Name: application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

우리 기술 지원에 대 한 알리 나 엘-칼 릴리, 그리고 마 르 티 나 Hajduskova 감사합니다. 우리 원고에 의견에 대 한 Tursun 그룹의 회원을 감사합니다. 이 작품은 ERC-StG-2014-637530 ERC CIG PCIG12-가-2012-333922에 의해 후원 되었다 하 고 헬름홀츠 협회에 분자 의학에 대 한 최대 Delbrueck 센터에 의해 지원 됩니다.

동물 보호에 관하여 여기에서 설명한 모든 방법 LaGeSo 베를린, 독일에 의해 승인 되었습니다.
1. 솔루션 준비
<ol>
	<li>NGM-한 천 배지 (1 L)
	<ol>
		<li>NaCl의 3 세대, 펩 미디어 (예: Bacto-펩), 2.5 g 및 한 천 20g 추가 합니다. 압력가 마로 소독, 후 추가 (5 mg/mL 95 %EtOH 재고), 콜레스테롤의 1 mL 1 mL의 1 M MgSO4, 1 mL의 1 M CaCl2, 25 mL의 1 M K2PO4, 고 암포 B (2.5 mg/mL 주식)의 1 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM Agar RNAi 접시 (1 L)
	<ol>
		<li>NaCl의 3 세대, 펩 미디어의 2.5 g 및 한 천 20g 추가 합니다. 압력가 마로 소독 후 추가, 콜레스테롤 (5 mg/mL 95 %EtOH 재고)의 1 mL 1 M MgSO4의 1 mL, 1 mL의 1 M CaCl2, 1 M K2가4의 25 mL, 암포 B (2.5 mg/mL 주식)의 1 mL, 1 M IPTG의 1 mL 고 1 mL carbenicillin (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>파운드-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>효 모 5 g 추출, 5 g의 NaCl, 한 천, 10 mL의 1 M Tris pH 8.0의 20 g, 펩 미디어의 10 g를 추가 합니다. 1 나 H2O 추가 압력가 마로 소독, 후 50 mg/mL carbenicillin의 1 mL와 5 mg/mL 항생물질의 2.5 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 매체 (1 L)
	<ol>
		<li>펩 미디어의 10 g을 추가, 효 모 5 g, NaCl의 5 g 및 10 mL 1 M Tris pH 8.0의 추출. 1 나 H2O 추가 압력가 마로 소독, 후 50 mg/mL carbenicillin의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-버퍼 (1 L)
	<ol>
		<li>나2HPO4의 6.0 g, KH2포4의 3 세대, 5 g의 NaCl, 그리고 젤라틴의 50 밀리 그램을 추가 합니다. 사용 하기 전에 1 M MgSO4의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>표백 솔루션 (10 mL)
	<ol>
		<li>1 mL NaClO와 5 N NaOH의 2 개 mL를 추가 합니다. 10 mL에 H2O를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2입니다. RNAi 접시의 준비
참고: C. 선 충 은 선 충 류 성장 매체 한 천 (Agar NGM)10,11의 7.5 mL를 포함 하는 6 cm 배양 접시에 실험실에서 일반적으로 경작 된다. 이 프로토콜은 15 ° c.에서 보관 하는 벌레에 대 한 최적화 NGM 접시를 준비 하려면 곰 팡이 및 세균 오염을 방지 하기 위해 표준 무 균 기법을 사용 합니다. 다음은 RNAi에 대 한 시 약으로 보충 NGM 접시를 준비 하는 프로토콜입니다.
<ol>
	<li>1mm 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 및 50 µ g/mL carbenicillin 6 cm NGM Agar RNAi 접시를 준비 합니다. 그들은 어두운12실 온에서 24-48 h 동안 건조 하자.
	<ol>
		<li>어둠 속에서 4 ° C에서 RNAi 번호판을 유지. 14 일 보다 오래 된 경우 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>50 µ g/mL를 포함 하는 파운드-한 천 배지에서 사용 가능한 RNAi 도서관13 에서 냉동된 글리세롤 주식에서 린-53 유전자 DNA 시퀀스와 L4440 플라스 미드를 포함 하는 RNAi 박테리아 (대장균 HT115) 클론 선택 carbenicillin와 3 상 줄이 패턴을 사용 하 여 12.5 µ g/mL 항생물질. 37 ° C 하룻밤12에서 박테리아 성장. 이 복제는 박테리아에 린-53 dsRNA의 IPTG 종속 생산을 수 있습니다.
