Name: streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Gerbren Jacobs och Jurjen Broeke för deras teknisk experthjälp, till Prisca Leferink för att bidra till utveckling och karakterisering av två kontroll iPSC linjer och Lisa Gasparotto för att demonstrera våra förfaranden.

<ol>
	<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2012).</li><li>Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebellar+neuron+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 290, 287-296 (2006).</li><li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons.">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).</li><li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrailed,+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain--hindbrain+development.">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development.</a> Trends Genet. 12, 15-20 (1996).</li><li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otx2,+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer.">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).</li><li>Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Development-The+Impact+of+Preterm+Birth+and+Comorbidities.">Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities.</a> Fetal and Neonatal Physiology. , (2017).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12, 671-678 (2015).</li><li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium.">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6, 402-406 (2017).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened.">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li><li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells.">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li><li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6,+Tbr2,+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia,+intermediate+progenitor+cells,+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex.">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li><li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming.">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Komplexiteten och kostnaderna är relevanta faktorer för stamcellsforskare när du väljer eller utveckla differentiering protokoll. Detta gäller särskilt eftersom det är en öppen fråga om hur mycket extern kontroll krävs för att generera önskat celltyper, eller — att posera det annorlunda — hur behöriga hPSCs är på att producera sin egen utvecklande miljö, om de lämnas åt sig själva med tillräcklig näringsämnen. Införandet av exogena faktorer in vitro- kan mycket väl ge önskad cell produkter, men de kan också störa med inneboende utvecklingsmässiga kapacitet celler skulle ställt in-vivo. Sådana överväganden är viktiga, särskilt om målet är användningen av patientderiverade iPSCs för sjukdom modellering. Omfattande användning av mönstring eller tillväxtfaktorer kunde dölja sjukdomen fenotyper. De protokoll som beskrivs i denna rapport följer trenden i tidigare studier att minska komplexiteten, kostnaden och/eller användning av extrinsic mallning faktorer8,9.
Baserat på resultat som rapporterats av Muguruma et al., och vår egen studie, verkar det som det är möjligt att uppnå differentiering mot cerebellär öden utan gemensamma ansträngningar för att reproducera i vivo villkor, som tidigare studier har gjort 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. den spännande delen är att de två studierna använt olika uppsättningar av tillväxtfaktorer, vilket tyder på att varken set var nödvändiga, även om båda använde FGF2. Vi körde ytterligare tester, där FGFs selektivt uteslöts från protokollet och visade att celler kan generera samma produkter utan extrinsic FGFs10. Skillnaderna mellan våra studier var kvalificerade av det faktum att vi används olika hPSC linjer och kultur metoder, inducerad neurala differentiering med RA och ingår komponenter för att stödja granule cellöverlevnad och mognad (BDNF, GDNF, SAG och KCL)11 –14. Dessutom var en mindre komplex start-metoden, jämfört med Muguruma et al., anställd. Sina protokoll började genom att skapa enhetliga EBs i 96WPs, som isolerade dem fysiskt och kemiskt från varandra. Protokollet här hade alla PSC relativt trångt tillsammans i 6WPs under EB-formationen, vilken tillät dem att interagera fritt. Hur detta kan ha differentially påverkat den fysiska och kemiska miljön av EBs och senare organoids (inklusive inneboende produktion av signalering föreningar) är okänd, och kunde utforskas. Också, medan vi visar uttrycket av gener associerade med — och så suggestiv av — cerebellär ursprung, ligger inom strukturer morfologiskt liknar dem som rapporterats av Muguruma et al., kan vi inte utesluta generation av neuronala-liknande strukturer som är av icke-cerebellär identitet. Framtida studier, med en stor panel av antikroppar som de rapporteras av Muguruma et al. (dvs, ATOH1, CALB, etc.) skulle göra sådana uppdrag, och jämförelse mellan produkter av båda protokollen, mer övertygande.
