Name: application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Agradecemos a Alina El-Khalili e Martina Hajduskova para obter assistência técnica. Agradecemos a membros do grupo jocelito para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi patrocinado pela ERC-StG-2014-637530 e ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 e é suportado pelo Max Delbrueck Center para Medicina Molecular na associação Helmholtz.

Todos os métodos descritos aqui com relação ao cuidado animal foram aprovados pela LaGeSo Berlim, Alemanha
1. preparação da solução
<ol>
	<li>Placas de ágar de NGM (1 L)
	<ol>
		<li>Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de mídia peptona (por exemplo, Bacto-peptona) e 20 g de ágar-ágar. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de colesterol (5) mg/mL em estoque de EtOH 95%, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1m K2PO4e 1 mL de anfotericina B (estoque de 2,5 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Placas de ágar-NGM RNAi (1 L)
	<ol>
		<li>Adicione 3 g de NaCl, 2,5 g de mídia peptona e 20 g de ágar-ágar. Após autoclavagem adicionar, 1 mL de colesterol (5) mg/mL em estoque de EtOH 95%, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4, 1 mL de anfotericina B (estoque de 2,5 mg/mL), 1 mL de 1 M IPTG e carbenicilina 1ml (50mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-ágar (1 L)
	<ol>
		<li>Adicionar 10 g de mídia de peptona, extrato de 5 g de fermento, 5 g de NaCl, 20 g de ágar-ágar, 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Adicionar O H2para 1 L. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de carbenicilina 50mg/mL e 2,5 mL de tetraciclina 5mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Meio LB (1 L)
	<ol>
		<li>Adicionar 10 g de mídia de peptona, extrato de 5 g de fermento, 5 g de NaCl e 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Adicionar O H2para 1 L. Após a autoclavagem, adicione 1 mL de carbenicilina 50 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-tampão (1 L)
	<ol>
		<li>Adicione 3 g de KH2PO46,0 g de Na2HPO4, 5g de NaCl e 50 mg de gelatina. Antes do uso, adicione 1 mL de 1 M MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Solução de branqueamento (10ml)
	<ol>
		<li>Adicione 1 mL de NaClO e 2 mL de NaOH de N 5. Adicione 10 mL H2O.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. preparação das placas de RNAi
Nota: C. elegans é normalmente cultivadas em laboratório em placas de Petri de 6cm contendo 7,5 mL de nematódeo crescimento médio ágar (ágar-NGM)10,11. Este protocolo é otimizado para vermes mantidas a 15 ° C. Para preparar pratos com NGM, use técnicas padrão estéril para evitar a contaminação bacteriana e fúngica. O seguinte é o protocolo para preparar pratos NGM suplementados com reagentes para RNAi.
<ol>
	<li>Prepare-se placas de ágar-NGM RNAi 6 cm contendo 1 mM isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 50 carbenicilina µ g/mL. Deixe-os secar por 24 – 48 h à temperatura ambiente no escuro12.
	<ol>
		<li>Mantenha as placas de RNAi a 4 ° C, no escuro. Não use se mais de 14 dias.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selecione o clone de bactérias (Escherichia coli HT115) de RNAi contendo o plasmídeo L4440 com a sequência de DNA do gene de lin-53 do estoque congelado glicerol do disponível biblioteca RNAi13 em placas LB-ágar contendo 50 µ g/mL carbenicilina e 12,5 µ g/mL tetraciclina, usando o padrão de estrias trifásico. Crescem as bactérias em 37 ° C durante a noite12. Este clone permite a produção de IPTG-dependente de lin-53 dsRNA nas bactérias.
	<ol>
		<li>Além disso, crescem as bactérias de RNAi que contêm o plasmídeo L4440 sem qualquer sequência de genes, como o de controle de vetor vazio14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>No dia seguinte, escolher uma única colônia de lin-53 ou placas de vetor vazio LB-ágar usando uma pipeta de 200 µ l de ponta e inocular cada um em um tubo de cultura separada contendo 2 mL de líquido LB médio14 suplementado com 50 carbenicilina µ g/mL. Cultivar culturas durante a noite a 37 ° C até atingirem uma densidade óptica (OD) em 600 nm de 0.6-0.8. Medir o OD usando um espectrofotômetro15. Cuidado: A líquido LB mídia não deve conter tetraciclina em contraste com a placa de ágar LB usada para estrias as bactérias a partir do estoque de glicerol, desde a inclusão de tetraciclina durante a alimentação leva a uma diminuição de eficiência de RNAi 12</li>
	<li>Adicione 500 µ l de cada cultura bacteriana (lin-53 ou vetor vazio) para placas de ágar-NGM RNAi 6cm usando um multipipette. Incube as placas com uma tampa fechada durante a noite à temperatura ambiente no escuro para secar. Durante este tempo, o IPTG nas placas de NGM vai induzir a produção de dsRNA nas bactérias.
	<ol>
		<li>Use pelo menos 3 pratos por cultura bacteriana por experiência. Isto irá fornecer técnicas 3 repetições para cada experimento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Loja secas NGM-agar RNAi placas com bactérias a 4 ° C, no escuro por até duas semanas.</li>
</ol>
3. preparação de BAT28 de tensão de c. elegans
<ol>
	<li>Manter a tensão de verme BAT288 contendo os transgenes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] e ntIs1 [gcy-5prom::gfp] sobre as bactérias OP50 usando placas de ágar-NGM padrão a 15 ° C. Nota: Para protocolo detalhado na cultura de nematoides, consulte10. O rol-6(su1006) é um alelo dominante e comumente usado injeção fenotípica marcador16 que provoca o movimento de rolamento típico. É usado para rastrear no transgene otIs305 hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Manter a tensão de BAT28 a 15 ° C em todos os momentos para evitar ativação precautious do hsp-16.2prom::che-1 transgene. Reduza a exposição a temperaturas superiores a 15 ° C enquanto a tensão o máximo possível de manipulação.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para idade-sincronizar vermes, use a técnica branqueamento17.
	<ol>
		<li>Lave pratos de 6 cm NGM-ágar contendo adultos e ovos de BAT28 usando 900 µ l M9 buffer. Vermes de pelota por centrifugação a 900 x g por 1 min. Retire o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar 0,5 – 1 mL de solução de branqueamento e agitar o tubo para aproximadamente 1 min até vermes adultos começam a estourar aberto. Monitor usando um microscópio estereoscópico padrão.</li>
		<li>Vermes de pelota por centrifugação a 900 x g por 1 min. Retire o sobrenadante.</li>
		<li>Lave o pellet worm 3 vezes adicionando 800 µ l de tampão de M9 e centrifugação a 900 x g.</li>
		<li>Coloque os ovos limpos em NGM-pratos frescos, inoculados com bactérias OP50. Cresce uma população branqueada em bactérias OP50 a 15 ° C, até atingirem o estágio de L4 (cerca de 4 dias). As larvas L4 podem ser reconhecidas por um remendo branco aproximadamente na metade do caminho ao longo do lado ventral do worm18 usando um microscópio estereoscópico padrão. Nota: Para atingir as células germinativas ao fenótipo de conversão neurônio após esgotamento de lin-53, ele precisa estar esgotado na geração parental (P0).</li></ol></li></ol>O placar para o fenótipo de conversão é realizado na geração seguinte (filial geração F1). Para atingir o empobrecem lin-53 já no P0, L4 animais são submetidos a RNAi.
	
