Name: streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 15 s
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Nós estamos gratos ao Gerbren Jacobs e Jurjen Broeke para sua assistência técnica especializada, a Prisca Leferink por contribuir para a geração e caracterização de duas linhas de iPSC de controle e a Lisa Gasparotto por demonstrar os nossos procedimentos.

<ol>
	<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2012).</li><li>Su, H. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12, 671-678 (2015).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium.">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6, 402-406 (2017).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened.">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells.">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li><li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6,+Tbr2,+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia,+intermediate+progenitor+cells,+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex.">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li><li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming.">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Complexidade e os custos são factores relevantes para pesquisadores de células-tronco ao escolher ou desenvolvimento de protocolos de diferenciação. Isto é especialmente verdadeiro porque é uma questão em aberto de quanto controle externo é necessário para gerar tipos de células desejado, ou — para posar é diferente — como hPSCs competentes estão em produzir seu próprio ambiente de desenvolvimento, se deixou a mesmos com suficiente nutrientes. Introdução de fatores extrínsecos em vitro pode muito bem produzir produtos da célula desejada, mas eles também podem interferir com as capacidades do desenvolvimento intrínsecas células que comparecemos na vivo. Tais considerações são importantes, especialmente se o objetivo é o uso de derivados de paciente iPSCs para modelagem de doença. Uso extensivo de padronização e/ou fatores de crescimento pode mascarar fenótipos de doença. Os protocolos detalhados neste relatório seguem a tendência de estudos anteriores para reduzir a complexidade, custo, e/ou uso de padronização extrínsecos fatores8,9.
Com base em resultados relatados por Muguruma et al e nosso próprio estudo recente, parece que é possível conseguir diferenciação para destinos Cerebelares sem esforços concertados para reproduzir condições na vivo , como estudos anteriores feitos 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. a parte intrigante é que os dois estudos usado diferentes conjuntos de fatores de crescimento, sugerindo que o conjunto nem eram necessário, embora ambos usados FGF2. Nós fizemos testes adicionais, onde FGFs seletivamente foram excluídos do protocolo e mostrou que as células eram capazes de gerar os mesmos produtos sem extrínseco FGFs10. Diferenças entre nossos estudos foram qualificadas pelo fato de que usamos hPSC diferentes linhas e métodos de cultura, induziu a diferenciação neural com RA e incluíram componentes para oferecer suporte a sobrevivência da pilha do grânulo e maturação (BDNF, GDNF, SAG e KCL)11 –14. Além disso, um método de inicialização menos complexo, em comparação com Muguruma et al., foi empregado. O protocolo deles começou gerando EBs uniforme em 96WPs, que isolado-los fisicamente e quimicamente uns dos outros. O protocolo aqui tinha todos os EPS relativamente amontoados em 6WPs durante a formação de EB, o que permitiu que eles interajam livremente. Como isto pode ter diferencialmente afetado o ambiente físico e químico de EBs e organoids posterior (incluindo produção intrínseca de sinalização compostos) é desconhecido e pode ser explorado. Além disso, enquanto mostramos a expressão de genes associados — e tão sugestivos de — origem cerebelar, localizada dentro de estruturas morfologicamente semelhantes aos relatados por Muguruma et al., não podemos excluir geração de neuronal-como estruturas que são de identidade não-cerebelar. Estudos futuros, usando um grande painel de anticorpos como aqueles relatados por Muguruma et al (ou seja, ATOH1, CALB, etc) tornaria tais atribuições e comparação entre produtos de ambos os protocolos, mais conclusivos.
