Name: application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Мы благодарим Алина Эль-Халили и Мартина Hajduskova для оказания технической помощи. Мы благодарим членов группы Турсун для комментариев по рукописи. Эта работа была авторами КЧП-StG-2014-637530 и КЧП CIG PCIG12-GA-2012-333922 и поддерживается Delbrueck центр Макса для молекулярной медицины в Гельмгольца.

Все методы, описанные здесь, что касается ухода за животными были одобрены LaGeSo Берлин, Германия
1. решение подготовка
<ol>
	<li>NGM-агар пластин (1 Л)
	<ol>
		<li>Добавьте 3 g NaCl, 2.5 g Пептон СМИ (например, Bacto-Пептон) и 20 г агара. После автоклавирования, добавьте 1 mL холестерина (5 мг/мл в наличии EtOH 95%), 1 мл 14M MgSO, 1 мл 1 M CaCl2, 25 мл 1 М K2PO4и 1 мл амфотерицин B (2,5 мг/мл бульона).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM-агар RNAi пластин (1 Л)
	<ol>
		<li>Добавьте 3 g NaCl, 2.5 g Пептон СМИ и 20 г агара. После автоклавирования добавьте, 1 мл холестерин (5 мг/мл в наличии EtOH 95%), 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл 1 M CaCl2, 25 мл 1 M K2PO4, амфотерицин B (2,5 мг/мл бульона) 1 мл, 1 мл 1 м IPTG и carbenicillin 1 мл (50мг/мл).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-агар (1 Л)
	<ol>
		<li>Добавить 10 g Пептон СМИ, 5 г дрожжей экстракт, 5 г NaCl, 20 г агара, 10 мл 1 М трис рН 8.0. Добавление H2O до 1 л. После автоклавирования добавляют 1 мл 50 мг/мл carbenicillin и 2,5 мл 5 мг/мл тетрациклина.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB среднего (1 Л)
	<ol>
		<li>Добавить 10 g Пептон СМИ, 5 г дрожжей экстракт, 5 г NaCl и 10 мл 1 М трис рН 8.0. Добавление H2O до 1 л. После автоклавирования добавляют 1 мл 50 мг/мл carbenicillin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-буфера (1 Л)
	<ol>
		<li>Добавьте 6,0 g Na2HPO4, 3 g2PO х4, 5 г NaCl и 50 мг, желатина. Перед использованием добавьте 1 mL 1 М MgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Отбеливающий раствор (10 мл)
	<ol>
		<li>Добавьте 1 mL NaClO и 2 мл 5 N NaOH. Добавьте 10 мл H2O.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Подготовка RNAi пластин
Примечание: C. elegans обычно культивировали в лаборатории на 6 см пластины Петри, содержащие 7,5 мл нематода роста среднего агар (НГМ-агар)10,11. Этот протокол оптимизирован для червей, держал при 15 ° C. Для подготовки пластины с NGM, используйте стандартные методы стерильные для предотвращения грибковые и бактериальные загрязнения. Ниже приведен протокол подготовить NGM пластины дополнена реагентов для RNAi.
<ol>
	<li>Подготовка 6-см NGM-агар RNAi пластины, содержащие 1 мм изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) и 50 мкг/мл carbenicillin. Дайте им высохнуть в течение 24-48 ч при комнатной температуре в темной12.
	<ol>
		<li>Держите RNAi пластины на 4 ° C в темноте. Не используйте, если старше 14 дней.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Выберите клон RNAi бактерий (Escherichia coli HT115), содержащие L4440 плазмиду с последовательности ДНК гена Лин-53 из замороженных глицерин запасов имеющихся RNAi библиотека13 на плиты LB-агара, содержащие 50 мкг/мл carbenicillin и 12,5 мкг/мл тетрациклин, используя три фазы штриховая шаблона. Рост бактерий при 37 ° C ночь12. Этот клон позволяет IPTG-зависимых производства Лин-53 двуцепочечной ДНК бактерий.
	<ol>
		<li>Кроме того растут RNAi бактерий, которые содержат плазмида L4440 без каких-либо последовательность гена как пустой вектор управления14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Следующий день, выбрать один колонии от Линь-53 или пустой вектор LB-агар пластины с помощью пипетки 200 мкл наконечник и прививать каждого из них в отдельной культуры трубка, содержащая 2 мл жидких LB средние14 дополнена 50 мкг/мл carbenicillin. Расти культур на ночь при 37 ° C до тех пор, пока они достигают оптической плотности (OD) на 600 Нм 0,6 — 0,8. Измерьте с помощью спектрофотометра15OD. Предупреждение: Жидкий LB СМИ не должны содержать Тетрациклин в отличие от пластину LB-агар используется для полос бактерии из глицерина запасов, поскольку включение тетрациклин во время кормления приводит к снижению эффективности RNAi 12</li>
	<li>500 мкл каждого бактериальной культуры (Лин-53 или пустой вектор), до 6 см NGM-агар RNAi пластины с помощью multipipette. Инкубируйте пластины с закрытой крышкой на ночь при комнатной температуре в темноте, чтобы высушить. В это время IPTG NGM пластины будет стимулировать производство двуцепочечной ДНК бактерий.
	<ol>
		<li>Используйте по крайней мере 3 пластины на бактериальной культуры за эксперимент. Это обеспечит что 3 технических реплицирует для каждого эксперимента.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Храните сушеные NGM-агар RNAi пластины с бактериями при температуре 4 ° C в темноте на срок до двух недель.</li>
</ol>
3. Подготовка C. elegans штамм BAT28
<ol>
	<li>Поддерживать нагрузку червь BAT288 , содержащий трансгенов otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] и ntIs1 [gcy-5prom::gfp] на ОР50 бактерии, используя стандартные плиты NGM-агара при 15 ° C. Примечание: Для подробного протокола на нематод культуры, см.10. Rol-6(su1006) является доминирующей аллелей и широко используется маркер фенотипические инъекции16 , что вызывает типичные подвижного движения. Он используется в otIs305 трансген для отслеживания hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Держите, BAT28 деформации при 15 ° C в любое время для того, чтобы предотвратить предусмотрительный активации hsp-16.2prom::che-1 трансген. Уменьшение воздействия температура выше 15 ° C при обработке штамм насколько это возможно.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Возраст-синхронизировать червей, используйте отбеливающие техника17.
	<ol>
		<li>Смыть пластины 6 см NGM-агар, содержащие взрослых и яйца BAT28 с использованием 900 мкл буфера M9. Пелле червей центрифугированием при 900 x g за 1 мин удалить супернатант.</li>
		<li>Добавить 0,5 – 1 мл отбеливания решение и встряхнуть трубки для примерно 1 мин до взрослых червей начала трескаться открытым. Монитор с помощью стандартного стереомикроскопом.</li>
		<li>Пелле червей центрифугированием при 900 x g за 1 мин удалить супернатант.</li>
		<li>Вымойте червь гранулы 3 раза, добавляя 800 мкл буфера M9 и центрифугирование в 900 x g.</li>
		<li>Место очищенные яйца на свежие NGM-плиты семенами с ОР50 бактериями. Растут отбеленной населения на ОР50 бактерий при 15 ° C до тех пор, пока они достигают стадии L4 (около 4 дней). L4 личинки могут быть признаны белое пятно, примерно на полпути вдоль вентральной стороне червь18 с помощью стандартного стереомикроскопом. Примечание: Для достижения зародышевых клеток в нейрон преобразования фенотип после истощения Лин-53, необходимо быть исчерпаны в родительского поколения (P0).</li></ol></li></ol>Очки для преобразования фенотип осуществляется в следующем поколении (филиал поколения F1). Для достижения разрушающим Лин-53 уже в P0, L4 животных подвергаются RNAi.
	