	<ol>
		<li>또한, 빈 벡터 제어14유전자 시퀀스 없이 L4440 플라스 미드를 포함 하는 RNAi 박테리아 성장.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>다음 날, 린-53 에서 단일 식민지 나 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 빈 벡터 파운드-한 천 격판덮개 팁과 액체 LB 중간14 50 µ g/mL carbenicillin 보충의 2 개 mL를 포함 하는 별도 문화 관으로 그들의 각각을 예방. 성장 37 ° C에서 하룻밤 문화 광학 밀도 (OD)를 도달할 때까지 600 nm의 0.6-0.8. 외경15분 광 광도 계 사용 하 여 측정 합니다. 주의: 액체 LB 미디어 없어야 감소 RNAi 효율 12 리드를 먹이 동안 항생물질의 포함부터 박테리아 글리세롤 주식에서 질주 사용 파운드-한 천 배지와 달리 항생물질</li>
	<li>6 cm NGM Agar RNAi 번호판은 multipipette를 사용 하 여 각 세균성 문화 (린-53 또는 빈 벡터)의 500 µ L를 추가 합니다. 건조를 어둠 속에서 실 온에서 하룻밤 닫힌된 뚜껑 접시를 품 어. 이 기간 동안, NGM 접시에서 IPTG dsRNA 박테리아에서의 생산을 유발 한다.
	<ol>
		<li>실험 당 세균성 문화 당 3 접시를 사용 합니다. 이 기술 3 각 실험에 대 한 복제를 제공할 것입니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 박테리아와 말린된 NGM agar RNAi 접시를 저장.</li>
</ol>
3. 선 충 C. 변형 BAT28의 준비
<ol>
	<li>웜 변형 transgenes otIs305 를 포함 하는 BAT288 유지 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] 및 ntIs1 [gcy-5prom::gfp] 표준 NGM-한 천 배지를 사용 하 여 15 ° c.에 OP50 박테리아에 참고: 선 충 문화에 자세한 프로토콜에 대 한10를 참조 하십시오. Rol-6(su1006) 는 지배적인 대립 유전자 이며, 일반적으로 사용 하는 phenotypic 주입 마커16 일반적인 회전 이동 시키는. 그것은 otIs305 transgene에서 추적을 사용 hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>15 ° C에서 BAT28 긴장의 precautious 활성화를 방지 하기 위해 항상 유지는 hsp-16.2prom::che-1 transgene. 가능한 만큼 많이 긴장을 처리 하는 동안 15 ° C 보다 높은 온도에 노출 줄일.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>나이-동기화 웜, 표백 기술17을 사용 합니다.
	<ol>
		<li>성인과 900 µ L M9 버퍼를 사용 하 여 BAT28의 계란을 포함 하 6 cm NGM Agar 접시를 씻어. 펠 웜 1 분에 900 x g에서 centrifuging 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>0.5-솔루션을 표백의 1 mL을 추가 하 고 어른 벌레 버스트 오픈 시작 때까지 대략 1 분 동안 튜브를 흔들어. 모니터는 표준 stereomicroscope를 사용 하 여입니다.</li>
		<li>펠 웜 1 분에 900 x g에서 centrifuging 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>M9 버퍼의 800 µ L을 추가 하 고 900 x g에서 centrifuging 여 웜 펠 릿 3 번을 씻어.</li>
		<li>청소 계란 OP50 박테리아와 시드 신선한 NGM 접시에 놓습니다. 성장 15 ° C에 OP50 박테리아에 표백된 인구 L4 단계 (약 4 일)에 도달할 때까지. 표준 stereomicroscope를 사용 하 여 웜18 의 복 부 측에 따라서 대략 중간 흰색 패치 L4 애벌레를 인식할 수 있습니다. 참고: 세균 셀 린-53의 고갈에 따라 신경 변환 형을 달성 하기 위해, 그것은 부모의 세대 (P0)에 고갈 될 필요가 있다.</li></ol></li></ol>변환 형에 대 한 점수는 다음 세대 (자식 세대 f 1)에 착수 된다. 달성 하기 위하여는 P0에 이미 파괴 린-53 , L4 동물 RNAi를 받게 됩니다.
	
