Name: application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Wij danken Alina El-Khalili en Martina Hajduskova voor technische bijstand. Wij danken de leden van de groep van de Tursun voor commentaar op het manuscript. Dit werk werd gesponsord door de ERC-StG-2014-637530 en ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 en wordt ondersteund door de Max Delbrueck-Center for Molecular Medicine in de Helmholtz-vereniging.

Alle methoden die hier worden beschreven met betrekking tot de verzorging van de dieren zijn goedgekeurd door de LaGeSo Berlijn, Duitsland
1. oplossing voorbereiding
<ol>
	<li>NGM-Agar platen (1 L)
	<ol>
		<li>3 g NaCl, 2,5 g pepton media (bijvoorbeeld Bacto-pepton) en 20 gram agar toevoegen. Na autoclaaf, voeg 1 mL van cholesterol (5 mg/mL 95% EtOH voorradig), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL van de 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4en 1 mL amfotericine B (2,5 mg/mL stockoplossing).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM-Agar RNAi platen (1 L)
	<ol>
		<li>Voeg 3 g NaCl, 2,5 g pepton media, en 20 gram agar. Na autoclaaf toevoegen, 1 mL van cholesterol (5 mg/mL 95% EtOH voorradig), 1 mL van de 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4, 1 mL amfotericine B (2,5 mg/mL stockoplossing), 1 mL van de 1 M IPTG , en carbenicillin van 1 mL (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>Voeg 10 g pepton media, 5 g gist extract, 5 g NaCl, 20 gram agar, 10 mL van de 1 M Tris pH 8.0. H2O toevoegen aan 1 L. Na autoclaaf, voeg 1 mL 50 mg/mL carbenicillin en 2,5 mL 5 mg/mL tetracycline.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB Medium (1 L)
	<ol>
		<li>Voeg 10 g pepton media, 5 g gist extract, 5 g NaCl, en 10 mL van de 1 M Tris pH 8.0. H2O toevoegen aan 1 L. Na autoclaaf, voeg 1 mL 50 mg/mL carbenicillin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-buffer (1 L)
	<ol>
		<li>6.0 nb2HPO4g, 3 g van KH2PO4, 5 g NaCl en 50 mg van gelatine toevoegen. Vóór gebruik, voeg 1 mL 1 M MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bleken oplossing (10 mL)
	<ol>
		<li>Voeg vervolgens 1 mL NaClO en 2 mL 5 N NaOH. H2O aan 10 mL toevoegen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. voorbereiding van RNAi platen
Opmerking: C. elegans is meestal gekweekt in het laboratorium op 6 cm Petri platen met 7,5 mL Nematode groei Medium Agar (NGM-Agar)10,11. Dit protocol is geoptimaliseerd voor wormen gehouden bij 15 ° C. Gebruiken om voor te bereiden platen met NGM, steriele standaardtechnieken om schimmel en bacteriële besmetting te voorkomen. Het volgende is het protocol bij het bereiden van NGM platen aangevuld met reagentia voor RNAi.
<ol>
	<li>6-cm NGM-Agar RNAi platen met 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en 50 µg Mo/mL carbenicillin voor te bereiden. Laat ze drogen gedurende 24 – 48 uur bij kamertemperatuur in de donkere12.
	<ol>
		<li>Houd RNAi platen bij 4 ° C in het donker. Gebruik geen als ouder dan 14 dagen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selecteer de RNAi bacteriën (Escherichia coli HT115) kloon met de L4440-plasmide met de lin-53 gensequentie DNA uit de bevroren glycerol voorraad van de beschikbare RNAi bibliotheek13 op LB-agar platen met 50 µg/mL carbenicillin en 12,5 µg Mo/mL tetracycline met behulp van het strepen patroon van drie-fase. Groeien de bacteriën bij 37 ° C's nachts12. Deze kloon kan IPTG-afhankelijke productie van lin-53 dsRNA in de bacteriën.
