Name: application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Vi takker Alina El-Khalili og Martina Hajduskova for teknisk assistanse. Vi takker medlemmer av gruppen Tursun for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble sponset av ERC-StG-2014-637530 og ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 og støttes av Max Delbrueck senter for molekylær medisin i Helmholtz foreningen.

Alle metodene som er beskrevet her med hensyn til dyr omsorg har godkjent LaGeSo Berlin, Tyskland
1. løsning forberedelse
<ol>
	<li>NGM-Agar plater (1 L)
	<ol>
		<li>Legge til 3 g av NaCl, 2.5 g pepton medier (f.eks Bacto-pepton) og 20 g agar. Etter autoklavering, Legg 1 mL av kolesterol (5 mg/mL på 95% EtOH lager), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4og 1 mL av amfotericin B (2,5 mg/mL stock).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM-Agar RNAi plater (1 L)
	<ol>
		<li>Legge til 3 g av NaCl, 2.5 g pepton Media og 20 g agar. Etter autoklavering legge, 1 mL av kolesterol (5 mg/mL på 95% EtOH lager), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4, 1 mL av amfotericin B (2,5 mg/mL stock), 1 mL 1 M IPTG , og 1 mL carbenicillin (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>Legge 10 g pepton medier, 5 g av gjær ekstra, 5 g av NaCl, 20 g agar, 10 mL 1 M Tris pH 8.0. Legge til H2O 1 L. Etter autoklavering, tilsett 1 mL av 50 mg/mL carbenicillin og 2,5 mL av 5 mg/mL tetracycline.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB Medium (1 L)
	<ol>
		<li>Legge 10 g pepton medier, 5 g av gjær ekstra, 5 g av NaCl og 10 mL 1 M Tris pH 8.0. Legge til H2O 1 L. Etter autoklavering, Legg 1 mL av 50 mg/mL carbenicillin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-buffer (1 L)
	<ol>
		<li>Legg 6.0 g Na2HPO4, 3 g av KH2PO4, 5 g av NaCl og 50 mg gelatin. Før bruk, legge 1 mL 1 M MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bleking løsningen (10 mL)
	<ol>
		<li>Legg 1 mL av NaClO og 2 mL 5 N NaOH. Legge til H2O 10 mL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. forberedelse av RNAi plater
Merk: C. elegans er vanligvis kultivert i laboratoriet på 6 cm Petri plater som inneholder 7,5 mL Rundormer vekst Medium Agar (NGM-Agar)10,11. Denne protokollen er optimalisert for ormer holdt på 15 ° C. For å forberede plater med NGM, Bruk standard steril teknikk for å hindre sopp og bakteriell forurensning. Følgende er protokollen å forberede NGM plater supplert med reagenser for RNAi.
<ol>
	<li>Forberede 6 cm NGM-Agar RNAi plater som inneholder 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og 50 µg/mL carbenicillin. La dem tørke for 24 48 h ved romtemperatur i den mørke12.
	<ol>
		<li>Hold RNAi plater på 4 ° C i mørket. Ikke bruk hvis eldre enn 14 dager.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Velg RNAi bakterier (Escherichia coli HT115) klone som inneholder L4440 plasmider med lin-53 genet DNA sekvensen fra frosne glyserol lager fra de tilgjengelige RNAi bibliotek13 på LB-agar plater som inneholder 50 µg/mL carbenicillin og 12,5 µg/mL tetracycline ved hjelp av tre-fase streker mønsteret. Vokse bakterier på 37 ° C over natten12. Denne klone kan IPTG-avhengige produksjon av lin-53 dsRNA i bakterier.
	<ol>
		<li>I tillegg vokse RNAi bakterier som inneholder L4440 plasmider uten noen genet sekvensen som Tom vektor kontroll14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Neste dag, Velg en enkelt koloni fra lin-53 eller tom vektor LB-agar plater med en 200 µL pipette tips og vaksinere hver av dem i en egen kultur rør som inneholder 2 mL væske LB middels14 med 50 µg/mL carbenicillin. Vokse kulturer overnatting på 37 ° C før de når en optisk tetthet (OD) på 600 nm på 0,6-0,8. Måle OD bruker et spektrofotometer15. FORSIKTIG: Flytende LB media bør ikke inneholde tetracycline i motsetning LB-agar platen brukes for striper bakterier fra glyserol lager, siden inkludering av tetracycline under mating fører til en redusert RNAi effektivitet 12</li>
	<li>Legg til 500 µL av hver bakteriell kultur (lin-53 eller tom vektor) 6 cm NGM-Agar RNAi plater ved hjelp av en multipipette. Inkuber plater med lukket lokk over natten i romtemperatur i mørket tørke. Samtidig vil IPTG i NGM platene induserer produksjon av dsRNA i bakterier.
	<ol>
		<li>Bruk minst 3 plater per bakteriell kultur per forsøk. Dette vil gi 3 teknisk replikerer for hvert eksperiment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lagre tørket NGM-agar RNAi plater med bakterier på 4 ° C i mørket for to uker.</li>
</ol>
3. forberedelse av C. elegans belastning BAT28
<ol>
	<li>Opprettholde ormen belastningen BAT288 inneholder effekter av transgener otIs305 [hsp-16.2prom::che-1 rol-6(su1006)] og ntIs1 [gcy-5prom::gfp] på OP50 bakterier bruker standard NGM-Agar plater på 15 ° C. Merk: For detaljert protokollen Rundormer kultur, se10. Rol-6(su1006) er en dominerende allelet og vanlige fenotypiske injeksjon markør16 som forårsaker typisk rullende bevegelsen. Den brukes i otIs305 transgene spore hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Hold BAT28 belastning på 15 ° C hele tiden for å hindre precautious aktivering av den hsp-16.2prom::che-1 transgene. Redusere eksponering for temperaturer høyere enn 15 ° C ved håndtering belastningen som mulig.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>For å alder-synkronisere ormer, kan du bruke de bleking teknikk17.
	<ol>
		<li>Vask av 6 cm NGM-Agar plater som inneholder voksne og egg fra BAT28 med 900 µL M9 buffer. Pellet ormer av sentrifugering 900 x g i 1 Fjern nedbryting.</li>
		<li>Legg til 0,5-1 mL av bleking løsningen og rist røret for ca 1 min til voksen ormer begynner å sprekke åpne. Skjermen ved hjelp av en standard stereomicroscope.</li>
		<li>Pellet ormer av sentrifugering 900 x g i 1 Fjern nedbryting.</li>
		<li>Vask ormen pellet 3 ganger ved å legge 800 µL av M9 buffer og sentrifugering 900 x g.</li>
		<li>Plass renset egg på fersk NGM-plater seeded med OP50 bakterier. Vokse en bleket befolkningen på OP50 bakterier på 15 ° C før de når L4 scenen (ca 4 dager). L4 Larvene kan bli gjenkjent av en hvit flekk omtrent halvveis langs ventrale ormen18 bruker en standard stereomicroscope. Merk: For å oppnå den bakterie cellen til Nevron konvertering fenotypen ved nedbryting av lin-53, må det være oppbrukt i foreldre generasjon (P0).</li></ol></li></ol>Scoring for konvertering fenotypen foretas i den kommende generasjonen (filial generasjon F1). For å oppnå deplete lin-53 allerede i P0, er L4 dyrene utsatt for RNAi.
	