Inom 3D protokollet, det är viktigt att börja med och upprätthålla ett tillräckligt antal celler i kulturen att säkerställa tillräckligt antal slutprodukter för analys. Gett betydande die-off tidigt i protokollet, rekommenderar vi att du börjar med mer än 500 EBs per brunn under de första 3 dagarna i kultur (figur 1). Detta bör inte vara svårt att uppnå viss koloni storlekar för hPSCs i feeder-fri kultur, men kanske inte lika lätt för de som fortfarande använder feeder-beroende metoder. Med tanke på det stora antalet celler, är det viktigt att titta på för färgförändring medium (indikerar pH-förändringar) och ansamling av döda celler. Båda måste korrigeras för att förhindra kollaps av kulturen. Det kan också finnas klumpar av celler och aggregat i massiva strukturer. Även om det kan fortfarande resultera i aggregat som kan analyseras, reduceras produktkvantitet kraftigt, så att bryta dem upp i mindre aggregat med skonsam sönderdelning kan vara användbar. Dock undvika störande normala aggregat, som själva kan växa till stora storlekar (figur 4). Om aggregat blir alltför gles, rekommenderas det att kombinera brunnar så att aggregaten inte helt isolerade. Produkten variabilitet (i antal, storlek och morfologi) är ett välkänt problem i 3D cellodling, inklusive för de protokoll som börjar med isolerade, enhetlig EB bildandet steg, tyder på att en mindre komplex startproceduren (såsom protokollet beskrivs här ) kan vara mer praktiskt8,15. Medan denna heterogenitet är något som forskare måste ha i åtanke, särskilt under analys, genereras rapporterade protokollet produkter överensstämmer med de som finns i andra 3D protokoll8,9,15. Baserat på storlek och morfologi, faller de inom spänna av neurala rosett till cerebral organoid, som beskrivs i en senaste översyn av Kelava och Lancaster15, med de mest passande klassificering av sfäroid. Särskilt anmärkningsvärt, är förekomsten av 3D-strukturer tyder på neural rosetter med lumen, (sub) ventrikulär zoner och rhombic-lip liknande funktioner (figur 5 och figur 6) som identifierats av andra grupper8 , 15 , 16 , 17. eftersom varje experiment producerade minst en aggregerad med förmodad VZ/SVZs och cerebellär-associerade markörer (ZIC1, KIRREL2), de är användbara kriterier för att avgöra framgången för en 3D differentiering med våra protokoll, med RL-liknande funktioner som ger extra stöd. Utöka längden på kultur tidigare 35 dagar har inte testats, men kunde göras för att fastställa maximala omfattningen av tillväxt, komplexitet och mognad som tillåts av denna teknik.
2D protokollet använder samma icke-anhängare EB formation och neurala induktion process som protokollet 3D och så kommentarerna ovan gäller också. När förgylld, bör en annan uppsättning överväganden övervägas. EBs ska följa snabbt för cellerna att föröka sig utåt på plattan. Om det finns problem med följsamhet, tillägg av RI (om inte redan används), minskad volym av medium eller experimentella förändringar i PLO-LAM koncentration kan tillämpas. Det är viktigt att hålla cellerna från att växa alltför tät eller gles (helst odlas mellan 20-80% konfluens) i brunnarna; daglig övervakning och lägligt passaging är viktigt, att undvika över-konfluens eller flytande celler. Till skillnad från 3D protokollet, bör det inte finnas betydande die-off under kultur, om det kan finnas områden med dålig tillväxt, eller en uppbromsning av spridning priser. Passaging påverkar tillståndet mognad av celler (exempelvis ta bort cellprocesser och utvecklade nätverk mellan celler) och bör hållas i åtanke när du närmar dig punkter där celler kommer att samlas in eller analyserade på något sätt. Till exempel kalcium är imaging det mycket viktigt att passagen celler mellan 2-6 dagar före analys. Passaging för nära kan analys innebära celler inte har haft tid att ansluta eller mogen och för långt kan resultera i celler trångboddhet, försvårar imaging. Även om variationen mellan experiment kan finnas, är resultat förenliga med dem som rapporterats i ursprungliga 2D cerebellär protokoll1,2. ICC färgning och gen uttryck analys bekräfta närvaron av celler som är positiva för granule cellen markör ZIC1, även också identifiera markörer associerade med andra neurala och cerebellär identiteter (figur 7 och figur 8). Kalcium imaging, som innebär att elektrisk stimulering av cellerna inkuberas med fluor5 färgämne, anges funktionella neuronala aktiviteten (figur 9, kompletterande Figur1och kompletterande figur 2), men det inte är bekräftat om dessa var granule celler. Det kan hävdas att genom att ge cellerna mer tid för att mogna genom att förlänga längden på kultur tidigare 35 dagar, funktionella neuronala aktiviteten bör öka. Denna potential kan undersökas i framtiden.
Förutom i linje med forskning som föreslås ovan, skulle det vara av intresse att avgöra skillnader i produkten identiteter (kvantitet och kvalitet) mellan protokollen 2D och 3D. Vikten av extrinsic FGFs testades inte i 2D protokollet, och det skulle vara bra att veta om bristen på 3D-strukturen efter plätering, och så de associera signalvägar, skulle göra 2D kulturer mer eller mindre beroende av de tidigt mönstring föreningar. Mer avskalad protokoll (t.ex., ingen RA, BDNF, SAG) är lika trolig linjer för vidare utredning. Slutligen, framtida studier kan dra nytta av nya forskningsverktyg för att bättre karaktärisera (och bedöma generation effektivitet) mänskliga-specifika cerebellär neuronala undertyper.
Med de givna varningar i åtanke rapporterade båda protokollen kan användas för cerebellär differentieringar, med produkter anpassade till olika ändamål. De kan fungera som praktiska utgångspunkter för forskare pilotstudier, testning livskraft cellinjer för sådana indelningar, eller som en grundläggande modell för andra typer av riktade neurala differentiering.