	
	<li>수동으로 전송 50 L4 단계 웜 NGM 접시에 백 금 철사를 사용 하 여 복제 당 그 어떤 박테리아를 포함 하지 않으며 모든 전송된 OP50 박테리아에서 벌레를 하자. 벌레에 약 5 분 동안 이동 하자. NGM Agar RNAi 격판덮개에서 사용 박테리아는 이전 린 53 RNAi 박테리아 (또는 빈 벡터 제어) 각각 RNAi 번호판을 시드.
	<ol>
		<li>실제 RNAi 번호판 OP50 박테리아를 전송 하지 마십시오. 온도 15 ° c. 보다 높은 긴장의 노출 시간을 최소화 하기 위해 빠른 작업</li>
	</ol>
	</li>
	<li>벌레의 F1 자손 L3-L4 단계에 도달할 때까지 약 7 일에 대 한 15 ° C에서 NGM Agar RNAi 접시에 벌레를 품 어. 그들은 수 있다 명확 하 게 구분 P0 동물에서 크고 F1 자손 보다 두꺼운 이기 때문.
	<ol>
		<li>시각적으로 확인 하십시오 표준 stereomicroscope 아래 그림 1에서 보듯이 F1 자손 웜 튀어나온 음부 (pvul) 표현 형을 표시 하는지 여부. 린-53 에 대 한 RNAi는 다 면 발현 성 효과 고 RNAi 린-53 에 대 한 성공 여부를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다 pvul 표현 형. 참고: 린-53 에 대 한 RNAi는 F1 배아의 치 사 율을 일으킬 수 있습니다. 이 효과 동물 L3-L4 단계에 도달 하기 전에 접시 15 ° C 보다 더 높은 학위에 노출 되는 경우 증가 합니다. 죽은 태아 체포 개발 및 해칭의 부족에 의해 인식 될 수 있다.</li>
		<li>IPTG 이기 때문에 빛에 민감한 접시 어둠 속에 품 어.</li>
	</ol>
	</li>

4입니다. 생식 세포 프로그래밍의 유도
<ol>
	<li>품 어 시험된 RNAi 판 린-53 를 포함 하 고 빈 체 1을 활성화 하기 위해 어둠 속에서 37 ° C에서 30 분 동안 벡터 RNAi 대우 F1 자손. 발명된 인큐베이터를 사용 하 여 보다 효율적인 열-충격에 대 한 수 있기 때문.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 30 분 동안 복구 하 고 어둠 속에서 하룻밤 25 ° C에서 번호판을 품 어에 열 충격을 동물 허용.</li>
	<li>Gcy-5prom::gfp의 GFP 필터 동물 검사 형광 광원에 결합 하는 표준 stereomicroscope를 사용 하 여- 그림 2와 같이 벌레의 중간 본문 영역에서 신호를 파생. GFP 신호에 대 한 설정된 현미경: 여기 488에서 최대 방출 최대 509에서 nm nm.</li>
	<li>천 패드 포함 된 현미경 슬라이드19중순 신체 영역에 GFP 신호와 장착 동물에 의해 생식 세포 신경 변환의 정도 평가 합니다.
	<ol>
		<li>평가 형 penetrance 어두운 동물 대 신경 변환 세균 셀을 보여주는 동물의 수를 계산 합니다. 일반적으로, 약 동물의 30% 표시 개별 GFP 신호 린 53 고갈에 따라 생식에 반면 동물의 5% 이상 빈 벡터 RNAi 시 생식에 확산 GFP 신호.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li><li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+barriers+and+enhancers:+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency.">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li><li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-Dependent+Heterochromatin:+Barrier+to+Cell+Fate+Changes.">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li><li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types.">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li><li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types.">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li><li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron.">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653 (2007).</li><li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li><li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons.">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity.">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100 (2017).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenorhabditis+Elegans.">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).</li><li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li><li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein.">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li><li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm.">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li><li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++.">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+biology.">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li></ol>

저자는 아무 경쟁 관심사 존재 선언.