	
	<li>Manuelt overføre 50 L4 scenen ormer per replikere med en platina wire til en NGM plate som ikke inneholder noen bakterier og la ormer bevege seg bort fra alle overførte OP50 bakterier. La ormer flytte på tallerkenen for ca 5 minutter. Bruk bakterier fra NGM-Agar RNAi platene seeded tidligere med lin-53 RNAi bakterier (eller tom vektor kontroll) til å overføre til de respektive RNAi platene.
	<ol>
		<li>Unngå overføring OP50 bakterier til faktiske RNAi platene. Arbeide raskt for å minimere tiden av belastningen for temperaturer høyere enn 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkuber ormer på NGM-Agar RNAi plater på 15 ° C i ca 7 dager til F1 avkom av ormene når L3-L4 scenen. De kan være klart adskilt fra P0 dyrene siden de er større og tykkere enn F1 avkommet.
	<ol>
		<li>Visuelt Sjekk under en standard stereomicroscope om F1 avkom worms Vis utstående vulva (pvul) fenotypen som vist i figur 1. RNAi mot lin-53 har pleiotropic effekter og forårsaker pvul fenotypen som kan brukes til å vurdere om RNAi mot lin-53 har vært vellykket. Merk: RNAi mot lin-53 kan også forårsake dødelighet av F1 embryo. Dette øker hvis platene er utsatt for høyere grader 15 ° c før dyr L3-L4 scenen. Død embryo kan bli gjenkjent av arrestert utvikling og klekking.</li>
		<li>Inkuber plater i mørket siden IPTG er lysfølsom.</li>
	</ol>
	</li>