In vitro -protokoll för att skilja hPSCs mot cerebellär härstamningar initialt drivs på principen att härma i vivo cerebellär utveckling1,2,3,4. Som sådan, krävs de en rad faktorer som infördes vid specifika tidpunkter att köra pro-cerebellär mallning och mognad. Chief bland dessa var WNT, bone morphogenetic proteiner (bmp) och fibroblast tillväxtfaktor (FGFs) med kända roller i mitten av hindbrain utveckling och bildandet av den isthmic arrangör5,6,7. Naturligtvis, varje ytterligare steg och faktor innebär en ökning i arbetsintensiva manipulationer och större kostnader för forskaren och så utveckla enklare protokoll kan uppnå lika resultat är av intresse. Denna praktiska fråga sammanfaller fint med den hypotetiska frågan, huruvida celler behöver sådana snäva, extern kontroll över deras utveckling in vitro.
För cerebellär differentiering upp ett protokoll som publicerades 2015 nödvändigheten av att använda ett omfattande antal tillväxtfaktorer med endast FGF2, FGF19 och stromal cell-derived faktor 1 (SDF1) för mönstring ändamål8. Denna studie skilde sig också från tidigare cerebellär protokoll, genom att använda en fritt flytande 3D kultur system. Förutom att producera celler positiv för cerebellär markörer, visades i hjärnan ”organoids” som genereras av deras teknik att ställa ut relevanta morfologi, inte tillgängliga i traditionella 2D enskiktslager kulturer, såsom rhombic lip-liknande strukturer. Även om det är mindre komplicerat och kostsamt med avseende på tillväxtfaktorer, andra funktioner såsom bildning av enhetliga embryoid organ (EBs) och kultur i 96 brunnar (96WPs), gjorde det förfarandemässigt komplexa under första stegen. En annan 3D protokoll publicerade samma år, rapporterade lyckad differentiering till neurala härstamningar använder gemensamma och billig cell kultur tekniker9. Även om denna grupp undersökte kortikala snarare än cerebellär differentiering, kan tillämpningen av deras koncept för cerebellär differentiering inte diskonteras.
Vi rapporterade nyligen en 3D cerebellär differentiering-protokollet använder ett minskat antal mallning faktorer (nämligen FGF2, 4 och 8), samt en förenklad installation genom att hålla cellerna i 6-väl plattor (6WPs) hela för att minimera medelstora krav10. För att underlätta produktionen av granule celler, användes glättas agonist (SAG) under den slutliga mognad steget. SAG är ett billigare kemiska alternativ till sonic hedgehog (SHH), som hade använts i tidigare cerebellär protokoll, på grund av dess roll för att främja tillväxten av granule cellen prekursorer (GCPs) i vivo1,2, 11,12,13. Differentiering produkter överensstämde med de från andra 3D protokoll, inklusive förekomsten av cerebellär-associerade markörer i morfologiskt relevanta strukturer8,9. Sådana resultat förstärka tidigare budskapet som detaljerade härmning av i vivo miljön kanske inte är nödvändigt för komplexa 3D i vitro differentiering protokoll.
Förutom 3D protokollet, denna rapport beskriver ett 2D protokoll, utformad med samma snabb setup, materialen och minskat antal tillväxtfaktorer. Det är kapabel att producera celler från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) eller inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), positiva markörer associerade med tidigt neurala, lillhjärnan, och granule cellen identiteter. Dessutom indikerar kalcium imaging förekomst av funktionella mänskliga nervceller. Möjligheten att välja mellan protokoll, lägger till en nivå av flexibilitet för forskare, för dem som är intresserade av antingen: (1) generera viss cell typer, (2) modellering mänskliga hjärnans utveckling och tillhörande strukturer, (3) analys optimerad i enskiktslager inställningar (t.ex., patch-clamp inspelningar), eller (4) cell-cell interaktioner i blandade neural kulturer. Deras enkla och billiga natur gör dem tillgängliga för forskare som är nya till fältet hPSC, eller behöver bas hPSC förfaranden att utforska ytterligare differentiering alternativ.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F12+Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td>glutamine fortified DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>neural basic medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Imgen</td>
			<td>PT468-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3932</td>
			<td>aka Poly-Hema</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium and supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>hPSC medium and supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y-27632 (ROCK inhibitor)</td>
			<td>SelleckChem</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5M EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 um filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PM996</td>
			<td>wrap for culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryotubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>368632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>trypsin-based dissociation agent&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R-007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>100-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-8B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial Derived Neurotrophic Factor</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic Factor 3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smoothened Agonist (SAG)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11914</td>
			<td>CAS 912545-86-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 40C microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Brightfield imaging - image aquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>521-0996</td>
			<td>centrifuge for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>3623140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-4951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-wells culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESCs</td>
			<td>WiCELL</td>
			<td></td>
			<td>line H01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined 3d cerebellar differentiation protocol with optional 2d modification