유전자 변형 C. 선 충 을 사용 하 여 설명된 프로토콜 동안 BAT28 변형 및 린-53 에 대 한 RNAi는 간단, 단계 수는 중요 한 순서에 신경 프로그래밍을 생식 세포의 예상된 결과 보장 하기 위해. 그것은 중요 한 실험 전에 항상 긴장 BAT28 15 ° C에서 유지 됩니다. 처리 및 긴장의 유지 보수, 동안 15 ° C 이상의 온도에서 시간 필요가 최소화 가능 한 한 많이 있다. 적절 한 열 충격 조건을 체 1 overexpression의 부족 한 유도 하지 ASE 신경 변환 생식 세포 귀 착될 것 이다 때문에 중요 하다. 이 프로토콜에 설명 된 대로 형 penetrance를 측정 하 여 검출 될 수 있다. 광범위 한 열-충격 동물의 치 명도 될 수 있습니다. 예를 들어, 배치 된 안 벽 근처 또는 정적 공기 인큐베이터의 하단 바닥에 종종 접시 광범위 한 열 처리 경험. 따라서, 배기 열 인큐베이터를 사용 하는 것이 좋습니다. 또한, 열-충격 유도의 타이밍은 애벌레 단계 이전 체 1 의 오버 식 이후 중요 L3 소성 gcy 5prom::gfp 유도 (그림 3) 외 음부 등의 다른 지역에서 발생할 수 있습니다 다음 9. 또한, 광범위 한 열-충격 형 penetrance 5% 그리고 다른 조직, 즉 내장의 증가 자동 형광을 확장 해야 하는 빈 벡터 RNAi 동물에 의해 검출 될 수 있다.
산발적으로, RNAi 박테리아는 그들의 활동을 효율적으로 대상 유전자의 dsRNA를 생산을 잃을 수 있습니다. 불행히도,이 RNAi 실험 검색된 사전 수 없습니다. 이러한 경우에는 글리세롤에서 신선한 행진 프로토콜의 섹션 2에 설명 된 대로 성장 한다. 경우 아직 아무 RNAi 발생 다 면 발현 성 형 pvul 표현 형 린-53, 다음 플라스 미드에 대 한 성공적인 RNAi 기인한 각각 박테리아에서 DNA 격리와 같은 표시를 수행 해야 하 고 신선한 HT115 박테리아가 될 필요가 린-53 시퀀스가 포함 된 L4400 플라스 미드와 변형.
중요 한 것은, BAT28 긴장은 한 사출 마커 pRF4와 동물의 transgenesis 동안에 사용 되었다에 의해 발생 하는 롤러 형은 hsp-16.2prom::che-1 DNA 구조. 때때로, 동물의 입을 수 있습니다 나타내는 롤링 형을 잃고는 hsp-16.2prom::che-1 transgene. BAT28 긴장을 제대로 유지 하려면 신선한 접시 10 롤러 동물을 선택 하 고 전파 동물을 압 연에 대 한 선택.
응용 프로그램 프로토콜의 동물 부모 (P0 세대)는 린-53 RNAi에 노출 되지 생식 세포 신경 변환 모성 구조4때문에 표시 되지 것입니다 즉 F1 RNAi 절차로 제한 됩니다. 세균 세포 뉴런으로 변환 하는 다른 절차 Ciosk와 동료15 RNAi 노크 다운 gld-1 의 녹음 방송 요인의 이상의 식 없이 mex-3 를 사용 하 여 설명 하고있다. 그러나, 얻은 뉴런 뉴런의 특정 종류에 속하지 않는 및 생식 세포는 또한 gld-1 및 mex-315의 RNAi 중재 고갈 시 근육 처럼 세포로 변환. 이전에, 그것은 입증 되었습니다 RNAi 린-53 에 대 한 허용-표현의 Pitx 형 homoedomain 녹음 방송 요인 체-14 대신 UNC-3016 시 GABAergic 신경-같은 세포로 생식 세포 변환 . 미래 방향에 대 한 다른 운명을 유도 하는 녹음 방송 요인 린-53 고갈 세균 세포 여부를 테스트할 수 있습니다 특정 뉴런 보다 다른 셀 형식으로 변환할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 조직적 bHLH 녹음 방송 요인 HLH-1, 포유류 MyoD17체의 overexpression 린-53 RNAi5 시 근육에 생식 세포의 전환을 유도합니다. 다른 유전 스크린의 숫자에 대 한 세균 셀 린-53 RNAi 시 특정 신체 세포 유형 및 적절 한 운명을 유도 하는 녹음 방송 요인의 과다 식 설립 프로그래밍을 사용할 수 있습니다. 이러한 억압 또는 증강 화면 셀 운명 변환 하는 동안 역할 규정 경로 해 부 수 있습니다.