4. induksjon av bakterie celle omprogrammering
<ol>
	<li>Inkuber undersøkt RNAi plater som inneholder lin-53 og tømme vektor RNAi-behandlet F1 avkom i 30 min på 37 ° C i mørket for å aktivere CHE-1. Bruke en ventilerte inkubator siden det gir en mer effektiv varme-sjokk.</li>
	<li>Tillat varme-sjokkert dyr å gjenopprette i 30 min ved romtemperatur i mørket og deretter ruge plater ved 25 ° C over natten i mørket.</li>
	<li>Bruke en standard stereomicroscope koblet til fluorescens lyskilde, undersøke dyr GFP filteret for gcy-5prom::gfp-avledet signaler i midten av kroppen område av ormer som vist i figur 2. Satt mikroskop for GFP signaler: eksitasjon maksimum ved 488 nm med utslipp maksimum ved 509 nm.</li>
	<li>Vurdere graden av bakterie celle til Nevron konvertering ved montering dyr med GFP signaler i midten av kroppen området agar pad inneholder mikroskopi lysbilder19.
	<ol>
		<li>Telle antall dyr viser bakterie celle til Nevron konvertering vs mørke dyrene å vurdere fenotypen penetrance. Vanligvis viser rundt 30% av dyrene diskret GFP signaler i germline ved lin-53 utarming, mens ikke mer enn 5% av dyrene vise diffus GFP signaler i germline på tom vektor RNAi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li><li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+barriers+and+enhancers:+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency.">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li><li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-Dependent+Heterochromatin:+Barrier+to+Cell+Fate+Changes.">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li><li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types.">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li><li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types.">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li><li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron.">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653 (2007).</li><li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li><li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons.">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity.">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100 (2017).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenorhabditis+Elegans.">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).</li><li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li><li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein.">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li><li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm.">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li><li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++.">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+biology.">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li></ol>

Forfatterne har erklært at det finnes ingen konkurrerende interesser.

Mens beskrevet protokollen ved hjelp av transgene C. elegans sil BAT28 og RNAi mot lin-53 er enkelt, en rekke tiltak er avgjørende for å sikre det forventede resultatet av bakterie celle til Nevron omprogrammering. Det er viktig at belastningen BAT28 holdes på 15 ° C hele tiden før eksperimenter. Under håndtering og vedlikehold av belastningen må samtidig temperaturer over 15 ° C reduseres så mye som mulig. Skikkelig varme-sjokk er viktig siden utilstrekkelig induksjon av che-1 overuttrykte ikke vil resultere i bakterie celle ASE Nevron konvertering. Dette kan oppdages ved å måle fenotypen penetrance som beskrevet i protokollen. Omfattende varme-sjokk føre til dødelighet av dyrene. For eksempel opplever plater som er plassert i nærheten av indre veggene eller på nederste bakken av en statisk luft inkubator ofte omfattende varmebehandling. Derfor anbefales det å bruke en ventilerte varme inkubator. I tillegg er timing av varme-shock induksjon avgjørende siden over-uttrykk for che-1 under larver stadier tidligere så L3 kan føre til ektopisk gcy-5prom::gfp induksjon i ulike kroppen regioner som vulva (Figur 3) 9. videre omfattende varme-sjokk kan oppdages av fenotypen penetrance i tomme vektor RNAi dyr ikke bør strekke 5% og økt auto-fluorescens av andre vev, nemlig tarmen.
Sporadisk, kan RNAi bakterier miste sin aktivitet å effektivt produsere dsRNA av målet genet. Dessverre, dette kan ikke være oppdaget før RNAi eksperimentet. I slike tilfeller bør en fersk strek fra glyserol dyrkes som beskrevet i del 2 av protokollen. Hvis det er fortsatt ingen RNAi-forårsaket pleiotropic fenotypen synlig som pvul fenotypen forårsaket av vellykkede RNAi mot lin-53, deretter en plasmider DNA isolert fra de respektive bakteriene skal utføres og fersk HT115 bakterier må være forvandlet L4400 plasmider inneholder lin-53 sekvensen.
Viktigere, den BAT28 stammen har en berg fenotypen forårsaket av injeksjon markør pRF4, som ble brukt under transgenesis av dyrene med den hsp-16.2prom::che-1 DNA konstruksjon. Noen ganger dyr miste rullende fenotypen, som kan indikere stanse den hsp-16.2prom::che-1 transgene. For å kunne opprettholde BAT28 belastning, plukke 10 roller dyr til en frisk plate og overføre valg for rullende dyr.
Anvendelsen av protokollen er begrenset til F1 RNAi prosedyren, som betyr at dyr hvis foreldre (P0 generasjon) ikke har vært utsatt for lin-53 RNAi ikke vises bakterie celle til Nevron konvertering på grunn av mors redning4. En alternativ metode for å konvertere bakterie celler til neurons har blitt beskrevet av Ciosk og kolleger15 bruker RNAi sammenleggbare gld-1 og mex-3 uten over-uttrykk for en transkripsjon faktor. Imidlertid fått neurons tilhører ikke en bestemt type nevroner og bakterie celler også konvertere til muskel-lignende celler ved RNAi-mediert uttømming av gld-1 og mex-315. Tidligere har det vært vist RNAi mot lin-53 tillatt bakterie celle konvertering i GABAergic Nevron-lignende celler ved over-uttrykk for Pitx-type homoedomain transkripsjon faktoren UNC-3016 istedet for CHE-14 . For fremtidige retninger, kan annen skjebne-inducing transkripsjon faktorer kan testes om lin-53 utarmet bakterie celler konverteres til andre celletyper enn bestemte neurons. I denne sammenheng induserer overuttrykte myogenic bHLH transkripsjon faktoren klart å etablere-1, homolog av pattedyr MyoD17, konvertering av bakterie celle til muskler ved lin-53 RNAi5. Den etablerte omprogrammering av bakterie celler til en bestemt somatisk cell type ved lin-53 RNAi og over-uttrykk for en passende skjebne-inducing transkripsjon faktor kan brukes for en rekke ulike genetisk skjermer. Slike suppressor eller enhancer skjermer kan hjelpe dissekere regulatoriske veier som spiller en rolle i celle skjebne konvertering.