Att minska komplexiteten och kostnaden för differentiering protokoll är viktigt för forskare. Detta intresse passar med farhågor om eventuella oavsedda effekter att extrinsic mallning faktorer kan införa i mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) modeller av hjärnans utveckling eller patofysiologi, såsom maskering sjukdom fenotyp. Här presenterar vi två cerebellär differentiering protokoll för hPSCs, utformad med enklare Startmetod, färre mallning faktorer, och mindre materialbehov än föregående protokoll. Nyligen har utvecklat vi kultur förfaranden, vilket genererar friflytande 3-dimensionell (3D) produkter överensstämmer med andra hjärnan ”organoid” protokoll, inklusive morfologier relevanta för modellering hjärnans utveckling såsom sub/ventrikulär zon- och rhombic Lip-liknande strukturer. Andra använder en vidhäftande, 2D enskiktslager förfarande att komplett differentieringen, som visas kan generera funktionella cerebellär nervceller, som produkter är positiva för cerebellär-associerade markörer, och uppvisar neuron-liknande kalcium tillströmningar. Tillsammans erbjuder dessa protokoll forskare ett urval av alternativ anpassade till olika forskningsändamål samt en grundläggande modell för andra typer av strömlinjeformad neurala differentieringar.

Visuell översikt av minskad tillväxt faktor 2D och 3D cerebellär differentiering protokoll Figur 1 visar övergripande tidslinjen för 2D och 3D cerebellär differentiering protokoll, att identifiera exogena faktorer och tid för plätering. De typiska framsteg för hPSCs som genomgår 3D cerebellär differentiering avbildas i figur 2: med hESC line H01 start som kolonier feeder-fri kultur i dag 0 (övre vänstra delen av figuren); som genomgår EB bildandet av dag 2 (övre mitt); växer till större cell aggregat med uppenbara lumen efter neurala induktion med RA och FGF8 dag 14 (övre högra); bildar aggregat av varierande storlek och form på dag 28 (lägre vänster); utvecklas i komplexitet med olika strukturer av en enda samlade anges vid dag 28 (lägre mitten); och med fortsatt morfologiska förändringar av samma strukturer på dag 35 (nedre högra). De typiska framsteg för hPSCs som genomgår 2D cerebellär differentiering avbildas i figur 3: med hESC linje H01 som kolonier feeder-fri kultur i dag 0 (övre vänstra delen av figuren, med cirkel som anger området av differentierade celler bland hESC kolonier) ; som genomgår EB bildandet av dag 2 (övre mitt); växer till större cell aggregat med uppenbara lumen efter neurala induktion med RA och FGF8 på dag 13 (övre högra); frodas som vidhäftande celler efter plätering dag 14 (lägre vänster); och då som en enskiktslager av celler med mer komplex/mogen morfologi på dag 35 under låg (lägre mitten) och hög förstoring (nedre högra).
3D produkter uppvisar markörer och strukturer av tidig Neuroepithelium Figur 2 (nedre vänstra bilden) och figur 4 visar heterogena 3D sammanlagda morfologi sett under odling, på grund av varierande tillväxt och/eller mognad priser, samt en stokastisk sammanslagning eller bryta isär av aggregat. Trots heterogenitet producerar varje differentiering aggregat uppvisar tidiga neurala och neuronala markörer, inklusive cerebellär granule markör ZIC1, indikerat av immuncytokemi (ICC) färgning i figur 5. Viktigare, föreslår figur 5 och figur 6 att en enkel 3D kultur, med minskad tillväxtfaktorer, är kapabel att generera aggregat med komplexa strukturer relaterade till hjärnans utveckling som tidig neuroepithelium och rhombic läpp.