세포 운명 조직적 TF MyoD 같은 소성 TF 식으로 프로그래밍을 때 overexpressed, 근육 같은 셀1에 직접 변환 fibroblasts 수십 년 동안 연구 집중 되었습니다. 그러나, 차별화 된 셀이이 과정, 그들의 세포질 신원을 보호 메커니즘 때문에 내 화 많습니다. 세균 세포 보호의 유사한 정도 보여 고 종종 운명을 유도 TF의 이상의 표현 시 다른 세포 유형으로 생식 세포 변환 방지 하기 위해 방 벽으로 작동 하는 기본 메커니즘이 있습니다. 일반적으로, 히스톤 수정 및 chromatin 구조 같은 후 성적인 규칙 세포 운명을2,3의 변환에 대 한 장애를 부과 한다. 우리 이전 반전 유전학 C. 선 충 에 RNAi 노크-다운을 사용 하 여 적용 하 고 셀룰러 정체성을 보호 하 고 그로 인하여 세균 세포의 신경4로 프로그래밍을 중화 하는 요인 확인. 특히, polycomb 억압 적인 복잡 한 2 (PRC2) 및 높은 보존된 히스톤 보호자 린-53 (CAF-1/RBBP/4/7 인간의) C. 선 충에서 glutamatergic 맛 신경 세포 등 특정 신체 세포 유형으로 생식 세포의 직접 변환 방지 4 , 5. 장벽 요소 프로그래밍이 세균 세포를 식별 하기 위해 사용 하는 열 충격 유도할 수 있는 Zn 손가락 TF 체-1을 운반 하는 유전자 변형 동물. C. 선 충, glutamatergic 맛 신경 세포의 운명을 ASE6라고 지정의 두 머리 신경 체-1 일반적으로 표현 된다. ASE 신경 운명 ASE 특정 형광 기자 gcy 5prom::gfp의 표현에 의해 구상 될 수 있다. GCY-5 chemoreceptor ASE 오른쪽 신경7만 표현 이다. RNAi에 의해 린 53 소모 및 열 충격에 의해 체 1의 광범위 한 소성 식의 유도, 생식 세포는4,5 생체 내에서뉴런으로 변환할 수 있습니다. 중요 한 것은, RNAi 치료의 타이밍은 린-53 RNAi에 노출만 어른 벌레 (P0 세대) F1 자손 동물 신경4에 프로그래밍에 대 한 허용은 생식을 일으키로 중요 합니다.
C. 선 충 에서 신경 변환 절차를 위에 설명 된 생식 세포 생물학 질문 셀 운명 프로그래밍에 경로 신호의 의미 등의 다양 한 연구를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 노치 신호 전달 경로 생식 세포8프로그래밍 과정의 의미를 공부 하기 위하여 린-53 에 대 한 RNAi 따라 ASE 뉴런으로 재프로그래밍 체 1 유발 세균 셀을 사용 합니다. 린-53 와 demethylase 인코딩 히스톤 공동 고갈에 더블 RNAi를 수행 하 여 우리 노치 신호 통로 중화 PRC2 중재 유전자 표현의 UTX-1 생식8에서에서 활성화 하 여 입을 보여주는 유전자 utx-1 . 이 생식 세포 변환할이이 프로토콜에서 설명 하는 신경 세포 프로그래밍의 컨텍스트에서 다른 발달 및 환경 그대로 유기 체에와 같은 복잡 한 생물 학적 과정을 공부 하 사용 될 수 보여 줍니다. 조건입니다. 또한, 그것은 과도 다른 운명을 유도 TFs 셀룰러 소성9의 금지에서 그들의 역할을 연구 하거나 유도 하는 세균 세포의 프로그래밍에 대 한 그들의 잠재력을 평가 표현 하 여 생식 세포를 도전 하는 관점을 제공 한다 다른 셀에 비보를 입력합니다.
포유류 조직 문화는 또한 세포 운명 프로그래밍의 다양 한 측면을 공부 허용, 문화에서 성장 하는 세포 신호 경로 조건 그대로 체에 비해 모방 하는 능력을 제한 했다. 따라서, C. 선 충 검사 vivo에서프로그래밍 하는 동안 노치 신호 등 다양 한 생물 학적 과정의 역할에 대 한 다재 다능 한 모델 이다. 또한, 상대적으로 쉽게 유지 하 고 낮은 비용에 대 한 유전자 수정 유전 스크린에 대 한 강력한 모델입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone&#160;</td>
			<td>A. Hartenstein GmbH</td>
			<td>211 677</td>
			<td>Peptone Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1552,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck Biosciences</td>
			<td>208290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8866.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4275.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T875.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25,163,364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (5 N)</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>KK71.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>634412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2371.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick Scientific C24</td>
			<td>M1247-0052</td>
			<td>for heat-shock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>Sanyo MIR-5</td>
			<td>5534210</td>
			<td>for maintenance of worm strains at 15 &#176;C or 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Sensicam</td>
			<td>PCO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 
			promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse 
			III minus).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uracil auxotroph E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 
			3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lin-53</td>
			<td>SourceBioscience</td>
			<td>ID I-4D14</td>
			<td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>empty vetor: L4440</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>#1654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

