Name: application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Vi takker Alina El-Khalili og Martina Hajduskova for teknisk bistand. Vi takker medlemmerne af gruppen Tursun for kommentarer på manuskriptet. Dette arbejde blev sponsoreret af ERC-StG-2014-637530 og ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 og understøttes af Max Delbrueck Center for Molekylær medicin i Helmholtz Association.

Alle metoder, der beskrives her med hensyn til pasning af dyr er blevet godkendt af LaGeSo Berlin, Tyskland
1. løsning forberedelse
<ol>
	<li>NGM-Agar plader (1 L)
	<ol>
		<li>Tilsæt 3 g NaCl, 2,5 g af pepton medier (fx Bacto-pepton) og 20 g af agar. Efter autoklavering, tilsættes 1 mL af kolesterol (5 mg/mL i 95% EtOH lager), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4og 1 mL af amphotericin B (2,5 mg/mL bestand).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM-Agar RNAi plader (1 L)
	<ol>
		<li>Tilsæt 3 g NaCl, 2,5 g af pepton medier og 20 g af agar. Efter autoklavering tilsættes, 1 mL kolesterol (5 mg/mL i 95% EtOH lager), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4, 1 mL af amphotericin B (2,5 mg/mL lager), 1 mL 1 M IPTG , og 1 mL carbenicillin (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>Der tilsættes 10 g af pepton medier, 5 g gær extract, 5 g NaCl, 20 g agar, 10 mL 1 M Tris pH 8,0. Tilføje H2O til 1 L. Efter autoklavering, tilsættes 1 mL 50 mg/mL carbenicillin og 2,5 mL af 5 mg/mL tetracyclin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB Medium (1 L)
	<ol>
		<li>Tilsættes 10 g af pepton medier, 5 g gær extract, NaCl. 5 g, og 10 mL 1 M Tris pH 8,0. Tilføje H2O til 1 L. Efter autoklavering, der tilsættes 1 mL 50 mg/mL carbenicillin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-buffer (1 L)
	<ol>
		<li>Tilføj 6,0 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl og 50 mg af gelatine. Før brug, tilsættes 1 mL 1 M MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blegning løsning (10 mL)
	<ol>
		<li>Der tilsættes 1 mL af NaClO og 2 mL 5 N NaOH. Tilføje H2O til 10 mL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. forberedelse af RNAi plader
Bemærk: C. elegans er typisk kulturperler i laboratoriet på 6 cm Petri plader der indeholder 7,5 mL af fyrretræsnematoden vækst Medium Agar (NGM-Agar)10,11. Denne protokol er optimeret til orme holdt på 15 ° C. For at forberede plader med NGM, skal du bruge standard sterile teknikker til at forhindre svampe og bakteriel forurening. Følgende er protokol til at forberede NGM plader suppleres med reagenser for RNAi.
<ol>
	<li>Forbered 6-cm NGM-Agar RNAi plader der indeholder 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og 50 µg/mL carbenicillin. Lad dem tørre i 24 – 48 timer ved stuetemperatur i den mørke12.
	<ol>
		<li>Holde RNAi plader ved 4 ° C i mørke. Brug ikke hvis ældre end 14 dage.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vælg RNAi bakterier (Escherichia coli HT115) klonen indeholdende L4440 plasmid med lin-53 gen DNA sekvens fra det frosne glycerol materiel fra tilgængelige RNAi bibliotek13 på LB-agar plader der indeholder 50 µg/mL carbenicillin og 12,5 µg/mL tetracyclin ved hjælp af tre-faset striber mønster. Vokse bakterier ved 37 ° C natten over12. Denne klon giver mulighed for IPTG-afhængige produktion af lin-53 dsRNA i bakterier.
	<ol>
		<li>Derudover vokse RNAi bakterier, der indeholder L4440 plasmid uden nogen gensekvens som tomme vektor kontrol14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Den næste dag, vælge en enkelt koloni fra lin-53 eller tomme vektor LB-agar plader ved hjælp af en 200 µL pipette tip og podes hver af dem ind i en separat kultur rør indeholdende 2 mL flydende LB medium14 suppleret med 50 µg/mL carbenicillin. Vokse kulturer natten over ved 37 ° C indtil de når en optisk densitet (OD) på 600 nm på 0,6-0,8. Måling af OD ved hjælp af et spektrofotometer15. Forsigtig: Flydende LB medierne bør ikke indeholde tetracyclin i modsætning til LB-agar plade anvendes til striber bakterier fra glycerol lager, da optagelse af tetracyklin under fodring fører til en nedsat RNAi effektivitet 12</li>
	<li>Tilføje 500 µL af hver bakteriekulturen (lin-53 eller tomme vektor) til 6 cm NGM-Agar RNAi plader ved hjælp af en multipipette. Inkuber plader med en lukket låget natten over ved stuetemperatur i mørke til tørre. I løbet af denne tid, vil IPTG i NGM plader fremkalde produktion af dsRNA i bakterier.
	<ol>
		<li>Brug mindst 3 plader pr. bakteriekulturen pr. eksperiment. Dette vil give 3 tekniske replikerer til hvert eksperiment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Store tørrede NGM-agar RNAi plader med bakterier ved 4 ° C i mørke i op til to uger.</li>
</ol>
3. forberedelse af C. elegans stamme BAT28
<ol>
	<li>Opretholde orm stammen BAT288 indeholdende transgener otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] og ntIs1 [gcy-5prom::gfp] om OP50 bakterier bruger standard NGM-Agar plader på 15 ° C. Bemærk: For detaljeret protokol på ødelægge kultur, se10. Rol-6(su1006) er en dominerende allel og almindeligt anvendt fænotypiske injektion markør16 der forårsager den typiske rullende bevægelse. Det bruges i otIs305 transgen til at spore hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Holde BAT28 stammen ved 15 ° C på alle tidspunkter for at forhindre vaccinen aktivering af den hsp-16.2prom::che-1 transgenet. Reducere eksponeringen for temperaturer højere end 15 ° C under håndtering stamme så meget som muligt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alder-synkroniserer orme, brug blegning teknik17.
	<ol>
		<li>Vaske af 6 cm NGM-Agar plader der indeholder voksne og æg af BAT28 med 900 µL M9 buffer. Pellet orme ved centrifugering ved 900 x g i 1 min. Fjern supernatanten.</li>
		<li>Tilsæt 0,5-1 mL af blegning løsning og ryst tube for ca. 1 min. indtil voksne orme begynder at briste åbne. Skærm ved hjælp af en standard stereomikroskopet.</li>
		<li>Pellet orme ved centrifugering ved 900 x g i 1 min. Fjern supernatanten.</li>
		<li>Vask orm pellet 3 gange ved at tilføje 800 µL af M9 buffer og centrifugering på 900 x g.</li>
		<li>Placer de rensede æg på frisk NGM-plader med OP50 bakterier. Vokse en bleget befolkning på OP50 bakterier ved 15 ° C, indtil de når L4 fase (ca. 4 dage). L4 larver kan genkendes på en hvid plet ca halvvejs langs den ventrale side af ormen18 ved hjælp af en standard stereomikroskopet. Bemærk: For at opnå kimcelle til neuron konvertering fænotype ved nedbrydningen af lin-53, det skal være udtømt i forældrenes generation (P0).</li></ol></li></ol>Scoring for konvertering fænotype er foretaget i den følgende generation (filial generation F1). For at opnå de nedbryder lin-53 allerede i P0, underkastes L4 dyr RNAi.
	