2D produkter uppvisar cerebellär markörer och funktionella neuronala aktiviteten Medan 2D kulturer inte kan återge komplexa 3D-strukturer, är de kan generera celler uppvisar tidiga neurala och neuronala markörer, inklusive cerebellär granule cellen markör ZIC1, indikerat av ICC färgning i figur 7. Gen uttryck analys via RT-PCR, stöder som kan ses i figur 8, ICC färgning resultat, även om förekomsten av tidiga granule cellen markör ATOH1 är variabel mellan experiment och linjer. Kalcium imaging hanteras lättare i 2D kultur. Som ses i figur 9, kompletterande Video 1och kompletterande Video 2, visar elektriskt stimuleras cellerna kalcium tillströmningar som är typiska för neuronal bränning mönster, vilket tyder på generation av funktionella nervceller.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg"> Figur 1: tidslinje av differentiering-protokollet (börjar på dag 0 differentiering). Heldragen linje rutorna ange när specifika faktorer läggs till odlingsmediet och prickad linje rutorna ange plattan-beläggning för valfritt 2D modifiering. För FGF2, nedpilen refererar till lägre koncentrationer (4 ng/mL) och uppåtpilen refererar till högre koncentrationer (20 ng/mL). Denna siffra har ändrats från Holmes och Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg"> Figur 2: representant brightfield bilder av 3D protokollet. hESC kolonier på d0, EBs på d2, aggregat efter induktion på d14, mängder av olika storlek och morfologi (numrerade 1-5) på d28, en enda aggregat med unika, identifierbara funktioner (anges med bokstäver en–c) på d28, och synliga förändringar i samma funktioner på d35. Skalstapeln = 100 µm. Denna siffra har ändrats från Holmes och Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg"> Figur 3: representant brightfield bilder i 2D protokoll. hESC kolonier en d0, EBs på d2, aggregerar efter induktion på d13, efter plätering aggregat på d14, efter mognad på d35 sedda på 5 x förstoring, och 20 x förstoring. Den vita cirkeln i den övre vänstra panelen visar området av differentierade celler bland hESC kolonier. Skalstapeln = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg"> Figur 4: Brightfield bilder visar varierande storlek och komplexitet i 3D kultur. Mängder vid (A) dag 8 (hESCs) och (B) d35 (hiPSCs). Den sistnämnda bilden består av tre separata bilder att visa hela samlade. Båda aggregaten kan ha påverkats genom en sammanslagning av mindre aggregat eller förlust (avbryter) strukturer. Skalstapeln = 200 µm. Denna siffra publiceras från Holmes och Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg"> Figur 5: ICC bilder av 3D produkter visar relevanta markörer och strukturer. På kultur d35, 3D produkter utställning: PAX6 (grön) och TBR2 (röd) av lumen av neurala rosett-liknande formation (första raden); DCX (grön) och NeuN (röd) sprider sig från yttre kanten ventrikulära zon (VZ)-gilla strukturerar (andra raden); KIRREL2, en markör som är associerad med cerebellär neuroepithelium (tredje raden, vänster); och ZIC1 en markör är associerad med cerebellär granule celler (tredje raden, höger). Experimentet genomfördes flera gånger med fyra olika hPSC rader: hESC linje H01 (n = 5), och iPSC linjerna hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), och hvs51 (n = 1). Pilarna pekar på Rhombic lip (RL)-liknande struktur. Skalstapeln = 100 µm. Denna siffra publiceras från Holmes och Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg"> Figur 6: storskaliga ventrikulära zon-liknande struktur i 3D produkt. På kultur d35 är ett hESC-derived aggregat