	
	<li>Manualmente transferi 50 L4 palco vermes por replicar usando um fio de platina para uma placa NGM que não contêm qualquer bactéria e deixe vermes afastar qualquer bactéria OP50 transferidas. Vamos vermes na chapa durante cerca de 5 minutos. Bactérias de uso das placas RNAi NGM-ágar previamente inoculado com bactérias de RNAi lin-53 (ou controle de vetor vazio) para transferir para as respectivas placas de RNAi.
	<ol>
		<li>Evite transferir bactérias OP50 para as placas de RNAi reais. Trabalho rápido para minimizar o tempo de exposição da estirpe de temperaturas superiores a 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incube vermes em placas de ágar-NGM RNAi a 15 ° C por aproximadamente 7 dias até F1 progênie dos vermes atinge L3-L4 palco. Eles podem ser claramente separados dos animais P0 desde que eles são maiores e mais espessas do que a progênie F1.
	<ol>
		<li>Verifique visualmente sob um estereomicroscópio padrão se vermes de progênie F1 mostram o fenótipo salientes de vulva (pvul), como mostrado na Figura 1. RNAi contra lin-53 tem efeitos pleiotrópicos e faz com que o fenótipo de pvul que pode ser usado para avaliar se o RNAi contra lin-53 tem sido bem sucedida. Nota: RNAi contra lin-53 também pode causar letalidade de embriões de F1. Este efeito aumenta se as placas estão expostas a graus mais elevados do que 15 ° C antes de animais chegaram a L3-L4 fase. Os embriões mortos podem ser reconhecidos por desenvolvimento preso e falta de incubação.</li>
		<li>Incube as placas no escuro desde IPTG é sensível à luz.</li>
	</ol>
	</li>