	
	<li>Manuelt overføre 50 L4-fase orme pr. replikat ved hjælp af en platin ledning til en NGM plade der ikke indeholder nogen bakterier og lad orme bevæge sig væk fra eventuelle overførte OP50 bakterier. Lad orme flytte på pladen i ca 5 minutter. Brug bakterier fra NGM-Agar RNAi plader seedede tidligere med lin-53 RNAi bakterier (eller tomme vektor kontrol) til at overføre til de respektive RNAi-plader.
	<ol>
		<li>Undgå at overføre OP50 bakterier til de faktiske RNAi-plader. Arbejde hurtigt for at minimere eksponeringstiden pres for temperaturer højere end 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkuber orme på NGM-Agar RNAi plader ved 15 ° C i ca. 7 dage indtil F1 afkom af ormene når L3-L4 fase. De kan klart adskilt fra P0 dyr, da de er større og tykkere end F1-afkom.
	<ol>
		<li>Visuelt kontrollere under en standard stereomikroskopet om F1 afkom orme Vis fremspringende vulva (pvul) fænotype som vist i figur 1. RNAi mod lin-53 har pleiotrope virkninger og forårsager pvul fænotype, som kan bruges til at vurdere, om RNAi mod lin-53 har været vellykket. Bemærk: RNAi mod lin-53 kan også forårsage dødelighed af F1 embryoner. Denne effekt stiger hvis pladerne udsættes for højere grader end 15 ° C før dyr nåede L3-L4 fase. Døde embryoner kan genkendes af anholdte udvikling og manglende rugeæg.</li>
		<li>Inkuber plader i mørke, da IPTG er lysfølsomt.</li>
	</ol>
	</li>