	<ol>
		<li>Bovendien groeien RNAi bacteriën die het plasmide L4440 zonder een gensequentie als de lege vector controle14bevatten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>De volgende dag, kies een één kolonie van lin-53 of lege vector LB-agar platen met behulp van een precisiepipet 200 µL uiteinde en elk van hen worden geënt in een aparte cultuur buis met 2 mL vloeibare LB middellange14 aangevuld met 50 µg Mo/mL carbenicillin. Groeien culturen 's nachts bij 37 ° C tot ze een optische dichtheid (OD) op 600 nm van 0,6-0,8. Meten van het gebruik van een spectrofotometer15OD. Let op: De vloeibare LB-media mogen geen tetracycline in tegenstelling tot de LB-agarplaat gebruikt voor de strepen van de bacteriën uit de voorraad van glycerol, sinds de opname van tetracycline tijdens de voeding leidt tot een verminderde efficiëntie van RNAi 12</li>
	<li>Voeg 500 µL van elke bacteriecultuur (lin-53 of lege vector) aan 6 cm NGM-Agar RNAi platen met behulp van een multipipette. Incubeer de platen met een gesloten deksel 's nachts bij kamertemperatuur in het donker te drogen. Gedurende deze tijd, zal de IPTG in de platen NGM productie van dsRNA in de bacteriën veroorzaken.
	<ol>
		<li>Het gebruik van ten minste 3 platen per bacteriecultuur per experiment. Dit zorgt voor 3 technische repliceert voor elk experiment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Winkel gedroogd NGM-agar RNAi platen met bacteriën bij 4 ° C in het donker voor maximaal twee weken.</li>
</ol>
3. bereiding van C. elegans stam BAT28
<ol>
	<li>Handhaven van de stam van de worm BAT288 met de transgenen- otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] en ntIs1 [gcy-5prom::gfp] op OP50 bacteriën met behulp van standaard NGM-Agar platen bij 15 ° C. Opmerking: Zie voor gedetailleerde Protocolbetreffende Nematode cultuur,10. De rol-6(su1006) is een dominant allel en veelgebruikte fenotypische injectie marker16 , waardoor de typische rollende beweging. Het wordt gebruikt in de transgenic otIs305 voor het bijhouden van hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Houd de spanning van de BAT28 bij 15 ° C te allen tijde ter voorkoming van voorzorg activering van de hsp-16.2prom::che-1 transgenic. Verminderen blootstelling aan temperaturen boven de 15 ° C tijdens het verwerken van de stam zo veel mogelijk.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leeftijd-synchroniseren van wormen, gebruiken de bleken techniek17.
	<ol>
		<li>6 cm NGM-Agar platen met volwassenen en eieren van BAT28 met behulp van 900 µL M9 buffer afwassen. Pellet wormen door centrifugatie bij 900 x g gedurende 1 min. Verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>Voeg 0,5 – 1 mL oplossing bleken en schudden van de buis gedurende ongeveer 1 min. tot volwassen wormen beginnen te barsten open. Controleren met behulp van een standaard stereomicroscoop.</li>
		<li>Pellet wormen door centrifugatie bij 900 x g gedurende 1 min. Verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>De worm pellet 3 keer wassen door toevoeging van 800 µL van M9 buffer en bij 900 x g centrifugeren.</li>
		<li>Plaats de schoongemaakte eieren op verse NGM-platen met OP50 bacteriën agarvoedingsbodem. Groeien een gebleekte populatie van OP50 bacteriën bij 15 ° C tot ze L4 fase (ongeveer 4 dagen). L4 larven kunnen worden herkend door een witte vlek ongeveer halverwege langs de ventrale zijde van de worm18 met behulp van een standaard stereomicroscoop. Opmerking: Om de kiem naar neuron conversie fenotype bij uitputting van lin-53, moet het worden uitgeput in de ouderlijke generatie (P0).</li></ol></li></ol>Het scoren voor het fenotype van de conversie wordt uitgevoerd in de volgende generatie (kinderlijke generatie F1). Om te bereiken de afbreken lin-53 al in de P0, worden L4 dieren blootgesteld aan RNAi.