	
	<li>Перенос вручную 50 L4 стадии червей на репликацию, используя провод платины NGM пластины которые не содержат каких-либо бактерий и пусть черви отойти от любых передаваемых ОР50 бактерий. Пусть червей перейти на пластине около 5 минут. Использование бактерий из плит NGM-агар RNAi ранее семенами с Лин-53 RNAi бактерий (или пустой вектор управления) для передачи соответствующих RNAi пластины.
	<ol>
		<li>Избегайте передачи ОР50 бактерий к фактической RNAi пластины. Работать быстро, чтобы свести к минимуму время экспозиции деформации при температуре выше 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Инкубируйте червей на NGM-агар RNAi пластины при 15 ° C приблизительно за 7 дней до L3-L4 стадии потомства F1 червей. Они могут быть четко отделен от P0 животных, так как они больше и толще, чем потомства F1.
	<ol>
		<li>Визуально проверьте под стандартный стереомикроскопом ли черви потомства F1 Показать выступающих фенотип вульвы (pvul), как показано на рисунке 1. RNAi против Лин-53 имеет Плейотропный эффект и вызывает pvul фенотип, который может использоваться для оценки ли RNAi против Лин-53 был успешным. Примечание: RNAi против Лин-53 может также вызвать летальность F1 эмбрионов. Этот эффект увеличивается, если пластины подвергаются более, чем 15 ° C градусов до животных L3-L4 стадию. Мертвых эмбрионов могут быть признаны арестован развития и отсутствием штриховкой.</li>
		<li>Инкубируйте пластины в темноте, поскольку IPTG светочувствительный.</li>
	</ol>
	</li>