세포 생물학 과정을 공부 하 고 특정 종류의 id를 변환 하는 동안 유지 하 고 세포 정체성 보호 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공 합니다. 선 충 꼬마 선 충 (C. 선 충)에 있는 특정 신경 세포로 생식 세포의 전환 설립된 셀 정체성 보호 규정 경로 해 부 하기 위해 유전 스크린을 수행 하기 위한 강력한 도구입니다. 특정 유형의 신경 ASE 라고 세균 세포의 프로그래밍 아연 손가락 녹음 방송의 광범위 한 이상 식 허용 하는 유전자 변형 동물 요인 (TF) 체-1 필요 합니다. 생 체-1은 두 개의 머리 뉴런에 독점적으로 표현 되며 gcy 5prom::gfp 기자에 의해 쉽게 구상 될 수 있다 glutamatergic ASE 신경 세포 운명을 지정 하는 데 필요한. 열 충격 발기인 구동 체 1 유전자 식 구조를 포함 하는 횡단 유전자 열 충격 처리 시 전체 동물에 체 1의 광범위 한 잘못 표현 수 있습니다. Chromatin 규제 요소 린-53와 열 충격 유발 체 1 -식에 대 한 RNAi의 조합을 ASE 신경-같은 세포로 생식 세포의 프로그래밍 이끌어 낸다. 우리 기술 여기 유전자 변형 동물의 열 충격 처리에 대 한 적절 한 조건과 특정 RNAi 절차 성공적으로 신경 변환 생식 세포를 유도 하기 위하여.