	
	
	<li>Handmatig overbrengen 50 L4 fase wormen per repliceren met behulp van een platina draad aan een NGM plaat die niet bevatten bacteriën en wormen afgestapt van enige overgebrachte OP50 bacteriën laat. Laat wormen verplaatsen op de plaat voor ongeveer 5 minuten. Gebruik bacteriën uit de platen NGM-Agar RNAi eerder bezaaid met lin-53 RNAi bacteriën (of lege vectorbestrijding) over te dragen aan de respectieve RNAi platen.
	<ol>
		<li>Vermijd OP50 bacteriën overbrengen naar de werkelijke RNAi platen. Werk snel te minimaliseren belichtingstijd van de stam aan temperaturen hoger dan 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incubeer wormen op NGM-Agar RNAi platen bij 15 ° C gedurende ongeveer 7 dagen tot F1 nakomelingen van de wormen L3-L4 stadium bereikt. Ze kunnen duidelijk gescheiden zijn van de P0 dieren omdat ze groter en dikker dan de nakomelingen van de F1.
	<ol>
		<li>Visueel controleren onder een standaard stereomicroscoop of F1 nakomelingen worms Toon het vooruitstekende fenotype van de vulva (pvul), zoals afgebeeld in Figuur 1. RNAi tegen lin-53 heeft een pleiotropic effect en zorgt ervoor dat het fenotype van de pvul die kan worden gebruikt om te beoordelen of RNAi tegen lin-53 succesvol is geweest. Opmerking: RNAi tegen lin-53 kan ook leiden tot letaliteit van F1 embryo's. Dit effect verhoogt als platen worden blootgesteld aan hogere graden dan 15 ° C voordat de dieren de L3-L4 stadium bereikt. Dode embryo's kunnen worden herkend door gearresteerd ontwikkeling en het ontbreken van broedeieren.</li>
		<li>Incubeer de platen in het donker want IPTG lichtgevoelig is.</li>
	</ol>
	</li>

4. de inductie van geslachtscellen herprogrammering
<ol>
	<li>Incubeer onderzocht RNAi platen met lin-53 en lege vector RNAi-behandelde F1 nakomelingen gedurende 30 minuten bij 37 ° C in het donker te activeren CHE-1. Gebruik een geventileerde incubator omdat het zorgt voor een meer efficiënte warmte-schok.</li>
	<li>Toestaan dat warmte-geschokt dieren herstellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker en dan platen bij 25 ° C's nachts in het donker uit te broeden.</li>
	<li>Met behulp van een standaard stereomicroscoop gekoppeld aan een lichtbron fluorescentie, het onderzoeken van dieren onder het GFP-filter voor gcy-5prom::gfp-afgeleid van signalen op het gebied van de mid lichaam van de wormen, zoals weergegeven in Figuur 2. Set Microscoop voor GFP signalen: excitatie maximaal bij 488 nm met maximale op 509 emissie nm.</li>
	<li>Evalueer de graad van geslachtscellen naar neuron conversie door montage dieren met GFP signalen in de mid lichaamszone op agar pad-bevattende microscopie dia's19.