4. induktion af kønscelle omprogrammering
<ol>
	<li>Inkuber undersøgt RNAi plader der indeholder lin-53 og tømme vektor RNAi-behandlede F1 afkom i 30 minutter ved 37 ° C i mørke til at aktivere CHE-1. Bruge et udluftet inkubator, da det giver mulighed for en mere effektiv varme-shock.</li>
	<li>Tillad varme-chokeret dyr til at inddrive i 30 min. ved stuetemperatur i mørke og derefter inkuberes plader ved 25 ° C natten over i mørke.</li>
	<li>Ved hjælp af en standard stereomikroskopet koblet til et fluorescens lyskilde, undersøge dyrene under normal god landbrugspraksis filter til gcy-5prom::gfp-afledt signaler i området midt kroppen af orme, som vist i figur 2. Sæt mikroskop for normal god landbrugspraksis signaler: excitation maksimale på 488 nm med emission maksimum ved 509 nm.</li>
	<li>Vurdere graden af kønsceller til neuron konvertering af montering dyr med normal god landbrugspraksis signaler i området midt kroppen på agar pad-holdige mikroskopi dias19.
	<ol>
		<li>Tæl antallet af dyr, der viser kimcelle til neuron konvertering vs de mørke dyr at vurdere fænotype penetrans. Typisk, omkring 30% af dyrene Vis diskrete normal god landbrugspraksis signaler i kønscelleoverførsel på lin-53 udtynding, ikke mere end 5% af dyr, viser diffuse normal god landbrugspraksis signaler i kønscelleoverførsel ved Tom vektor RNAi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li><li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+barriers+and+enhancers:+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency.">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li><li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-Dependent+Heterochromatin:+Barrier+to+Cell+Fate+Changes.">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li><li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types.">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li><li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types.">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li><li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron.">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653 (2007).</li><li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li><li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons.">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity.">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100 (2017).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenorhabditis+Elegans.">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).</li><li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li><li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein.">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li><li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm.">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li><li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++.">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+biology.">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li></ol>

Forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesser findes.