Celle skjebne omprogrammering av ektopisk TF uttrykk som den myogenic TF-MyoD, som, når overexpressed, konverterer fibroblaster direkte i muskel-lignende celler1, har vært et fokus i flere tiår. Differensierte celler er imidlertid ofte ildfaste til denne prosessen, på grunn av mekanismer som ivareta sin mobilnettet identitet. Bakterie celler viser en tilsvarende grad av beskyttelse og det underliggende mekanismene som ofte fungerer som en barriere for å forhindre bakterie celle konvertering til andre celletyper ved over-uttrykk for en skjebne-inducing TF. Vanligvis medfører epigenetic regulering som histone endringer og chromatin struktur en hindring for konvertering av cellen skjebne2,3. Vi har tidligere brukt omvendt genetikk hjelp RNAi banke-downs i C. elegans og identifiserte faktorer som sikre mobilnettet identiteter og dermed motvirke omprogrammering av bakterie celler inn neurons4. Spesielt polycomb undertrykkende komplekse 2 (PRC2) og høyt konservert histone Anstandsdame LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 hos mennesker) hindre direkte konvertering av bakterie celler inn bestemt somatisk celletyper som glutamatergic smak nerveceller i C. elegans 4 , 5. for å identifisere disse bakterie celle omprogrammering barriere faktorer, vi brukte transgene dyrene bærer varme-shock induserbart Zn finger TF CHE-1. CHE-1 uttrykkes vanligvis i to hodet nevroner i C. elegans, der den angir skjebnen til glutamatergic smak neurons kalt ASE6. ASE Nevron skjebnen kan visualiseres uttrykk for ASE-spesifikke fluorescerende reporter gcy-5prom::gfp. GCY-5 er en chemoreceptor bare uttrykt i ASE høyre Nevron7. Lin-53 uttømming av RNAi og induksjon av bred ektopisk uttrykk av CHE-1 av varme-sjokk, kan bakterie celler konverteres til neurons i vivo4,5. Viktigere, er tidspunktet for RNAi behandling avgjørende som bare voksne ormene (P0 generasjon) utsatt for lin-53 RNAi gi opphav til F1 avkom dyr med en germline som er tillatte omprogrammere i neurons4.
Ovenfor beskrevet bakterie celle Nevron konvertering prosedyren i C. elegans kan brukes til å studere en rekke biologiske spørsmål som Implikasjonen av signalnettverk trasé i cellen skjebne omprogrammering. For eksempel, brukte vi den CHE-1-indusert bakterie cellen omprogrammering i ASE neurons på RNAi mot lin-53 for å studere Implikasjonen av hakket signalveien under bakterie celle omprogrammering8. Ved å utføre dobbel RNAi for å tømme co lin-53 og histone demethylase-koding genet utx-1 vi viste at hakket signalering veien motvirker PRC2-mediert genet silencing av uttrykket av UTX-1 i germline8 . Dette funnet viser at bakterie celle konvertering til neurons beskrevet i denne protokollen kan brukes til å studere en kompleks biologisk prosess som mobilnettet omprogrammering i en intakt organisme og i forbindelse med ulike utviklingsmessige og miljø forhold. Dessuten, det gir et perspektiv å utfordre bakterie celler ved å uttrykke over forskjellige skjebne-inducing TFs studere deres rolle i begrensningen av mobilnettet plastisitet9eller vurdere sitt potensial for å indusere omprogrammering av bakterie celler andre cellen typer i vivo.
Mens pattedyr vev kulturer tillater også studere ulike aspekter av cellen skjebne omprogrammering, har celler dyrket i kultur begrenset evne til å etterligne signalnettverk veien forhold sammenlignet en intakt organisme. Derfor er C. elegans en allsidig modell for undersøkelse av rollene som ulike biologiske prosesser som hakk signalering under omprogrammering i vivo. I tillegg er det en kraftig modell for genetisk skjermer som er relativt lett å vedlikeholde og genetisk endre for lave kostnader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone&#160;</td>
			<td>A. Hartenstein GmbH</td>
			<td>211 677</td>
			<td>Peptone Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1552,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck Biosciences</td>
			<td>208290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8866.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4275.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T875.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25,163,364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (5 N)</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>KK71.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>634412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2371.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick Scientific C24</td>
			<td>M1247-0052</td>
			<td>for heat-shock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>Sanyo MIR-5</td>
			<td>5534210</td>
			<td>for maintenance of worm strains at 15 &#176;C or 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Sensicam</td>
			<td>PCO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 
			promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse 
			III minus).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uracil auxotroph E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 
			3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lin-53</td>
			<td>SourceBioscience</td>
			<td>ID I-4D14</td>
			<td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>empty vetor: L4440</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>#1654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