	<ol>
		<li>Het aantal dieren met de kiem naar neuron conversie vs. de donkere dieren te beoordelen van de doordringendheid fenotype. Meestal Toon ongeveer 30% van de dieren discrete GFP-signalen in de kiemcellen bij lin-53 uitputting, terwijl niet meer dan 5% van de dieren in de kiemcellen op lege vector RNAi diffuus GFP-signalen weergeven.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li><li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+barriers+and+enhancers:+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency.">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li><li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-Dependent+Heterochromatin:+Barrier+to+Cell+Fate+Changes.">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li><li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types.">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li><li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types.">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li><li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron.">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653 (2007).</li><li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li><li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons.">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity.">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100 (2017).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenorhabditis+Elegans.">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).</li><li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li><li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein.">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li><li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm.">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li><li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++.">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+biology.">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li></ol>

De auteurs hebben verklaard dat geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Terwijl het beschreven protocol gebruikt de transgene C. elegans stam BAT28 en RNAi tegen lin-53 is eenvoudig, een aantal stappen zijn cruciaal om ervoor te zorgen het verwachte resultaat van geslachtscellen naar neuron herprogrammering. Het is belangrijk dat de stam BAT28 te allen tijde voorafgaand aan de experimenten bij 15 ° C wordt gehouden. Tijdens de behandeling en onderhoud van de stam, de tijd bij temperaturen boven de 15 ° C moet worden geminimaliseerd, zoveel mogelijk. Goede warmte-schok voorwaarden zijn belangrijk, omdat onvoldoende inductie van che-1 overexpressie niet in geslachtscellen naar ASE neuron conversie resulteren zal. Dit kan worden gedetecteerd door het meten van het fenotype doordringendheid, zoals beschreven in het protocol. Uitgebreide warmte-schok kan leiden tot letaliteit van de dieren. Bijvoorbeeld ervaren platen die zijn geplaatst in de buurt van de binnenmuren of op de grond van de onderkant van een statische lucht incubator vaak uitgebreide warmtebehandeling. Daarom is het aanbevolen om het gebruik van een incubator ontlucht warmte. Bovendien, is timing van de warmte-schok-inductie van cruciaal belang sinds overmatige uitdrukking van che-1 tijdens de larvale stadia eerder dan L3 tot ectopische gcy-5prom::gfp inductie in verschillende lichaam regio's zoals de vulva (Figuur 3 leiden kan) 9. Bovendien uitgebreide warmte-schok kan worden gedetecteerd door het fenotype doordringendheid in lege vector RNAi dieren die 5% en verhoogde auto-fluorescentie van andere weefsels, namelijk de darm niet moet uitbreiden.
Sporadisch, kunnen RNAi bacteriën verliezen hun activiteit om efficiënt produceren dsRNA van het target-gen. Helaas, dit kan niet worden gedetecteerd voorafgaand aan het RNAi-experiment. In dergelijke gevallen moet een frisse streep van de glycerol worden gekweekt, zoals beschreven in paragraaf 2 van het protocol. Als er nog geen RNAi veroorzaakte pleiotropic fenotype zichtbaar zoals het fenotype van de pvul veroorzaakt door succesvolle RNAi tegen lin-53, vervolgens een plasmide DNA los van de respectieve bacteriën moet worden uitgevoerd en moeten verse HT115 bacteriën getransformeerd met de plasmide van de L4400 met de volgorde van lin-53 .
Nog belangrijker is, de BAT28-stam heeft een het fenotype van de roller veroorzaakt door de injectie marker pRF4, dat werd gebruikt tijdens Transgenese van de dieren met de hsp-16.2prom::che-1 DNA construct. Af en toe, dieren verliezen de rollende fenotype, die op een monddood maken duiden kan van de hsp-16.2prom::che-1 transgenic. Te goed onderhouden van de BAT28-stam, kies 10 roller dieren aan een nieuwe plaat en propageren selecteren voor het rollen van de dieren.