Dentro do protocolo 3D, isso é importante para começar e manter um número suficiente de células em cultura para garantir um número suficiente de produtos finais para análise. Dada a significativa mortandade cedo no protocolo, recomendamos começar com mais de 500 EBs/bem durante os 3 primeiros dias na cultura (Figura 1). Isto não deve ser difícil de alcançar determinada colônia tamanhos para hPSCs na cultura do alimentador-livre, mas pode não ser tão fácil para aqueles que ainda utilizam métodos alimentador-dependente. Dado o grande número de células, é importante prestar atenção para a alteração de cor no meio (indicando as alterações do pH) e acúmulo de células mortas. Ambos devem ser corrigidos para evitar o colapso da cultura. Também pode haver aglutinação de células e agregados em estruturas maciças. Embora ainda pode resultar em agregados que podem ser analisados, quantidade de produto será bastante reduzida, portanto, quebrando-os em agregados menores com trituração suave pode ser útil. No entanto, evitar agregados normais perturbadoras, que eles mesmos podem crescer até tamanhos grandes (Figura 4). Se agregados tornam-se muito esparsos, é aconselhável combinar os poços para que os agregados não são completamente isolados. Variabilidade do produto (em número, tamanho e morfologia) é um problema bem conhecido em cultura de células 3D, inclusive para aqueles protocolos começando com isolado, uniformes EB formação passos, sugerindo que um procedimento de inicialização menos complexo (tais como o protocolo descrito aqui ) pode ser mais prático8,15. Embora esta heterogeneidade é algo pesquisadores precisam manter em mente, particularmente durante a análise, o protocolo relatado gerado produtos consistentes com aqueles encontrados em outros protocolos 3D8,9,15. Baseado no tamanho e morfologia, eles caem dentro do intervalo de Roseta neural de organoides cerebral, conforme descrito em uma recente revisão por Kelava e Lancaster15, com o mais adequado à classificação de esferoide. Particularmente notável, são a presença de estruturas 3D sugestivos de rosetas neurais com lúmen, zonas ventriculares (sub) e rômbico-lábio como características (Figura 5 e Figura 6) identificados por outros grupos8 , 15 , 16 , 17. desde que cada experimento produzido pelo menos um agregado com putativos VZ/SVZs e marcadores cerebelar associada (ZIC1, KIRREL2), são critérios úteis para determinar o sucesso de uma diferenciação 3D usando nosso protocolo, com RL-like características, fornecendo apoio adicional. Estender o comprimento de cultura passados 35 dias não foi testado, mas seria possível para determinar a extensão máxima de crescimento, a complexidade e maturidade permitido por esta técnica.
O protocolo 2D usa a mesma formação de EB não-aderente e o processo de indução neural como o protocolo de 3D e então os comentários acima também se aplica. Uma vez chapeado, um conjunto de considerações diferentes deve ser considerado. O EBs devem aderir rapidamente para as células a proliferar para fora na placa. Se houver problemas com a aderência, adição de RI (se não já usado), reduziram o volume de meio, ou experimentais alterações na concentração de PLO/LAM podem ser aplicadas. É importante manter as células de crescimento muito densa ou escassa (de preferência crescido entre 20-80% confluência) dos poços; acompanhamento diário e oportuna passagem é importante, para evitar células acabou-confluência ou flutuantes. Ao contrário do protocolo de 3D, não deve haver significativa mortandade durante a cultura, embora possa haver zonas de crescimento pobre, ou uma desaceleração das taxas de proliferação. Passagem afeta o estado de maturação das células (por exemplo, remoção de processos celulares e redes desenvolvidas entre as células) e deve ser mantido em mente quando se aproxima de pontos onde as células serão recolhidas ou analisadas de alguma forma. Por exemplo, para o cálcio de imagem é muito importante para as células de passagem entre 2 a 6 dias antes da análise. Passagem muito perto de análise pode significar células não tiveram tempo para se conectar e/ou madura e longe demais podem resultar em células superlotação, dificultando a imagem latente. Embora possam existir variabilidade entre experiências, resultados são consistentes com aqueles relatados na inicial 2D cerebelar protocolos1,2. Análise de expressão de gene e coloração ICC corroboram a presença de células positivas para o marcador de célula grânulo ZIC1, enquanto também identifica marcadores associados com outras identidades neurais e Cerebelares (Figura 7 e Figura 8). Imagem de cálcio, que envolve a estimulação elétrica das células incubadas com tintura de fluor5, indicou atividade neuronal funcional (Figura 9, suplementar 1 Figurae suplementar a Figura 2), embora não está confirmado se estes eram células grânulo. É discutível que, dando as células mais tempo para amadurecer, estendendo o comprimento da cultura últimos 35 dias, aumente a quantidade de atividade neuronal funcional. Este potencial pode ser explorado no futuro.
