøy å bedre karakterisere (og vurdere generasjon effektiviteten av) human-spesifikke lillehjernen neuronal undertyper.
Med de gitt advarslerne i tankene rapportert både protokoller kan brukes til lillehjernen atskillinger, med produkter til forskjellige formål. De kan fungere som praktisk utgangspunkt for forskere gjennomfører pilotstudier, teste levedyktighet av linjer for slike atskillinger eller som en grunnleggende modell for andre typer målrettet nevrale differensiering.

In vitro protokoller for å skille hPSCs mot lillehjernen linjene først drives på prinsippet om mimicking i vivo lillehjernen utvikling1,2,3,4. Som sådan, krevde de en rekke faktorer introdusert til bestemte tider kjøre pro-lillehjernen mønstre og modning. Chief blant disse var WNT, bein Morfogenetiske proteiner (BMP), og fibroblast vekstfaktorer (FGFs) med kjente roller i midten av hindbrain utvikling og dannelsen av isthmic organizer5,6,7. Selvfølgelig hver ekstra trinn og faktor betyr en økning i arbeidskrevende manipulasjoner og større regning for forskeren, og så utvikling enklere oppnå like resultater er av interesse. Dette praktiske problemet føyer seg sammen pent med den hypotetiske spørsmålet, om cellene trenger slike stramt, ekstern kontroll over deres utvikling i vitro.
For lillehjernen differensiering adressert en protokoll publisert i 2015 bruk av et omfattende antall vekstfaktorer med bare FGF2, FGF19 og stromal cell-derived faktor 1 (SDF1) for mønstre formål8. Denne studien også skilte seg fra tidligere lillehjernen protokoller, ved hjelp av en frittflytende 3D kultur-systemet. I tillegg produserer celler positivt for lillehjernen markører, ble hjernen "organoids" generert av deres teknikk vist å vise relevante morfologi, utilgjengelig i tradisjonelle 2D monolayer kulturer, som rhombic leppe-lignende strukturer. Selv om mindre kompliserte og kostbare forhold til vekstfaktorer, andre funksjoner som dannelsen av uniform embryoid organer (EBs) og kultur i 96-brønnen plater (96WPs), du gjorde det Prosedyremessig komplekse under innledende skritt. En annen 3D protokoll utgitt samme år, rapporterte vellykkede differensiering å nevrale linjene med felles og rimelig celle kultur teknikker9. Selv om denne gruppen ble undersøkt kortikale enn lillehjernen differensiering, kunne anvendelse av sitt konsept for lillehjernen differensiering ikke bli nedsatte.
Vi har nylig rapportert en 3D lillehjernen differensiering protokoll med et redusert antall mønstre faktorer (nemlig FGF2, 4 og 8), og en forenklet oppsett ved å holde cellene i 6-vel plater (6WPs) gjennom å minimere medium krav10. Hjelp produksjon av granule celler, ble smoothened Agonistiske (SAG) brukt under det endelige modning trinnet. SAG er en billigere kjemiske alternativ soniske pinnsvin (SSH), som hadde blitt brukt i tidligere lillehjernen protokoller sin viktige rolle i å fremme veksten av granule celle prekursorer (GCPs) i vivo1,2, 11,12,13. Differensiering produkter var i samsvar med de fra andre 3D protokoller, inkludert tilstedeværelse av lillehjernen-assosiert markører i morphologically relevante strukturer8,9. Slike resultater forsterke tidligere budskapet som detaljerte etterligner for vivo miljø ikke være nødvendig for komplekse 3D i vitro differensiering protokoller.
I tillegg til 3D protokollen, denne rapporten beskriver en 2D protokoll, designet med samme Hurtigstartguide, grunnleggende materialer, og redusert antall vekstfaktorer. Det produsere celler fra menneskelige embryonale stamceller (hESCs) eller indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), positivt for markører knyttet tidlig nevrale, lillehjernen, og granule celle identiteter. I tillegg indikerer kalsium imaging tilstedeværelse av funksjonell menneskelige neurons. Muligheten til å velge mellom protokoller, legger til et nivå av fleksibilitet for forskere, for de som er interessert i enten: (1) genererer bestemt celle skriver, (2) modellering menneskelige hjernens utvikling og tilhørende strukturer, (3) analyse optimalisert i monolayer innstillinger (f.eks, patch-klemme opptak), eller (4) celle-celle interaksjoner i blandet nevrale kulturer. Deres enkel og rimelig natur gjør dem tilgjengelig for forskere som er nye til feltet hPSC, eller trenger base hPSC prosedyrer å utforske videre differensiering alternativer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>glutamine fortified DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>neural basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Imgen</td>
			<td>PT468-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>aka Poly-Hema</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium and supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>hPSC medium and supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>SelleckChem</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 um filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM996</td>
			<td>wrap for culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>368632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>trypsin-based dissociation agent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>100-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-8B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic Factor 3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened Agonist (SAG)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11914</td>
			<td>CAS 912545-86-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 40C microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging - image aquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0996</td>
			<td>centrifuge for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>3623140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESCs</td>
			<td>WiCELL</td>
			<td></td>
			<td>line H01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification

Redusere kompleksiteten og kostnaden av differensiering protokoller er viktig for forskerne. Denne interessen passer med bekymringer om mulige utilsiktede virkninger som ytre mønstre faktorer kan introdusere i menneskelig pluripotent stilk cellen (hPSC) modeller av hjernens utvikling eller patofysiologi, for eksempel maskering sykdom fenotypen. Her presenterer vi to lillehjernen differensiering protokoller for hPSCs, designet med enklere oppstartsmetoden, færre mønstre faktorer, og mindre materielle krav enn tidligere protokoller. Nylig har utviklet vi kultur prosedyrer, som genererer frittflytende 3-dimensjonale (3D) produkter samsvar med andre hjernen "organoid" protokoller, inkludert morphologies gjelder modellering hjernens utvikling som sub/ventrikkel sone- og rhombic leppe-lignende strukturer. Andre bruker en tilhenger, 2D monolayer prosedyre å fullstendig differensiering, som vises i stand til å generere funksjonelle lillehjernen neurons, som er positivt for lillehjernen-assosiert markører, og viser Nevron som kalsium influxes. Sammen tilbyr disse protokollene forskere et utvalg av muligheter egnet til forskjellige forskningsformål, samt en grunnleggende modell for å teste andre typer strømlinjeformet nevrale atskillinger.