Mens den beskrevne protokol bruger den transgene C. elegans stamme BAT28 og RNAi mod lin-53 er ligetil, en række skridt er afgørende for at sikre det forventede resultat af kønsceller til neuron omprogrammering. Det er vigtigt at stamme BAT28 holdes ved 15 ° C på alle tidspunkter forud for forsøgene. Under håndtering og vedligeholdelse af stammen skal tid ved temperaturer over 15 ° C minimeres så meget som muligt. Ordentlig heat-shock betingelser er vigtige, da utilstrækkelige induktion af che-1 overekspression ikke vil resultere i kimcelle til ASE neuron konvertering. Dette kan påvises ved at måle fænotype penetrans, som beskrevet i protokollen. Omfattende heat-shock kan føre til dødelighed af dyrene. For eksempel, opleve plader, der er anbragt i nærheden af den indvendige vægge eller på bunden jorden af en statisk luft inkubator ofte omfattende varmebehandling. Det anbefales derfor, at bruge en ventileret varme inkubator. Derudover er timing af heat-shock induktion kritiske siden overdrevne udtryk af che-1 larve stadier tidligere derefter L3 kan føre til ektopisk gcy-5prom::gfp induktion i forskellige kroppen regioner såsom vulva (figur 3) 9. Endvidere omfattende heat-shock kan påvises ved fænotype penetrans i tomme vektor RNAi dyr, som ikke bør udvide 5% og øget auto-fluorescens i andre væv, nemlig i tarmen.
Sporadisk, kan RNAi bakterier miste deres aktivitet for at effektivt producere dsRNA af target-genet. Desværre kan dette ikke være registreret forud for RNAi eksperiment. I sådanne tilfælde bør en frisk streak fra glycerol dyrkes som beskrevet i afsnit 2 i protokollen. Hvis der er stadig ingen RNAi-forårsaget pleiotrope fænotype synlige såsom pvul fænotype forårsaget af vellykket RNAi mod lin-53, derefter et plasmid DNA isoleret fra de respektive bakterier skal udføres og friske HT115 bakterier skal være transformeret med det L4400 plasmid som indeholder lin-53 sekvens.
Vigtigere er, BAT28 stammen har en rulle fænotype forårsaget af injektion markør pRF4, som blev brugt under transgenese af dyr med den hsp-16.2prom::che-1 DNA konstruktion. Lejlighedsvis, dyr mister den rullende fænotype, hvilket kan indikere hæmning af den hsp-16.2prom::che-1 transgenet. For at ordentligt vedligeholde BAT28 stammen, vælge 10 roller dyr til en frisk plade og udbrede valg for rullende dyr.
Protokollens anvendelse er begrænset til F1 RNAi-proceduren, hvilket betyder, at dyr hvis forældre (P0 generation) ikke har været udsat for lin-53 RNAi ikke vil vise kimcelle til neuron konvertering på grund af moderens rescue4. Alternativ procedure at konvertere kønsceller til neuroner er blevet beskrevet af Ciosk og kolleger15 ved hjælp af RNAi knock-down af gld-1 og mex-3 uden overdrevne udtryk for en transkriptionsfaktor. Men de opnåede neuroner tilhører ikke en bestemt type af neuroner og kimceller også konvertere til muskel-lignende celler ved RNAi-medieret nedbrydning af gld-1 og mex-315. Tidligere, det er blevet påvist RNAi mod lin-53 tilladt kønscelle omdannelse til GABAergic neuron-lignende celler ved overdrevne udtryk for Pitx-type homoedomain transskription faktor UNC-3016 i stedet for CHE-14 . For fremtidige retninger, kan anderledes skæbne-inducerende transskription faktorer kan testes om lin-53 forarmet kønsceller konverteres til andre celletyper end specifikke neuroner. I denne forbindelse inducerer overekspression af myogenic bHLH transskription faktor HLH-1, homolog af den mammale MyoD17, konvertering af kønsceller til musklerne på lin-53 RNAi5. Den etablerede omprogrammering af kønsceller til en bestemt somatisk celletype på lin-53 RNAi og overdrevne udtryk for en passende skæbne-inducerende transskription faktor kan bruges til en række forskellige genetiske skærme. Sådanne suppressor eller forstærker skærme kan hjælpe dissekere regulerende veje, der spiller en rolle i celle skæbne konvertering.