그림 1에서 보듯이, F1 동물 pvul 표현 형을 전시 하는 린-53 RNAi의 성공적인 응용 프로그램을 보여 줍니다. 이 동물 들은 그림 2에서 볼 수 있듯이 체 1 -식의 열 충격 유도 따라 ASE 신경-같은 세포로 그들의 생식 세포의 변환을 허용 하는 경향이 있다. 빈 컨트롤에 자란 벌레는 달리 RNAi 린-53 RNAi 치료 기술된 이전4, 으로 하룻밤 사이 열 충격 및 25 ° C 부 화 후 중간 본문 영역에서 소성 GFP 신호를 표시 하는 동물을 얻을 것입니다 벡터 8.이 벌레의 epifluorescence 현미경 가까이 시험 드러내 보여주는 GFP 신호 또한 세포는 신경 세포에 대 한 전형적인 신경 같은 계획 (그림 2B, 흰색 화살표) 표시. 린-53 에 대 한 RNAi 실패 했다 또는 열 충격 조건을 적절 한 되지 않은 경우 치료 동물 (그림 2) GFP 신호 제어 RNAi에 닮은 것 이다. 중요 한 것은, 동물 중반 L3 단계에 도달 하기 전에 체 1 의 오버 식 열 유도 의해 유도 하지 마십시오. 체 1 overexpression 유도 시간에 너무 젊은 했다 동물 그림 313에서 같이 개발 외 음부 같은 본문의 다른 지역에서 소성 gcy 5prom::gfp 식을 표시할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
그림 1: 린-53에 대 한 RNAi에 의해 발생 하는 Pvul 형. (맨 위) L4/젊은 성인 단계 F1 자손 벌레의 DIC 그림 컨트롤이 나 린-53 RNAi 대우 어머니에서 파생. 바 규모 = 20 µ m. (하단) 동물 린-53 RNAi 디스플레이 튀어나온 음부 (pvul) 형 (검정 화살표 머리)로 치료. Pvul 형 린-53 에 대 한 RNAi 되었는지 확인 합니다. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
그림 2: 웜 성공적으로 재설정된 생식 세포와 신경에. (A) 빈 벡터에 성장 하는 BAT28 변형 동물 체 1 overexpression의 열 충격 유도 후 GFP 신호는 생식에 표시 하지 않습니다. 흰색 파선 웜을 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. (B) BAT28 변형 동물 성장 빈 벡터 제어에 린-53 에 RNAi 디스플레이 gcy 5prom::gfp 신호 중간 몸 지역에 성장 하는 RNAi 동물 달리. 그림 63 X 배율에서 GFP 신호와 중반 바디 섹션의 GFP-긍정적인 세포 돌출 (흰색 화살표 머리)을 보여주는 공개. 이 형태학 기능 세균 세포 ASE 같은 신경 세포로 변환 받았습니다 나타냅니다. 화이트 별표 소장 파생 된 자동 형광 표시합니다. 모든 사진 확대 및 63 X 배율 X 20 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 인수 했다. 흰색 파선 웜 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
그림 3: 소성 GFP와 초기 단계 웜. BAT28 변형 동물 열-충격 체 1 overexpression L2 등 초기 애벌레 단계에 대 한 유도 했다 빈 벡터 RNAi 박테리아에 성장 중순 신체 영역 (흰색 별표)에서 GFP 신호를 표시 합니다. 이러한 신호는 생식 세포 프로그래밍으로 인해 되지 않습니다. 흰색 파선 웜을 설명합니다. 바 규모 = 20 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

이 프로토콜에는 꼬마 선 충에서 vivo에서 세포 운명 변환 중 세포질 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 유전자 변형 동물, 신경 운명을 유도 하는 전사 인자 체 1의 열 충격 발기인 구동 overexpression와 염색 질 조절 요소 린-53 세균 세포의 신경 프로그래밍을 고갈 RNAi 중재를 사용 하 여 관찰 될 수 있다 vivo에서.

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

연구

발생학

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...