Visuell oversikt over redusert vekst faktor 2D og 3D lillehjernen differensiering protokoller Figur 1 viser samlede tidslinjen for 2D- og 3D lillehjernen differensiering protokollene, identifisere extrinsic faktorer og tid ved plating. Typisk fremdriften for hPSCs gjennomgår 3D lillehjernen differensiering er avbildet i figur 2: med hESC linje H01 som kolonier i mater-fri kultur på dag 0 (øverst til venstre i figur); gjennomgår EB dannelsen av dag 2 (øvre midten); vokse til større celle aggregater med tilsynelatende lumen etter neural induksjon RA og FGF8 på dag 14 (øverst til høyre); danner aggregater av varierende størrelse og form på dag 28 (nedre venstre); utvikle i kompleksitet med ulike strukturer i en enkelt samlet angitt i dag 28 (lavere midten); og fortsatt morfologiske endringer i de samme strukturene på dag 35 (nederst til høyre). Typisk fremdriften for hPSCs gjennomgår 2D lillehjernen differensiering er avbildet i Figur 3: med hESC linje H01 som kolonier i mater-fri kultur på dag 0 (øverst til venstre i figuren sirkel angir området av differensierte celler blant hESC kolonier) ; gjennomgår EB dannelsen av dag 2 (øvre midten); vokse til større celle aggregater med tilsynelatende lumen etter neural induksjon RA og FGF8 på dag 13 (øverst til høyre); proliferating som tilhenger celler etter plating på dag 14 (nedre venstre); og da som en monolayer av celler med mer komplekse passer morfologi på dag 35 under lav (lavere midten) og forstørring (nederst til høyre).
3D produkter Exhibit markører og strukturer av tidlig Neuroepithelium Figur 2 (nedre venstre bilde) og Figur 4 viser heterogenitet av 3D samlet morfologi sett hele dyrking, på grunn av varierende vekst og/eller modning priser, samt Stokastisk sammenslåing eller bryte fra hverandre av aggregater. Til tross for heterogenitet produserer hver differensiering aggregater viser tidlig nevrale og neuronal markører, inkludert lillehjernen granule markør ZIC1, som angitt av immunocytochemistry (ICC) flekker i figur 5. Enda viktigere, foreslår figur 5 og figur 6 at en enkel 3D kultur, med redusert vekst faktorer, er generere aggregater med komplekse strukturer knyttet til hjernens utvikling som tidlig neuroepithelium og rhombic leppe.
2D produkter Exhibit lillehjernen markører og funksjonelle Neuronal aktivitet 2D kulturer ikke kan reprodusere komplekse 3D strukturer, er de i stand til å generere celler viser tidlig nevrale og neuronal markører, inkludert lillehjernen granule cellen merket ZIC1, som angitt av ICC flekker i figur 7. Gene expression analyse via RT PCR, støtter som vist i Figur 8, ICC flekker resultater, men tidlig granule celle markør ATOH1 er variabel mellom eksperimenter og. Kalsium imaging håndteres lettere i 2D kultur. Som vist i figur 9, supplerende Video 1og supplerende Video 2, Vis elektrisk stimulert celler kalsium influxes som er typiske for neuronal avfyring mønstre, foreslå generasjon functional nerveceller.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> Figur 1: tidslinje av differensiering protokollen (starter på dag 0 av differensiering). Heltrukket linje bokser angir når spesifikke faktorer legges til kultur medium, og prikket linje bokser angir plate belegg for valgfrie 2D endring. Hvis FGF2, pil ned refererer til lave konsentrasjoner (4 ng/mL) og pil opp refererer til høyere konsentrasjoner (20 ng/mL). Dette tallet er endret fra Holmes og Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> Figur 2: representant brightfield bilder av 3D protokollen. hESC kolonier i d0, EBs på d2, samler etter induksjon d14, aggregater av forskjellig størrelse og morfologi (nummerert 1-5) på d28, en enkelt samlet med unik, identifiserbare funksjoner (angitt med bokstaver en-c) på d28, og synlige endringer i de samme funksjonene på d35. Skala bar = 100 µm. Dette tallet er endret fra Holmes og Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> Figur 3: representant brightfield bilder av 2D protokollen. hESC kolonier en d0, EBs på d2, samler etter innledningen på d13, etter plating tilslag på d14, etter modning på d35 sett på 5 x forstørrelse og 20 x forstørrelse. Den hvite sirkelen i øvre venstre panel viser området av differensierte celler blant hESC kolonier. Skala bar = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> Figur 4: Brightfield bilder viser av varierende størrelse og kompleksitet i 3D kultur. Aggregater på (A) dag 8 (hESCs) og (B) d35 (hiPSCs). Det siste bildet består av tre separate bilder å vise hele samlet. Begge aggregater kan ha blitt påvirket av sammenslåing av mindre mengder eller tap (bryte ut) av strukturer. Skala bar = 200 µm. Dette tallet er publiseres fra Holmes og Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> Figur 5: ICC bilder av 3D vise relevante indikatorer og strukturer. På kultur d35, 3D produkter utstilling: PAX6 (grønn) og TBR2 (rød) av lumen av nevrale rosett-lignende formasjon (1.p); DCX (grønn) og NeuN (rød) sprer seg fra ytterkanten ventrikkel sone (VZ)-som struktur (andre rad); KIRREL2, en markør tilknyttet lillehjernen neuroepithelium (tredje rad, venstre); og ZIC1 en tilknyttet lillehjernen granule celler (tredje rad, høyre). Eksperimentet ble gjennomført flere ganger med fire ulike hPSC linjer: hESC linje H01 (n = 5), og iPSC linjer hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), og hvs51 (n = 1). Piler peker til Rhombic leppe (RL)-som struktur. Skala bar = 100 µm. Dette tallet er publiseres fra Holmes og Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> Figur 6: storskala ventrikkel sone-lignende struktur i 3D produktet. Kultur d35 er en hESC-avledet samlet positivt for PAX6 (grønn) og TBR2 (rød) vanligvis forbindes med tidlig neurons innen ventrikkel soner (VZs) og subventricular soner (SVZs), i vivo. (Øverst) En stjerne (*) markerer den apikale siden av VZ som regionen kjører langs kanten av mengdeberegningen, med parenteser som angir dybde/deling av VZ / SVZs. (midten) fusjonerte signaler Vis spredte delene av PAX6 / TBR2-celler øker i størrelse til øvre høyre av VZ. (Nederst) Høyere forstørrelse bilde av avsnittet angitt med et rektangel i midtre panelet. Skala bar = 100 µm. Dette tallet er endret fra Holmes og Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> Figur 7: ICC bilder av 2D produkter Vis relevante indikatorer. På kultur d35, 2D produkter exhibit, fra hESCs (øverste rad) og hiPSCs (nederste rad), celler positivt for: granule celle trådkorsmarkør ZIC1 og vandrende lillehjernen neuron TAG1 (venstre kolonne); og neuronal markør neurofilament (NF) og TAG1 (høyre kolonne). Skala bar = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> Figur 8: RT PCR 2D produkter. mRNA uttrykk analyse av hESC linje H01 (øverste rad) og hiPSC linje hvs60 (nederste rad) på slutten av 2D protokoll viser produkter med gel geleelektroforese for: granule cellen merket ZIC1, granule cellen merket ATOH1, vandrende lillehjernen Nevron markør TAG1, Purkinje cellen markør Calbindin (CALB), spenning-avhengige kalsium kanal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), gamma - aminobutyric acid (GABA) B reseptor 1 (G-Br1), og housekeeping genet EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> Figur 9: kalsium bildebehandling/analyse av 2D. På kultur d35, ble hPSC differensiering produkter registrert i 2 minutter under mikroskopet, etter inkubasjon med fluor5 farge. 30 s, celler var påtrykkes for 10 s på 10 Hz. (A) stillbilder Vis hESCs på 0 s (venstre) og etter starten av elektrisk stimulering 30 s (høyre). Pilene angir områder av interesse (ROI) for analyse av kalsium tilstrømningen. (B) grafisk analyse viser endringen i relativ fluorescens versus tid for avkastning (endre fluorescens = (F-F0) /F0, der F0 = (∑F1-n) / n), med Nevron-like pigger oppstår før, under og etter stimulering. Svart linje angir lengden på elektrisk stimulering. Skalere bar (hvit) = 50 µm. Full opptak for hESC (som sett her) og en hiPSC linje (vises ikke) finnes i supplerende Video 1 og supplerende Video 2, henholdsvis. Opptak er i AVI-format, med 4 x hastighet. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Ekstra Video 1: kalsium imaging video av 2D produkt fra hESC linje H01. På kultur d35, differensiering produkter fra hESC linje H01 ble registrert i 2 minutter under mikroskopet, etter inkubasjon med fluor5 farge. 30 s, celler var påtrykkes for 10 s ved 10 Hz. opptak ble gjort for 2 rammer/s, og behandlet AVI video på ~ 7 rammer/s, produsere en video varer ~ 30 s, hastighet på ~ 4 x. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Ekstra Video 2: kalsium imaging video av 2D produkt fra hiPSC linje hvs51. På kultur d35, ble differensiering produkter fra hiPSC linje hvs51 registrert i 2 minutter under mikroskopet, etter inkubasjon med fluor5 farge. 30 s, celler var påtrykkes for 10 s ved 10 Hz. opptak ble gjort for 2 rammer/s, og behandlet AVI video på ~ 7 rammer/s, produsere en video varer ~ 30 s, hastighet på ~ 4 x. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification at JoVE.com