Celle skæbne omprogrammering af ektopiske TF udtryk såsom den myogenic TF MyoD, som når overexpressed, konverterer fibroblaster direkte ind i muskel-lignende celler1, har været et forskningsfokus i årtier. Differentierede celler er dog ofte refraktære over for denne proces, som følge af mekanismer, der sikrer deres cellulære identitet. Kønsceller viser en tilsvarende grad af beskyttelse og der er underliggende mekanismer, der ofte fungerer som en barriere til at forhindre kønscelle omregning til andre celletyper ved overdrevne udtryk af en skæbne-inducerende TF. Typisk, epigenetisk regulering som Histon ændringer og kromatin struktur pålægger en hindring for konverteringen af celle skæbner2,3. Vi har tidligere anvendt omvendt genetik ved hjælp af RNAi knock-downs i C. elegans og identificerede faktorer, der beskytte cellulære identiteter og derved modvirke omprogrammering af kønsceller til neuroner4. Specifikt, polycomb repressive komplekse 2 (PRC2) og meget velbevarede Histon anstandsdame LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 hos mennesker) forhindre den direkte omdannelse af kønsceller til specifikke somatiske celletyper såsom glutamatergic smag neuroner i C. elegans 4 , 5. for at identificere disse kønscelle omprogrammering barriere faktorer, vi brugte transgene dyr transporterer heat-shock inducerbar Zn-finger TF CHE-1. CHE-1 udtrykkes normalt i to hoved neuroner af C. elegans, hvor den angiver skæbnen af glutamatergic smag neuroner kaldes ASE6. ASE neuron skæbne kan visualiseres ved ekspression af ASE-specifikke fluorescerende reporter gcy-5prom::gfp. GCY-5 er en chemoreceptor kun udtrykt i ASE rigtige neuron7. Lin-53 udtynding af RNAi og induktion af brede Ektopisk udtryk for CHE-1 ved heat-shock, kan kønsceller konverteres til neuroner i vivo4,5. Vigtigere, er timing af RNAi behandling afgørende som kun voksne orme (P0 generation) udsat for lin-53 RNAi give anledning til F1 afkom dyr med en genom, som er eftergivende for omprogrammering i neuroner4.
Den ovenfor beskrevne kimcelle til neuron omregningsproceduren i C. elegans kan bruges til at studere en bred vifte af biologiske spørgsmål såsom konsekvenserne af signalering veje i celle skæbne omprogrammering. For eksempel, brugte vi den CHE-1-induceret kønscelle omprogrammering til ASE neuroner ved RNAi mod lin-53 for at studere konsekvenserne af Notch signalering pathway ved at kønscelle omprogrammering8. Ved at udføre dobbelt RNAi for at co nedbryder lin-53 og Histon demethylase-kodning gen utx-1 vi viste, at Notch signalering pathway modvirker PRC2-medieret genhæmning ved at aktivere udtryk for UTX-1 i genom8 . Dette resultat viser, at kønscelle konvertering til neuroner i denne protokol beskrevne kunne bruges til at studere et komplekst biologisk proces såsom cellulære omprogrammering i en intakt organisme og i forbindelse med forskellige udviklings- og miljømæssige betingelser. Derudover, det giver perspektiv til at udfordre kønsceller over udtrykke forskellige skæbne-inducerende TFs at studere deres rolle i begrænsning af cellulære plasticitet9eller vurdere deres potentiale for at fremkalde omprogrammering af kønsceller til andre celler typer in vivo.
Mens pattedyr vævskulturer giver også mulighed for at studere forskellige aspekter af celle skæbne omprogrammering, har celler dyrkes i kultur begrænset kapacitet til at efterligne signaling pathway vilkår i forhold til en intakt organisme. C. elegans er derfor en alsidig model for undersøgelse af rollerne som forskellige biologiske processer såsom Notch signalering under omprogrammering i vivo. Desuden er det en kraftfuld model for genetiske skærme, der er relativt nemme at vedligeholde og genetisk ændre til lave omkostninger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone&#160;</td>
			<td>A. Hartenstein GmbH</td>
			<td>211 677</td>
			<td>Peptone Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1552,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck Biosciences</td>
			<td>208290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8866.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4275.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T875.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25,163,364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (5 N)</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>KK71.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>634412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2371.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick Scientific C24</td>
			<td>M1247-0052</td>
			<td>for heat-shock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>Sanyo MIR-5</td>
			<td>5534210</td>
			<td>for maintenance of worm strains at 15 &#176;C or 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Sensicam</td>
			<td>PCO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 
			promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse 
			III minus).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uracil auxotroph E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 
			3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lin-53</td>
			<td>SourceBioscience</td>
			<td>ID I-4D14</td>
			<td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>empty vetor: L4440</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>#1654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

At studere cellen biologiske processer under konvertering identiteter af specifikke celletyper giver vigtig indsigt i mekanisme, at bevare og beskytte cellulære identiteter. Omdannelse af kønsceller til specifikke neuroner i den nematodeprøveudtagning Caenorhabditis elegans (C. elegans) er et kraftfuldt værktøj til at udføre genetiske skærme for at dissekere regulerende veje, der sikrer etablerede celle identiteter. Omprogrammering af kønsceller til en bestemt type af neuroner kaldes ASE kræver transgene dyr, der giver mulighed for bred over udtryk for Zn-finger transskription faktor (TF) CHE-1. Endogene CHE-1 udtrykkes udelukkende i to hoved neuroner og er forpligtet til at angive glutamatergic ASE neuroner skæbne, som nemt kan visualiseres ved gcy-5prom::gfp -reporter. En trans gen indeholdende heat-shock promotor-drevet che-1 gen expression konstruktion giver mulighed for bred mis udtryk af CHE-1 i hele dyret på heat-shock behandling. Kombination af RNAi mod kromatin-regulerende faktor LIN-53 og heat-shock-induceret che-1 over udtryk fører til omprogrammering af kønsceller til ASE neuron-lignende celler. Vi beskriver her særlig RNAi procedure og passende betingelser for heat-shock behandling af transgene dyr for at kunne fremkalde kimcelle til neuron konvertering.