4. indução de reprogramação de células germinativas
<ol>
	<li>Incubar as placas de RNAi examinadas contendo lin-53 e esvaziar vetor F1 tratados com RNAi progênie por 30 min a 37 ° C, no escuro para ativar-1. Use uma incubadora ventilada desde que permite um calor-choque mais eficiente.</li>
	<li>São permitidos animais de calor-choc recuperar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro e então incubar as placas a 25 ° C durante a noite, no escuro.</li>
	<li>Usando um estereomicroscópio padrão acoplado a uma fonte de luz de fluorescência, examinar os animais sob o filtro GFP para gcy-5prom::gfp-derivado sinais na área dos vermes de corpo médio, como mostrado na Figura 2. Conjunto de microscópio para sinais GFP: excitação máxima em 488 nm com emissão máxima de 509 nm.</li>
	<li>Avalie o grau de células germinativas para conversão do neurônio por animais de montagem com sinais de boas práticas agrícolas na área de meio corpo no ágar contendo almofada microscopia slides19.
	<ol>
		<li>Conte o número de animais mostrando as células germinativas para conversão de neurônio vs os animais escuros para avaliar a penetrância de fenótipo. Normalmente, ao redor 30% dos animais mostram sinais discretos de GFP no germline ao esgotamento de lin-53 , Considerando que não mais de 5% dos animais mostram sinais GFP difusos no germline ao vetor vazio RNAi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li><li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+barriers+and+enhancers:+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency.">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li><li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. 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Os autores declararam que não há interesses concorrentes existem.