positivt för PAX6 (grön) och TBR2 (röd) vanligen förknippas med tidig nervceller finns inom ventrikulära zoner (VZs) och subventrikulära (SVZs), in vivo. (Överst) En asterisk (*) markerar den apikala sidan av en VZ-liknande regionen kör längs kanten av aggregatet, med parenteser som anger djup/avdelningen för VZ / SVZs. (mitten) sammanfogad signaler Visa spridda delar av PAX6 +/ TBR2-cellerna ökar i storlek mot den övre högra änden av VZ. (Botten) Högre förstoring bild av avsnittet anges av en rektangel i panelen mellersta. Skalstapeln = 100 µm. Denna siffra har ändrats från Holmes och Heine10. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg"> Figur 7: ICC bilder av 2D produkter visar relevanta markörer. På kultur d35, 2D produkter utställning, från hESCs (översta raden) och hiPSCs (nedersta raden), celler positivt för: granule cellen markör ZIC1 och flyttande cerebellär neuron markör TAG1 (vänster kolumn); och neuronala markör neurofilament (NF) och TAG1 (högra kolumnen). Skalstapeln = 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg"> Figur 8: RT-PCR av 2D produkter. mRNA uttryck analys av hESC linje H01 (översta raden) och hiPSC fodrar hvs60 (nedersta raden) i slutet av 2D protokollet visar produkter med gelelektrofores för: granule cellen markör ZIC1, granule cellen markör ATOH1, flyttande cerebellär neuron markör TAG1, Purkinje cell markör Calbindin (CALB), spänningsberoende kalcium kanal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), gamma - aminosmörsyra (GABA) B receptor 1 (G-Br1), och städning gen EIF4G2).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg"> Figur 9: kalcium imaging/analys av 2D produkter. På kultur d35 registrerades hPSC differentiering produkter i 2 min under mikroskopet, efter inkubation med fluor5 färg. 30 s, celler stimuleras elektriskt för 10 s vid 10 Hz. (A) stillbilder Visa hESCs vid 0 s (vänster) och efter starten av elektrisk stimulering 30 s (höger). Pilarna anger regionen av intresse (ROI) för analys av kalcium tillströmning. (B) grafiska analysen visar förändring i relativ fluorescens kontra tid för ROI (förändring av fluorescens = (F-F0) f0, där F0 = (∑F1-n) / n), med neuron-liknande spikar som inträffar före, under och efter stimulering. Svart stapel anger längden på elektrisk stimulering. Skala bar (vit) = 50 µm. fullständig registrering för hESC (som kan ses här) och en hiPSC linje (visas inte) är tillgängliga i kompletterande Video 1 och kompletterande Video 2, respektive. Inspelningarna är i AVI-format, 4 x hastighet. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande Video 1: kalcium imaging video av 2D produkt från hESC linje H01. På kultur d35 färga differentiering produkter från hESC linje H01 spelades i 2 min under mikroskopet, efter inkubation med fluor5. 30 s, celler stimuleras elektriskt för 10 s vid 10 Hz. inspelningar har gjorts på 2 bildrutor/s, och bearbetas till AVI video på ~ 7 bildrutor/s, producera en video som varar ~ 30 s, ~ 4 x hastighet. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande Video 2: kalcium imaging video av 2D produkt från hiPSC line hvs51. På kultur d35 registrerades differentiering produkter från hiPSC line hvs51 för 2 min under mikroskopet, efter inkubation med fluor5 färg. 30 s, celler stimuleras elektriskt för 10 s vid 10 Hz. inspelningar har gjorts på 2 bildrutor/s, och bearbetas till AVI video på ~ 7 bildrutor/s, producera en video som varar ~ 30 s, ~ 4 x hastighet. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification at JoVE.com