De toepassing van het protocol is beperkt tot de F1 RNAi-procedure, die betekent dat dieren waarvan de ouders (P0 generatie) niet zijn blootgesteld aan de lin-53 RNAi geslachtscellen naar neuron conversie als gevolg van maternale rescue4niet wordt weergegeven. Een alternatieve procedure germinale cellen te converteren naar neuronen is beschreven door Ciosk en collega's15 met behulp van RNAi knock-down van gld-1 en mex-3 zonder overmatige uitdrukking van een transcriptiefactor. Echter de verkregen neuronen niet behoren tot een bepaald type van neuronen en geslachtscellen ook omzetten in spier-achtige cellen op RNAi-gemedieerde uitputting van gld-1 en mex-315. Eerder, is gebleken de RNAi tegen lin-53 toegestaan geslachtscellen omzetting in GABAergic neuron-achtige cellen bij overmatige expressie van het Pitx-type homoedomain transcriptiefactor UNC-3016 in plaats van CHE-14 . Voor toekomstige richtingen, kan verschillende lot-inducerende transcriptie factoren kunnen worden getest of lin-53 geslachtscellen uitgeput worden geconverteerd naar andere celtypes dan specifieke neuronen. In dit verband induceert overexpressie van de transcriptiefactor myogenic bHLH HLH-1, homolog van de zoogdieren MyoD17, conversie van geslachtscellen naar spieren bij lin-53 RNAi5. De gevestigde herprogrammering van geslachtscellen op een specifiek aantal somatische cellen type bij lin-53 RNAi en overmatige uitdrukking van een passende lot-inducerende transcriptiefactor kan worden gebruikt voor een aantal verschillende genetische schermen. Dergelijke schermen suppressor of versterker kunnen helpen ontrafeling van regelgevende trajecten die een rol tijdens de cel lot conversie spelen.

Cel lot herprogrammering door ectopische TF expressie zoals de myogenic TF MyoD, die wanneer overexpressie, bekeerlingen fibroblasten rechtstreeks in de spier-achtige cellen1, een onderzoek-focus voor decennia is geweest. Gedifferentieerde cellen zijn echter vaak vuurvaste aan dit proces, als gevolg van mechanismen die hun cellulaire identiteit waarborgen. Geslachtscellen Toon een vergelijkbare mate van bescherming en er zijn onderliggende mechanismen die vaak als een belemmering fungeren voor het voorkomen van geslachtscellen omzetting in andere celtypes bij overmatige uitdrukking van een lot-inducerende TF. Epigenetische regulatie zoals histone modificaties en de structuur van de chromatine legt doorgaans een belemmering voor de conversie van cel lot2,3. Wij hebben eerder toegepast omgekeerde genetica met behulp van RNAi knock-downs in C. elegans en factoren die beschermen cellulaire identiteiten en daardoor tegengaan herprogrammering van kiemcellen in neuronen4. In het bijzonder de polycomb repressieve complexe 2 (PRC2) en de zeer geconserveerde Histon chaperone LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 bij de mens) te voorkomen dat de directe omzetting van kiemcellen in specifieke somatische celtypen zoals glutamaterge smaak neuronen in C. elegans 4 , 5. om te identificeren deze geslachtscellen herprogrammering barrière factoren, gebruikten we transgene dieren die de warmte-schok afleidbare Zn-vinger TF CHE-1. CHE-1 wordt gewoonlijk uitgedrukt in twee hoofd neuronen van C. elegans, waar het bepaalt dat het lot van glutamaterge smaak neuronen genoemd ASE6. Het ASE neuron lot kan worden gevisualiseerd door expressie van de ASE-specifieke fluorescerende verslaggever gcy-5prom::gfp. GCY-5 is een chemoreceptor alleen uitgedrukt in ASE juiste neuron7. Bij lin-53 uitputting door RNAi en inductie van brede ectopische uitdrukking van CHE-1 door warmte-schok, kan kiemcellen worden omgezet in neuronen in vivo4,5. Bovenal is de timing van RNAi behandeling essentieel aangezien alleen volwassen wormen (P0 generatie) blootgesteld aan lin-53 RNAi aanleiding tot F1 nakomelingen dieren met een germline thats tolerant is geven voor herprogrammering in neuronen4.