Além das linhas de pesquisa acima sugeridas, que seria de interesse para determinar diferenças nas identidades de produto (quantidade e qualidade) entre os protocolos 2D e 3D. A importância da FGFs extrínsecas não foi testada no protocolo 2D, e seria útil saber se a falta de estrutura 3D depois de chapeamento, e então as vias de sinalização associadas, tornaria 2D culturas mais ou menos dependentes aqueles cedo padronização compostos. Os protocolos mais reduzidos (por exemplo, não RA, BDNF, SAG) são igualmente plausíveis linhas para maiores investigações. Finalmente, estudos futuros podem se beneficiar de novas ferramentas de pesquisa para melhor caracterizar (e avaliar a eficiência de geração de) humanos específicos Cerebelares neuronais subtipos.
Com as determinado ressalvas em mente, ambos relataram protocolos podem ser utilizados para diferenciações Cerebelares, com produtos adequados para diferentes propósitos. Eles podem servir como pontos de partida práticos para pesquisadores realizando estudos-piloto, testes de viabilidade da linha celular para tais diferenciações, ou como um modelo básico para outros tipos de diferenciação neural alvo.

In vitro de protocolos de diferenciação hPSCs em direção a linhagens Cerebelares inicialmente operou-se o princípio da imitando na vivo desenvolvimento cerebelar1,2,3,.4. Como tal, eles precisavam de uma sucessão de fatores introduzidos em alturas específicas para conduzir a maturação e padronização pro-cerebelar. Chefe entre estes foram WNT, osso proteínas morfogenéticas (BMPs) e fatores de crescimento do fibroblasto (FGFs) com funções conhecidas no meio do rombencéfalo desenvolvimento e formação do organizador isthmic5,6,7. Claro, cada etapa adicional e fator significam um aumento de manipulações trabalhosas e maior despesa para o pesquisador, e então desenvolver protocolos mais simples capazes de atingir resultados iguais é de interesse. Esse problema prático se encaixa muito bem com a questão hipotética, se as células exigem tal controle apertado, externo ao longo de seu desenvolvimento in vitro.
Para diferenciação cerebelar, um protocolo publicado em 2015 abordou a necessidade de utilizar um número extenso de fatores de crescimento, usando apenas FGF2, FGF19 e fator derivado de células do estroma 1 (SDF1) para padronização de fins8. Este estudo também difere de protocolos Cerebelares anteriores, usando um sistema de livre flutuação cultura 3D. Além de produzir células positivas para marcadores Cerebelares, os cérebro "organoids" gerados por sua técnica foram mostrados para expor a morfologia relevante, indisponível em culturas de monocamada 2D tradicional, tais como estruturas lábio rômbicas. Embora menos complexo e oneroso com relação a fatores de crescimento, outras características tais como a formação dos órgãos do embryoid uniformes (EBs) e cultura em placas de 96 poços (96WPs), fez processualmente complexo durante os primeiros passos. Outro protocolo 3D publicado no mesmo ano, relataram sucesso diferenciação de linhagens neurais, utilizando de técnicas de cultura celular comum e barato9. Embora este grupo estava investigando cortical ao invés de diferenciação cerebelar, aplicação de seu conceito de diferenciação cerebelar não pode ser descontada.
Informamos recentemente um protocolo de diferenciação cerebelar 3D usando um número reduzido de fatores de padronização (ou seja, FGF2, 4 e 8), bem como de uma configuração simplificada, mantendo as células em placas de 6-bem (6WPs) por toda parte para minimizar requisitos média10. Para auxiliar na produção de células do grânulo, smoothened agonista (SAG) foi usada durante a etapa de maturação final. SAG é uma alternativa menos cara de química para sonic hedgehog (SHH), que tinha sido utilizado em anteriores protocolos Cerebelares, devido ao seu papel na promoção do crescimento do grânulo célula precursores (GCP) na vivo1,2, 11,12,13. Diferenciação de produtos foram consistentes com aqueles de outros protocolos 3D, incluindo a presença de marcadores cerebelar associada em estruturas morfologicamente relevantes8,9. Tais resultados reforçam a mensagem anterior que detalhava o mimetismo do na vivo ambiente pode não ser necessário para complexo 3D em vitro protocolos de diferenciação.