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Vi beskriver en forenklet 3D differensiering protokoll for hPSCs, bruker definert medium og redusert vekst faktorer, generere celle aggregat med tidlig neuroepithelial strukturer og positivt for lillehjernen-assosiert markører, samt en valgfri 2D modifisering for å skille celler som en monolayer til å generere functional nerveceller.

Strømlinjeformet 3D lillehjernen differensiering protokoll med valgfri 2D modifikasjon

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D organotypiske Co-kultur Modell Støtte Medullary Thymus- epitelcelleproliferasjon, Differensiering og Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex vivo Culture of Chick lillehjernen Slices og Romlig Målrettet Electroporation av granulat Cell Forstadier

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protokol for differensiering av humane inducerte pluripotente stamceller i blandede kulturer av neuroner og glia for test av neurotoxicitet

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tredimensjonal gjengivelse og analyse av Immunolabeled, avklart menneskelige Placental Villous vaskulære nettverk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediert tap av funksjon analyse i lillehjernen Granule celler ved hjelp av In Utero Electroporation-baserte genoverføring

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Kjemisk hjemfall til konvensjonelle menneskelige Pluripotent stamceller til en naiv-lignende tilstand med forbedret Multilineage differensiering styrke

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptiske Microcircuit modellering med 3D Cocultures av astrocyttene og Neurons fra menneskelige Pluripotent stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Transient behandling av humant Pluripotent stamceller med DMSO å fremme differensiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...