Enquanto o protocolo descrito usando os transgênicos c. elegans Coe BAT28 e RNAi contra lin-53 é simples, várias etapas são críticas em ordem para garantir o resultado esperado de células germinativas para reprogramação do neurônio. É importante que a tensão BAT28 é mantida a 15 ° C, em todos os momentos antes dos experimentos. Durante a manipulação e manutenção da tensão, o tempo em temperaturas acima de 15 ° C precisa ser minimizada tanto quanto possível. Condições de calor-choque adequada são importantes pois insuficiente indução de -1 superexpressão não resultará em células germinativas para conversão de neurônio ASE. Isto pode ser detectado medindo-se a penetrância fenótipo conforme descrito no protocolo. Calor-choque extensa pode levar a letalidade dos animais. Por exemplo, placas que foram colocadas perto de paredes internas ou no chão de uma incubadora de ar estática inferior frequentemente experimentam extensa de tratamento térmico. Portanto, é recomendável usar uma incubadora de calor ventilado. Além disso, timing da indução calor-choque é crítico desde sobre-expressão do -1 durante estágios larvas mais cedo então L3 pode levar a indução de gravidez ectópica gcy-5prom::gfp em regiões diferentes do corpo, tais como a vulva (Figura 3) 9. Além disso, calor-choque extensa pode ser detectada pela penetrância de fenótipo em animais de RNAi vetor vazio, que não deve estender a 5% e aumento de autofluorescência de outros tecidos, ou seja, o intestino.
Esporadicamente, RNAi bactérias podem perder sua atividade para produzir eficientemente dsRNA do gene do alvo. Infelizmente, isto não pode ser detectado antes do experimento de RNAi. Em tais casos uma raia fresca do glicerol deve ser cultivada como descrito na secção 2 do protocolo. Se houver ainda não causado por RNAi pleiotrópicos fenótipo visível, tais como o fenótipo pvul causada pelo sucesso RNAi contra lin-53, então um plasmídeo isolamento do DNA da bactéria respectivos deve ser executado e fresco HT115 bactérias precisam ser transformadas com o plasmídeo L4400 que contém a sequência de lin-53 .
Importante, a tensão de BAT28 tem um o fenótipo de rolo causado pela injeção marcador pRF4, que foi utilizada durante a transgênese dos animais com o hsp-16.2prom::che-1 construção de DNA. Ocasionalmente, os animais perdem o fenótipo de rolamento, que pode indicar o silenciamento do hsp-16.2prom::che-1 transgene. Para manter corretamente a tensão BAT28, escolher 10 animais de rolo para um prato fresco e propagar selecionando para rolar os animais.
A aplicação do protocolo é limitada para o procedimento de RNAi F1, que significa que os animais cujos pais (geração de P0) não tem sido expostos a lin-53 RNAi não mostrará células germinativas para conversão de neurônio devido resgate materno4. Um procedimento alternativo para converter as células germinativas em neurônios tem sido descrito por Ciosk e colegas15 usando RNAi knock-down de gld-1 e 3-mex sem sobre-expressão de um fator de transcrição. No entanto, os neurônios obtidos não pertencem a um tipo específico de neurônios e células germinativas também converter em células de músculo, como após mediada por RNAi depleção de gld-1 e mex-315. Anteriormente, foi demonstrado o RNAi contra lin-53 permitiu a conversão de células germinativas, em células gabaérgica neurônio após sobre-expressão do factor de transcrição de homoedomain de Pitx-tipo UNC-3016 em vez de-14 . Para direções futuras, transcrição de destino de indução diferente fatores podem ser testados se lin-53 depleção de células germinativas pode ser convertida em outros tipos de células do que neurônios específicos. Neste contexto, a superexpressão do factor de transcrição bHLH miogênico HLH-1, homólogo dos mamíferos MyoD17, induz a conversão de células germinativas de músculos sobre lin-53 RNAi5. A reprogramação estabelecida de células germinativas para um tipo específico de células somáticas sobre lin-53 RNAi e sobre-expressão de um fator de transcrição indutora de destino apropriado pode ser usada para um número de diferentes telas de genéticas. Essas telas supressor ou potenciador podem ajudar dissecando regulamentares vias que desempenham um papel durante a conversão de destino da célula.