Som vist i figur 1, illustrere F1 dyr, der udviser pvul fænotype vellykket anvendelse af lin-53 RNAi. Disse dyr er tilbøjelige til at tillade konvertering af deres kønsceller i ASE neuron-lignende celler ved heat-shock induktion af che-1 over udtryk, som illustreret i figur 2. I modsætning til orme, der voksede på kontrolelementet Tom vektor RNAi lin-53 RNAi behandling vil give dyr, der viser ektopisk normal god landbrugspraksis-signaler i midten brødtekstområdet efter heat-shock og 25 ° C inkubering natten som beskrevet tidligere4, 8. nærmere undersøgelse under et epifluorescensmikroskop af disse orme afslører, at cellerne viser normal god landbrugspraksis signaler også vise neuron-lignende fremskrivninger (figur 2B, hvide pile), der er typiske for neuronale celler. Hvis RNAi mod lin-53 var ikke vellykket eller heat-shock betingelser var upassende vil normal god landbrugspraksis signaler ligne dem i kontrol RNAi behandlede dyr (figur 2). Undgå vigtigere, inducerende overdrevne udtryk af che-1 ved varme induktion, før dyrene når frem til midten af L3 fase. Dyr, der var alt for ung på tidspunktet af che-1 overekspression induktion kan vise ektopisk gcy-5prom::gfp udtryk i andre områder af kroppen, såsom udvikle vulva, som vist i figur 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Figur 1: Pvul fænotype forårsaget af RNAi mod lin-53. (Top) DIC billede af L4/young adult scene F1 afkom orme afledt af kontrol eller lin-53 RNAi behandlet mødre. Skalere barer = 20 µm. (nederst) dyr behandlet med lin-53 RNAi display den fremspringende vulva (pvul) fænotype (sort pilespidser). Pvul fænotype bekræfter, at RNAi mod lin-53 var vellykket. Skalere barer = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Figur 2: Orme med succes omprogrammerede kimcelle til neuroner. (A) BAT28 stamme dyr dyrkes på de tomme vektor ikke viser normal god landbrugspraksis signaler i germline efter heat-shock induktion af che-1 overekspression. Stiplet hvid linje konturer orm. Skalere barer = 20 µm. (B) i modsætning til BAT28 stamme dyr dyrkes på tomme vektor kontrol RNAi dyr dyrkes på lin-53 RNAi display gcy-5prom::gfp signaler i området midt krop. Billeder af afsnittet midten krop med normal god landbrugspraksis signaler træffes på 63 X forstørrelse afsløre normal god landbrugspraksis-positive celler viser fremspring (hvid pilespidser). Denne morfologiske træk angiver, at kønsceller undergik omdannelse til ASE neuron-lignende celler. Hvide stjerner markerer tarmen-afledte auto-fluorescens. Alle billeder blev opnået ved hjælp af et epifluorescensmikroskop med 20 X Forstørrelse og 63 X forstørrelse. Stiplet hvid linje skitserer orme. Skalere barer = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Figur 3: Tidlige fase orm med ektopisk NGL. BAT28 stamme dyr dyrkes på de tomme vektor RNAi bakterier, der var varme-shock induceret for che-1 overekspression på larve vorden som L2 viser normal god landbrugspraksis signaler i området midt krop (hvide stjerner). Disse signaler er ikke på grund af kønscelle omprogrammering. Stiplet hvid linje konturer orm. Skalere barer = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret transskription faktor udtryk til at omprogrammere kønsceller til neuroner i C. elegans

Denne protokol beskriver hvordan man studerer cellulære processer under celle skæbne konvertering i Caenorhabditis elegans in vivo. Ved hjælp af transgene dyr, så heat-shock promotor-drevet overekspression af neuron skæbne-inducerende transskription faktor CHE-1 og RNAi-medieret nedbrydning af den kromatin-regulerende faktor LIN-53 kimcelle til neuron omprogrammering kan observeres i vivo.

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Anvendelse af impermeable barrierer Kombineret med Candidate Factor Soaked Perler til at studere Induktive Signaler i Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumlig og tidsmæssig analyse af Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; Kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Vurdering cardiomyocyte undertyper Efter Transcription Factor-medieret Omprogrammering af Mouse Embryonale fibroblaster

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardiseret tilgang til multispecies Rensning af mammale mannlige germeller ved hjælp af mekanisk vævsdissociation og flowcytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

C. elegans Excretory kanalen som en Model for intracellulære Lumen morfogenese og In Vivo polariseret membran Biogenese i en enkelt celle: mærkning af normal god landbrugspraksis-fusioner, RNAi interaktion skærm og billedbehandling

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering af Caenorhabditis elegans at analysere intracellulær Transport i neuroner

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hemogen endothelium differentiering fra humane pluripotente stamceller i en feeder-og Xeno-fri defineret tilstand

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering af oxidative skader i den primære mus okulære overfladeceller / stamceller som reaktion på Ultraviolet-C (UV-C) Skader

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...