Studere celle biologiske prosesser under konvertering identiteten til spesifikke celletyper gir viktig innsikt i mekanismen som opprettholde og beskytte mobilnettet identiteter. Konvertering av bakterie celler i bestemte nerveceller i Rundormer Caenorhabditis elegans (C. elegans) er et kraftig verktøy for å utføre genetiske skjermer for å analysere regulatoriske veier som sikre etablerte celle identiteter. Omprogrammere bakterie celler til en bestemt type av neurons kalt ASE krever transgene dyr at bredt over-uttrykk for Zn finger transkripsjon faktor (TF) CHE-1. Endogene CHE-1 uttrykkes i to hodet neurons og må angi glutamatergic ASE neurons skjebnen, som lett kan visualiseres reporteren gcy-5prom::gfp . En trans genet som inneholder den varme-shock promoter-drevet che-1 gen uttrykk konstruere kan bred mis uttrykk av CHE-1 i hele dyret på varme-sjokk behandling. Kombinasjonen av RNAi mot chromatin-regulere faktor LIN-53 og over-uttrykk for varme-sjokk-indusert che-1 fører til omprogrammering av bakterie celle i ASE Nevron-lignende celler. Vi beskriver her bestemt RNAi prosedyre og riktig forhold for varme-sjokk behandling av transgene dyr for å indusere vellykket bakterie celle til Nevron konvertering.