De hierboven beschreven kiem naar neuron omzettingsprocedure in C. elegans kan worden gebruikt voor het bestuderen van een verscheidenheid van biologische vragen zoals de implicatie van signalering van opleidingstrajecten in cel lot herprogrammering. Bijvoorbeeld, gebruikten we de kiem CHE-1-geïnduceerde herprogrammering in de neuronen van de ASE op RNAi tegen lin-53 te bestuderen van de gevolgen van de inkeping signalering traject in het proces van herprogrammering8geslachtscellen. Door het uitvoeren van dubbele RNAi om mede afbreken lin-53 en de Histon demethylase-encoding gene utx-1 we bleek dat de inkeping signalering traject tegengaat gene PRC2-gemedieerde monddood maken door het activeren van de expressie van UTX-1 in de kiemcellen8 . Deze bevinding toont aan dat de geslachtscellen conversie naar neuronen beschreven in dit protocol kan worden gebruikt om te bestuderen van een complexe biologisch proces zoals cellulaire herprogrammering in een intact organisme en in het kader van verschillende ontwikkelings- en milieu voorwaarden. Voorts verstrekt het de vooruitzichten om de uitdaging van geslachtscellen door overdreven verschillende lot-inducerende TFs te bestuderen van hun rol bij de beperking van cellulaire plasticiteit9, of om te beoordelen van hun potentieel voor inducerende herprogrammering van kiemcellen te uiten andere cel typt in vivo.
Terwijl zoogdieren weefselcultures toestaan ook bestuderen van de verschillende aspecten van cel lot herprogrammering, hebben cellen gekweekt in cultuur beperkte mogelijkheden om signalering traject omstandigheden ten opzichte van een intact organisme nabootsen. Daarom, C. elegans is een veelzijdig model voor onderzoek van de rol van de verschillende biologische processen zoals Notch signalering tijdens herprogrammering in vivo. Daarnaast is het een krachtig model voor genetische schermen die relatief gemakkelijk te onderhouden en genetisch gewijzigd voor lage kosten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone&#160;</td>
			<td>A. Hartenstein GmbH</td>
			<td>211 677</td>
			<td>Peptone Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1552,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck Biosciences</td>
			<td>208290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8866.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4275.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T875.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25,163,364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (5 N)</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>KK71.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>634412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2371.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick Scientific C24</td>
			<td>M1247-0052</td>
			<td>for heat-shock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>Sanyo MIR-5</td>
			<td>5534210</td>
			<td>for maintenance of worm strains at 15 &#176;C or 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Sensicam</td>
			<td>PCO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 
			promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse 
			III minus).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uracil auxotroph E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 
			3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lin-53</td>
			<td>SourceBioscience</td>
			<td>ID I-4D14</td>
			<td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>empty vetor: L4440</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>#1654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

Bestuderen van de biologische processen van cel tijdens het converteren van de identiteit van specifieke celtypes biedt belangrijke inzichten in mechanisme die onderhouden en beschermen van cellulaire identiteiten. De omzetting van kiemcellen in specifieke neuronen in de nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een krachtig hulpmiddel voor het uitvoeren van genetische schermen om te ontleden regelgevende trajecten die gevestigde cel identiteiten waarborgen. Herprogrammering van de geslachtscellen tot een specifiek type van neuronen genoemd ASE vereist transgene dieren waarmee brede overmatige expressie van de Zn-vinger transcriptie factor (TF) CHE-1. Endogene CHE-1 wordt uitgedrukt uitsluitend in twee hoofd neuronen en is nodig om het opgeven van het lot van glutamaterge ASE neuronen, die gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door de verslaggever van de gcy-5prom::gfp . Een trans-gen met de constructie van de gen expressie voor de warmte-schok-promotor-gedreven che-1 kunt brede mis uitdrukking van CHE-1 in het hele dier op een warmte-shock behandeling. De combinatie van RNAi tegen de regulering van de chromatine factor LIN-53 en warmte-schok-geïnduceerde che-1 overmatige expressie leidt tot herprogrammering van kiemcellen in ASE neuron-achtige cellen. We beschrijven hier de specifieke procedure van RNAi en passende voorwaarden voor warmte-shock behandeling van transgene dieren om met succes het induceren van geslachtscellen naar neuron conversie.