Além do protocolo 3D, este relatório descreve um protocolo 2D, projetado com a mesma configuração rápida, materiais básicos e reduziu o número de fatores de crescimento. É capaz de produzir células de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou induzida por células-tronco pluripotentes (hiPSCs), positivas para marcadores associados cedo neural, cerebelar e identidades de célula grânulo. Além disso, a imagem de cálcio indica a presença de neurônios humanos funcionais. A capacidade de escolher entre protocolos, adiciona um nível de flexibilidade para os investigadores, para aqueles interessados em ambos: (1) geração de célula específica, desenvolvimento do cérebro humano (2) modelagem e tipos associados a estruturas, (3) análise otimizada em monocamada configurações (por exemplo, gravações de patch-clamp), ou (4) interações célula-célula em cultura mista neural. Sua natureza simples e de baixo custo torna-las acessíveis para os investigadores que são novos para o campo de hPSC, ou precisam de procedimentos hPSC base para explorar ainda mais opções de diferenciação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>glutamine fortified DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>neural basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Imgen</td>
			<td>PT468-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>aka Poly-Hema</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium and supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>hPSC medium and supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>SelleckChem</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 um filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM996</td>
			<td>wrap for culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>368632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>trypsin-based dissociation agent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>100-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-8B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic Factor 3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened Agonist (SAG)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11914</td>
			<td>CAS 912545-86-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 40C microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging - image aquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0996</td>
			<td>centrifuge for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>3623140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESCs</td>
			<td>WiCELL</td>
			<td></td>
			<td>line H01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification

Reduzindo a complexidade e o custo dos protocolos de diferenciação é importante para os investigadores. Este interesse se encaixa com preocupações sobre possíveis efeitos não intencionais que fatores extrínsecos padronização podem introduzir células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) modelos de desenvolvimento do cérebro ou fisiopatologia, tais como mascaramento de fenótipo da doença. Aqui, apresentamos dois protocolos de diferenciação cerebelar para hPSCs, projetado com método de inicialização mais simples, menos factores de padronização e menos exigências materiais do que os protocolos anteriores. Recentemente, desenvolvemos procedimentos de cultura, que geram flutuantes 3-dimensional (3D) produtos consistentes com outros protocolos de "organoides" do cérebro, incluindo morfologias relevantes para o desenvolvimento do cérebro tais como zona ventricular/subde modelagem e rômbicas lábio-como estruturas. O segundo utiliza um procedimento de monocamada aderentes, 2D para diferenciação completa, que é mostrado capaz de gerar neurônios Cerebelares funcionais, como produtos são positivos para marcadores cerebelar associada e exibem afluxos de cálcio como neurônio. Juntos, esses protocolos oferecem cientistas uma escolha de opções adequadas para fins de investigação diferentes, bem como um modelo básico para testar outros tipos de diferenciações neurais simplificadas.

Visão geral visual do crescimento reduzido Factor de protocolos de diferenciação cerebelar 2D e 3D A Figura 1 mostra o cronograma global para os protocolos de diferenciação cerebelar 2D e 3D, identificação de fatores extrínsecos e tempo do chapeamento. O progresso típico para hPSCs, passando por diferenciação cerebelar 3D é representado na Figura 2: com hESC linha H01 como colônias no cultura livre de alimentador no dia 0 (superior esquerdo da figura); passando por formação EB por dia 2 (médio superior); crescendo em grandes agregados de células com lúmen aparente após indução neural com RA e FGF8 no dia 14 (superior direito); formação de agregados de tamanho variável e forma no dia 28 (canto inferior esquerdo); desenvolvimento de complexidade com diferentes estruturas de um único agregado indicado no dia 28 (médio inferior); e com continuidade mudanças morfológicas para as mesmas estruturas no dia 35 (inferior direito). O progresso típico para hPSCs, passando por diferenciação cerebelar 2D é representado na Figura 3: com hESC linha H01 como colônias na cultura do alimentador-livre no dia 0 (canto superior esquerdo da figura, com círculo indicando a área de células diferenciadas entre colônias hESC) ; passando por formação EB por dia 2 (médio superior); crescendo em grandes agregados de células com lúmen aparente após indução neural com RA e FGF8 no dia 13 (superior direito); se proliferando como células aderentes após chapeamento no dia 14 (canto inferior esquerdo); e depois como uma monocamada de células com morfologia mais complexo/maduro no dia 35 sob alta ampliação (inferior direito) e baixo (médio inferior).