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Vi beskriver ett förenklat 3D differentiering protokoll för hPSCs, med hjälp av definierade medium och minskade tillväxtfaktorer, kan generera cell aggregat med tidig neuroepithelial strukturer och positivt för cerebellär-associerade markörer, samt en valfri 2D modifiering för att skilja celler som en enskiktslager att generera funktionella nervceller.

Strömlinjeformad 3D cerebellär differentiering protokoll med valfritt 2D modifiering

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D Organotypic Co-kultur Modell Stöd Medullary Thymic epitelcellproliferation, differentiering och promiskuös Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Ex vivo Kultur av Chick Cerebellar skivor och rumsligt riktade elektroporering av Granulat cellprekursorer

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Protokoll för differentieringen av humant inducerade plöripotenta stamceller i blandade kulturer av neuroner och Glia för neurotoxicitetstestning

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tredimensionell Rendering och analys av Immunolabeled, klargöras mänskliga placenta villösa vaskulär nätverk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

CRISPR-medierad förlust av funktion analys i lillhjärnan Granule celler med hjälp av In Utero elektroporation-baserade genöverföring

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a NaÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¯ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Kemiska återgång av konventionella mänskliga pluripotenta stamceller till en naiv-liknande tillstånd med förbättrad Multilinjärt differentiering potens

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptic resonanskrets modellering med 3D Cocultures av astrocyter och nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Övergående behandling av humana pluripotenta stamceller med DMSO för att främja differentiering

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...