Célula de destino reprogramação pela expressão ectópica de TF como o miogênico TF MyoD, que, quando overexpressed, fibroblastos convertidos diretamente em células musculares1, tem sido um foco de pesquisa há décadas. No entanto, células diferenciadas são muitas vezes refratárias para este processo, devido a mecanismos que salvaguardar a sua identidade celular. Células germinativas mostrar um grau de proteção similar e existem mecanismos subjacentes que muitas vezes agem como uma barreira para impedir a conversão de células germinativas em outros tipos de células a sobre-expressão de um destino de indução TF. Normalmente, o Regulamento epigenético como modificações do histone e estrutura da cromatina impõe um impedimento para a conversão da célula destino2,3. Temos anteriormente aplicada a genética reversa usando RNAi knock-downs em c. elegans e identificou fatores que salvaguardar identidades celulares e, assim, neutralizar a reprogramação das células germinativas em neurônios4. Especificamente, o polycomb 2 complexo repressivas (PRC2) e o acompanhante de histona altamente conservadas LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 em humanos) impedem a conversão direta de células germinativas em tipos específicos de células somáticas como neurônios de sabor glutamatérgico em c. elegans 4 , 5. para identificar essas células germinativas reprogramação fatores barreira, usamos animais transgénicos, carregando o calor-choque inducible Zn-dedo CHE TF-1. -1 é normalmente expressa em dois neurônios cabeça de c. elegans, onde especifica que o destino dos neurônios de sabor glutamatérgico denominado ASE6. O destino de neurônio ASE pode ser visualizado pela expressão do ASE específico fluorescente repórter gcy-5prom::gfp. GCY-5 é um chemoreceptor apenas expressado em ASE certo neurônio7. Após o esgotamento de lin-53 por RNAi e indução de ampla expressão ectópica de-1 por calor-choque, as células germinativas pode ser convertidas em neurônios na vivo4,5. Importante, sincronismo de RNAi tratamento é crucial como único adultos vermes (geração de P0) expostos a lin-53 RNAi dão origem a animais de progênie F1 com uma linha germinativa que é permissiva para reprogramação em neurônios4.
As células germinativas descritas acima para o procedimento de conversão neurônio em c. elegans pode ser usada para estudar uma variedade de questões biológicas como a implicação de sinalização de caminhos na célula destino reprogramação. Por exemplo, usamos a célula germinal 1-induzida reprogramação em neurônios de ASE em cima de RNAi contra lin-53 para estudar a implicação do entalhe sinalização via processo de reprogramação8de células germinativas. Através da realização de RNAi duplo para co empobrecem lin-53 e o histona demetilase-codificação gene utx-1 , mostramos que o entalhe sinalização via neutraliza o silenciamento de genes mediada por PRC2, ativando a expressão de UTX-1 no germline8 . Esta constatação demonstra que a conversão de células germinativas de neurônios descrito neste protocolo poderia ser usada para estudar um processo biológico complexo como reprogramação celular em um organismo intacto e no contexto de diferentes do desenvolvimento e ambiente condições. Além disso, ele fornece a perspectiva para desafiar as células germinativas expressando excesso diferente destino indutor do TFs para estudar o seu papel na restrição da plasticidade celular9, ou para avaliar o seu potencial para induzir a reprogramação das células germinativas para vivo emos tipos de outras células.
Enquanto culturas de tecidos de mamíferos também permitem estudar os diferentes aspectos da célula destino reprogramação, crescidas em cultura de células têm limitado a capacidade de imitar as condições de via sinalização comparadas a um organismo intacto. Portanto, c. elegans é um modelo versátil para exame dos papéis de vários processos biológicos, tais como o entalhe de sinalização durante a reprogramação na vivo. Além disso, é um poderoso modelo para telas genéticas que é relativamente fácil de manter e modificar geneticamente para baixos custos.

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		<tr>
			<td>Chemicals&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone&#160;</td>
			<td>A. Hartenstein GmbH</td>
			<td>211 677</td>
			<td>Peptone Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1552,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck Biosciences</td>
			<td>208290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8866.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4275.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T875.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25,163,364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (5 N)</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>KK71.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>634412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2371.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick Scientific C24</td>
			<td>M1247-0052</td>
			<td>for heat-shock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>Sanyo MIR-5</td>
			<td>5534210</td>
			<td>for maintenance of worm strains at 15 &#176;C or 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Sensicam</td>
			<td>PCO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 
			promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse 
			III minus).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uracil auxotroph E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 
			3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lin-53</td>
			<td>SourceBioscience</td>
			<td>ID I-4D14</td>
			<td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>empty vetor: L4440</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>#1654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

Estudar os processos biológicos de célula durante a conversão as identidades dos tipos de célula específica fornece insights importantes sobre mecanismo que mantêm e proteger a identidade celular. A conversão de células germinativas em neurônios específicos no nemátode Caenorhabditis elegans (c. elegans) é uma ferramenta poderosa para executar telas genéticas para dissecar vias regulamentares que salvaguardar as identidades celulares estabelecidas. Reprogramação de células germinativas para um tipo específico de neurônios, denominado ASE requer animais transgénicos que permitem ampla sobre-expressão da transcrição Zn-dedo fator (TF)-1. -1 endógena é expresso exclusivamente em dois neurônios cabeça e é necessária para especificar o destino de neurônios glutamatérgico ASE, que pode ser facilmente visualizado pelo repórter gcy-5prom::gfp . Um gene trans contendo a calor-choque orientada por promotor -1 gene expressão construção permite ampla expressão mis de-1 no animal todo tratamento de choque do calor. A combinação de RNAi contra o fator de cromatina-regulação LIN-53 e sobre-expressão induzida por calor-choque -1 leva a reprogramação das células germinativas, em células neurônio ASE. Descrevemos aqui o procedimento específico de RNAi e condições adequadas para o tratamento de choque do calor de animais transgénicos para induzir com sucesso células germinativas para conversão do neurônio.