Som vist i figur 1, illustrerer F1 dyr som viser pvul fenotypen bruk av lin-53 RNAi. Disse dyrene er utsatt for tillater konvertering av bakterie celler inn ASE Nevron som cellene på varme-shock induksjon av che-1 over uttrykk som vist i figur 2. I motsetning til ormer som vokste på kontrollen tom vektor RNAi lin-53 RNAi behandling vil gi dyr som viser ektopisk GFP-signaler i midten av kroppen området etter varme-sjokk og 25 ° C inkubasjon overnatting som beskrevet tidligere4, 8. nærmere undersøkelse under en epifluorescence mikroskop av disse ormene avslører at cellene viser GFP signaler også vise Nevron-lignende anslag (figur 2B, hvite pilene) som er typiske for neuronal celler. Hvis RNAi mot lin-53 var ikke vellykket eller varme-shock forholdene var upassende vil GFP signalene ligne på de i kontrollen RNAi behandlede dyr (figur 2). Viktigere, unngå inducing over uttrykk for che-1 av varme induksjon før dyr nå midt L3 stadium. Dyr som var for ung på tiden av che-1 overuttrykte induksjon kan vise ektopisk gcy-5prom::gfp uttrykk i andre områder av kroppen som utvikler vulva som vist i Figur 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Figur 1: Pvul fenotypen forårsaket av RNAi mot lin-53. (Øverst) DIC bilde av L4 og unge voksne stadiet F1 avkom ormer avledet fra kontrollen eller lin-53 RNAi behandlet mødre. Skalere barer = 20 µm. (nederst) dyr behandlet med lin-53 RNAi skjerm utstående vulva (pvul) fenotypen (svart pilespisser). Pvul fenotypen bekrefter at RNAi mot lin-53 var vellykket. Skalere barer = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Figur 2: Ormer med vellykket omprogrammeres bakterie celle i nervecellene. (A) BAT28 belastning dyr dyrket på tom vektoren ikke Vis GFP signaler i germline etter varme-shock induksjon av che-1 overuttrykte. Hvit prikkelinje skisserer ormen. Skalere barer = 20 µm. (B) i motsetning til BAT28 belastning dyr dyrket på kontrollen tom vektor RNAi dyr dyrket på lin-53 RNAi vise gcy-5prom::gfp signaler i midten av kroppen området. Bilder av midt hoveddel med GFP signaler tatt på 63 X forstørrelse avsløre GFP-positive celler viser utstikkende deler (hvit pilespisser). Denne morfologiske angir at bakterie celler gjennomgikk konvertering i ASE Nevron-lignende celler. Hvite stjerner merke tarmen-avledet auto-fluorescens. Alle bilder ble kjøpt med en epifluorescence mikroskop med 20 X forstørrelse og 63 X forstørrelse. Hvit prikkelinje skisserer ormer. Skalere barer = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Figur 3: Tidlig stadium orm med ektopisk GFP. BAT28 belastning dyr dyrket på tom vektor RNAi bakterier som var varme-shock indusert for che-1 overuttrykte på tidlig larver stadier som L2 viser GFP signaler innen midten av kroppen (hvite stjerner). Disse signalene er ikke på grunn av bakterie celle omprogrammering. Hvit prikkelinje skisserer ormen. Skalere barer = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Bruk av RNAi og varme-sjokk-indusert transkripsjon faktor uttrykk å omprogrammere bakterie celler til nerveceller i C. elegans

Denne protokollen beskriver hvordan studere cellulære prosesser under cellen skjebne konvertering i Caenorhabditis elegans i vivo. Bruke transgene dyr, slik at varmen-shock promoter-drevet overuttrykte Nevron skjebne-inducing transkripsjon faktoren CHE-1 og RNAi-mediert uttømming av den chromatin-regulere faktor LIN-53 bakterie cellen til Nevron omprogrammering kan observeres i vivo.

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Bruk av Ugjennomtrengelige Barrierer Kombinert med Kandidat Factor Soaked perler å studere Induksjon Signaler i Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Romlig og tidsmessig analyse av Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Vurdere kardiomyocytt Subtyper Etter transkripsjonsfaktor-mediert omprogrammering av mus embryonale Fibroblaster

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardisert tilnærming til multispecies Rensing av mammaliske mannlige kimceller ved hjelp av mekanisk vævsdissosiasjon og flytcytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

C. elegans Excretory kanalen som modell for intracellulær Lumen Morphogenesis og I Vivo polarisert membran Biogenesis i en enkeltcelle: merking av GFP-fusjoner, RNAi interaksjon skjermen og bildebehandling

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans å analysere intracellulær Transport i nerveceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hemogenic endotelet differensiering fra Human Pluripotent stamceller i en mater-og Xeno-fri definert tilstand

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering av oksidativ skade i primær mus okulære overflateceller / stamceller som svar på ultrafiolett-C (UV-C) skade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...