Zoals blijkt uit Figuur 1, illustreren F1 dieren die het fenotype pvul vertonen succesvolle toepassing van lin-53 RNAi. Deze dieren zijn gevoelig voor de omzetting van hun kiemcellen in ASE neuron-achtige cellen op warmte-schok inductie van che-1 overmatige meningsuiting toestaan, zoals geïllustreerd in Figuur 2. In tegenstelling tot de wormen die op het besturingselement leeg groeide vector RNAi lin-53 RNAi behandeling dieren waarin ectopische GFP-signalen in de mid lichaamszone opleveren zal nadat warmte-schok en 25 ° C incuberen overnachting als beschreven eerdere4, 8. nader onderzoek onder een Microscoop epifluorescence van deze wormen blijkt dat neuron-achtige projecties (figuur 2B, witte pijlen) die typerend zijn voor neuronale cellen worden weergegeven in de cellen weergegeven: GFP signalen ook. Als RNAi tegen lin-53 niet succesvol was of warmte-schok voorwaarden ongepast waren GFP signalen zal lijken op die in het besturingselement RNAi behandelde dieren (Figuur 2). Nog belangrijker is, Vermijd overmatige uitdrukking van che-1 door warmte inductie inducerende voordat dieren mid L3 stadium bereiken. Dieren die te jong op het moment van che-1 overexpressie inductie waren kunnen ectopische gcy-5prom::gfp expressie in andere delen van het lichaam, zoals de ontwikkelingslanden vulva weergeven, zoals afgebeeld in Figuur 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Figuur 1: Pvul fenotype veroorzaakt door RNAi tegen lin-53. (Boven) DIC foto van L4/jonge volwassen stadium F1 nakomelingen wormen afgeleid van controle of lin-53 RNAi behandeld moeders. Schaal bars = 20 µm. (onder) dieren behandeld met lin-53 RNAi display het uitstekende schaamlippen (pvul) fenotype (zwarte pijl-hoofden). Het fenotype van de pvul bevestigt dat RNAi tegen lin-53 succesvol was. Schaal bars = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Figuur 2: Wormen met succesvol geherprogrammeerde geslachtscellen in neuronen. (A) BAT28 stam dieren geteeld op de lege vector vertonen geen GFP signalen in de kiemcellen na warmte-schok inductie van che-1 overexpressie. Witte stippellijn contouren worm. Schaal bars = 20 µm. (B) in tegenstelling tot de BAT28 stam dieren geteeld op de lege vectorbestrijding RNAi dieren gegroeid over lin-53 RNAi display gcy-5prom::gfp -signalen in de mid lichaamszone. Foto's van de sectie halverwege body met GFP signalen genomen bij 63 X vergroting onthullen GFP-positieve cellen weergegeven: uitsteeksels (witte pijl-hoofden). Deze morfologische functie geeft aan dat kiemcellen onderging omzetting in ASE neuron-achtige cellen. Witte sterretjes mark darm afkomstige auto-fluorescentie. Alle foto's werden verkregen met behulp van een Microscoop epifluorescence met 20 X vergroting en 63 X vergroting. Witte stippellijn schetst wormen. Schaal bars = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Figuur 3: Vroege fase worm met ectopische GFP. BAT28 stam dieren gegroeid op de lege vector RNAi bacteriën die warmte-schok geïnduceerde voor che-1 overexpressie in vroege larvale stadia zoals L2 weergeven GFP signalen in de mid lichaamszone (witte sterretjes). Deze signalen zijn niet te wijten aan de geslachtscellen herprogrammering. Witte stippellijn contouren worm. Schaal bars = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Dit protocol wordt beschreven hoe cellulaire om processen te bestuderen tijdens de cel lot conversie in Caenorhabditis elegans in vivo. Met behulp van transgene dieren, waardoor warmte-schok promotor gestuurde overexpressie van het neuron lot-inducerende transcriptiefactor CHE-1 en RNAi-gemedieerde uitputting van de regulering van de chromatine factor LIN-53 kiem naar neuron herprogrammering waarneembaar in vivo.

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Kiembaan

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

Het kanaal Excretory C. elegans als een Model voor de intracellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van organellen in één cel: labelen door GFP-fusies, RNAi interactie scherm en beeldvorming

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisatie van Caenorhabditis elegans te analyseren intracellulair Transport in neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...