Como mostrado na Figura 1, F1 animais que apresentam o fenótipo pvul ilustram a aplicação bem sucedida de lin-53 RNAi. Estes animais são propensos a permitir a conversão de suas células germinativas, em células de neurônio como ASE após a indução de calor-choque de sobre-expressão -1 , conforme ilustrado na Figura 2. Em contraste com os vermes que cresceram no controle vazios vector RNAi lin-53 RNAi tratamento irá produzir animais que exibem GFP-sinais de gravidez ectópica na área de meio do corpo depois de choque do calor e incubação de 25 ° C durante a noite como descrito anteriormente4, 8. exame sob um microscópio de epifluorescência destes vermes revela que as células mostrando sinais GFP também exibem neurônio-como projeções (Figura 2B, setas brancas) que são típicas de células neuronais. Se RNAi contra lin-53 não foi bem sucedida ou calor-choque condições eram inadequadas sinais GFP serão semelhante aos de controle RNAi animais tratados (Figura 2). Importante, evite induzir sobre-expressão do -1 por indução de calor, antes que os animais atinjam meado fase L3. Animais que foram muito jovens no momento da indução de superexpressão de -1 podem exibir expressão ectópica gcy-5prom::gfp em outras regiões do corpo, como a vulva em desenvolvimento, como mostrado na Figura 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Figura 1: Pvul fenótipo causado por RNAi contra lin-53. (Topo) Imagens DIC de vermes de progênie L4/jovem adulto fase F1 derivado controle ou lin-53 mães de RNAi Tratado. Escala de barras = 20 µm. (fundo) os animais tratados com lin-53 RNAi exibir o fenótipo saliente da vulva (pvul) (cabeça de seta preta). O fenótipo pvul confirma que a RNAi contra lin-53 foi bem sucedida. Escala de barras = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Figura 2: Worms com reprogramadas com sucesso células germinativas em neurônios. (A) animais de estirpe BAT28 crescidos sobre o vetor vazio não mostram sinais GFP no germline após a indução de calor-choque de superexpressão de -1 . Linha branca tracejada descreve worm. Escala de barras = 20 µm. (B) em contraste com os animais de estirpe BAT28 crescidos sobre o controle de vetor vazio RNAi animais cultivados na lin-53 RNAi exibir sinais de gcy-5prom::gfp na área de meio corpo. Fotos da seção de corpo médio, com sinais GFP tiradas na ampliação de X 63 revelaram células GFP-positivo, mostrando as saliências (cabeça de seta branca). Esta característica morfológica indica que as células germinativas passou por conversão em células neurônio ASE. Asteriscos brancos marcam autofluorescência derivado de intestino. Todas as imagens foram adquiridas utilizando um microscópio de epifluorescência com 20 X ampliação e ampliação de X 63. Linha branca tracejada descreve vermes. Escala de barras = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Figura 3: Worm de fase precoce com GFP ectópica. Animais de estirpe BAT28 crescidos sobre a bactéria de RNAi vetor vazio que estava calor-choque induzido por -1 superexpressão em estágios larvais iniciais como L2 mostram sinais de boas práticas agrícolas na área de meio corpo (brancos asteriscos). Estes sinais não são devido a reprogramação de células germinativas. Linha branca tracejada descreve worm. Escala de barras = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Este protocolo descreve como estudar processos celulares durante a conversão de destino célula em Caenorhabditis elegans in vivo. Usar animais transgénicos, permitindo que o calor-choque orientada por promotor superexpressão do factor de transcrição destino indutor de neurônio-1 e mediada por RNAi depleção da cromatina-regulação fator LIN-53 células germinativas para reprogramação do neurônio pode ser observado na vivo.

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Biologia do Desenvolvimento

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Espaciais e temporais Análise do Active ERK na<em&gt; C. elegans</em&gt; germinativa

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

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The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

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