Marcadores de exposição de produtos 3D e estruturas de Neuroepithelium início Figura 2 (imagem inferior esquerda) e a Figura 4 mostra a heterogeneidade da morfologia de agregados 3D vista em todo o cultivo, devido à variação crescimento e/ou taxas de maturação, bem como a fusão estocástico ou desfazer-se dos agregados. Apesar da heterogeneidade, cada diferenciação produz agregados exibindo primeiros marcadores neurais e neuronais, incluindo o marcador de grânulo cerebelar ZIC1, como indicado por imunocitoquímica (ICC) coloração na Figura 5. Mais importante, a Figura 5 e Figura 6 sugerem que uma cultura 3D simples, com redução de fatores de crescimento, é capaz de gerar agregados com estruturas complexas relacionadas com o desenvolvimento do cérebro, tais como o neuroepithelium precoce e lábio rômbico.
2D produtos exibem atividade Neuronal funcional e marcadores Cerebelares Enquanto culturas 2D não podem reproduzir estruturas 3D complexas, são capazes de gerar células exibindo primeiros marcadores neurais e neuronais, incluindo o marcador de célula grânulo cerebelar ZIC1, conforme indicado pela ICC coloração na Figura 7. Análise de expressão do gene através de RT-PCR, como visto na Figura 8, oferece suporte a resultados de coloração de ICC, embora a presença do marcador de célula grânulo cedo ATOH1 é variável entre as experiências e as linhas. Imagem de cálcio é mais facilmente tratada na cultura 2D. Como visto na Figura 9, suplementar Video 1e 2 de vídeo suplementar, eletricamente estimulado as células apresentam fluxos de cálcio que são típicos de disparo neuronal padrões, sugerindo que a geração de neurônios funcionais.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> Figura 1: linha do tempo do protocolo de diferenciação (iniciando no dia 0 de diferenciação). Caixas de linha sólida indicam quando fatores específicos são adicionados ao meio de cultura, e caixas de linha pontilhada indicam placa-revestimento para modificação 2D opcional. Por FGF2, na seta para baixo refere-se a concentrações inferiores (4 ng/mL), e a seta para cima refere-se a umas concentrações mais elevadas (20 ng/mL). Esta figura foi modificada de Holmes e Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> Figura 2: imagens brightfield representante do protocolo 3D. hESC colônias no d0, EBs em d2, agrega após indução no d14, agregados de diferente tamanho e morfologia (numerados de 1-5) no d28, um único agregado com exclusivos, identificáveis características (indicadas por letras um–c) no d28, e mudanças visíveis nas mesmas características em d35. Barra de escala = 100 µm. Esta figura foi modificada de Holmes e Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> Figura 3: imagens brightfield representante do protocolo 2D. hESC colônias um d0, EBs em d2, agrega após indução no d13, depois chapeamento agregados no d14, após maturação em d35, como visto em 5x ampliação e ampliação de 20 x. O círculo branco no painel superior esquerdo mostra a área de células diferenciadas entre colônias hESC. Barra de escala = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> Figura 4: Brightfield imagens mostrando a variação de tamanho e complexidade na cultura 3D. Agregados em dia (A) 8 (hESCs) e (B) d35 (hiPSCs). A última imagem é composta de três imagens separadas para mostrar todo o agregado. Ambos os agregados podem ter sido afetados pela fusão de agregados ou perda (interrompendo) de estruturas menores. Barra de escala = 200 µm. Esta figura é republicada de Holmes e Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> Figura 5: imagens de ICC de produtos 3D mostram marcadores relevantes e estruturas. Na cultura d35, exposição produtos 3D: PAX6 (verde) e TBR2 (vermelho) pelo lúmen da formação de Roseta, como neural (primeira linha); DCX (verde) e NeuN (vermelho) da zona ventricular de borda externa (VZ)-como estruturar (segunda linha); KIRREL2, um marcador associado com neuroepithelium cerebelar (terceira fila, à esquerda); e ZIC1 um marcador associado com grânulo cerebelar células (terceira fila, direita). O experimento foi conduzido várias vezes usando quatro hPSC diferentes linhas: linha hESC H01 (n = 5) e hvs88 de linhas de iPSC (n = 4), hvs60 (n = 3) e hvs51 (n = 1). As setas apontam para Rhombic lábio (RL)-como estrutura. Barra de escala = 100 µm. Esta figura é republicada de Holmes e Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> Figura 6: estrutura em forma de zona ventricular em grande escala em 3D produto. Na cultura d35, um agregado de hESC-derivado é positivo para PAX6 (verde) e TBR2 (vermelho), comumente associados com primeiros neurônios encontrados dentro de zonas ventriculares (VZs) e zonas subventricular (SVZs), em vivo. (Topo) Um asterisco (*) marca o lado apical de uma região, como VZ correndo ao longo da borda do agregado, com colchetes, indicando a profundidade/divisão de VZ / SVZs. (médio) mesclada sinais mostram secções dispersas de PAX6 + TBR2-células aumentando de tamanho em direção a extremidade superior direita do VZ. (Parte inferior) Imagem de ampliação mais elevada da seção indicada por um retângulo no painel do meio. Barra de escala = 100 µm. Esta figura foi modificada de Holmes e Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> Figura 7: imagens de ICC de produtos 2D mostram marcadores pertinentes. No cultura d35, exposição de produtos 2D, de hESCs (linha superior) e hiPSCs (linha inferior), células positivas para: marcador de célula grânulo ZIC1 e marcador de neurônio cerebelar migratórias TAG1 (coluna da esquerda); e Neurofilamento marcador neuronal (NF) e TAG1 (coluna direita). Barra de escala = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> Figura 8: RT-PCR de produtos 2D. análise da expressão do mRNA da linha hESC H01 (linha superior) e hiPSC linha hvs60 (linha inferior) no final da 2D protocolo mostra produtos com eletroforese em gel para: marcador de célula grânulo ZIC1, grânulo célula marcador ATOH1, marcador migratórias neurônio cerebelar TAG1, Purkinje marcador de célula muscular (CALB), canal de cálcio dependente de voltagem CACNA1A (1A-C), CACNA1E (C-1E), ácido gama - aminobutírico (GABA) receptor de B 1 (G-Br1) e serviço de limpeza gene EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> Figura 9: imagem de cálcio/análise de produtos 2D. Na cultura d35, produtos de diferenciação hPSC foram gravados por 2 min sob o microscópio, após incubação com tintura de fluor5. Em 30 s, células foram estimuladas eletricamente para 10 s 10 Hz. (A) ainda imagens Mostrar hESCs em 0 s (à esquerda) e após o início da estimulação elétrica em 30 s (à direita). As setas indicam a região de interesse (ROI) para análise do influxo de cálcio. Mostrando de análise gráfica (B) mudança de fluorescência relativa versus tempo para ROI (mudar na fluorescência = (F-F0) f0, onde F0 = (∑F1-n) / n), com picos de neurônio-como ocorrem antes, durante e após a estimulação. Barra preta indica o comprimento da estimulação elétrica. (Branco) da barra de escala = 50 µm. completo de gravação para hESC (como visto aqui) e uma linha de hiPSC (não mostrado) estão disponíveis em vídeo complementar 1 e complementar a 2, respectivamente. As gravações são em formato AVI, em velocidade de 4x. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Suplementar vídeo 1: cálcio de imagens vídeo do produto 2D da linha hESC H01. Na cultura d35, produtos de diferenciação hESC linha H01 foram gravadas por 2 min sob o microscópio, após incubação com fluor5 de tingem. Em 30 s, células foram estimuladas eletricamente para 10 s em 10 Hz. gravações foram feitas em 2 frames/s e transformadas em vídeo AVI em ~ 7 frames/s, produzindo um vídeo duração ~ 30 s, a velocidade de ~ 4 x. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Suplementar vídeo 2: cálcio de imagens vídeo do produto 2D de hiPSC linha hvs51. Na cultura d35, produtos de diferenciação de hiPSC linha hvs51 foram gravados por 2 min sob o microscópio, após incubação com tintura de fluor5. Em 30 s, células foram estimuladas eletricamente para 10 s em 10 Hz. gravações foram feitas em 2 frames/s e transformadas em vídeo AVI em ~ 7 frames/s, produzindo um vídeo duração ~ 30 s, a velocidade de ~ 4 x. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Descrevemos um meio de protocolo para hPSCs, usando definido de diferenciação 3D simplificado e reduzido os fatores de crescimento, capazes de gerar agregados de células com início neuroepithelial estruturas e positivos para marcadores cerebelar associada, bem como um opcional Modificação de 2D para diferenciar as células como um monolayer para gerar neurônios funcionais.

Protocolo de diferenciação cerebelar 3D simplificada com modificação 2D opcional

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Research

JoVE Journal

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