4. индукция перепрограммирования клетки семенозачатка
<ol>
	<li>Инкубировать проанализировать RNAi пластины, содержащих Лин-53 и пустой вектор RNAi лечение F1 потомства для 30 минут при 37 ° C в темноте, чтобы активировать ЧЕ-1. Используйте вентилируемые инкубатор, так как он позволяет для более эффективного теплового шока.</li>
	<li>Позвольте тепло шокирован животных, чтобы восстановить в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте и затем инкубировать пластины при 25 ° C ночью в темноте.</li>
	<li>Используя стандартный стереомикроскопом сочетании к источнику света флуоресцирования, изучение животных под GFP фильтр для gcy-5prom::gfp-полученных сигналов в области середины тела червей, как показано на рисунке 2. Набор микроскоп для GFP сигналов: возбуждения максимум в 488 нм с выбросов максимум в 509 Нм.</li>
	<li>Оцените степень зародышевых клеток нейрон преобразования путем монтажа животных с GFP сигналов в области середины тела на агаре pad содержащих микроскопии слайды19.
	<ol>
		<li>Подсчитать количество животных, показаны зародышевых клеток для преобразования нейрон против темных животных, чтобы оценить фенотип пенетрантностью. Как правило около 30% животных показывают дискретных сигналов GFP микрофлорой после истощения Лин-53 , в то время как не более чем 5% животных показывают диффузных GFP сигналов в микрофлорой на пустой вектор RNAi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li><li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+barriers+and+enhancers:+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency.">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li><li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-Dependent+Heterochromatin:+Barrier+to+Cell+Fate+Changes.">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li><li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types.">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li><li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types.">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li><li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron.">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653 (2007).</li><li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li><li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons.">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity.">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100 (2017).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenorhabditis+Elegans.">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).</li><li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li><li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein.">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li><li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm.">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li><li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++.">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+biology.">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li></ol>

Авторы заявили, что существует не конкурирующие интересы.

Во время описанных протокол, с помощью трансгенных C. elegans штамм BAT28 и интерференции против Лин-53 проста, ряд шагов важны в порядке обеспечить ожидаемый результат зародышевых клеток для перепрограммирования нейрона. Важно, что штамм BAT28 хранится при температуре 15 ° C во все времена до экспериментов. Во время обработки и обслуживания штамма время при температуре выше 15 ° C необходимо свести к минимуму, насколько это возможно. Надлежащего теплового шока условия имеют важное значение, поскольку недостаточной индукции гиперэкспрессия ЧЕ-1 не приведет к зародышевых клеток ASE нейрон преобразования. Это могут быть обнаружены путем измерения фенотип пенетрантностью, как описано в протоколе. Обширные тепло шок может привести к летальность животных. К примеру пластины, которые были размещены вблизи внутренние стены или на основании нижней инкубатора статического воздуха часто опыт обширной термической обработки. Поэтому рекомендуется использовать инкубатор вентилируемые тепла. Кроме того сроки теплового шока индукции имеет решающее значение с гиперэкспрессия ЧЕ-1 личиночных стадиях раньше то L3 может привести к внематочной gcy-5prom::gfp индукции в регионах разные тела, таких как вульвы (рис. 3) 9. Кроме того, обширные теплового шока могут быть обнаружены по фенотипу пенетрантностью в пустой вектор RNAi животных, которые не должны распространяться 5% и увеличение auto флуоресценции других тканей, а именно ЖКТ.
Спорадически RNAi бактерий может потерять свою деятельность эффективно производить двуцепочечной ДНК гена целевого объекта. К сожалению это не может быть обнаружены до эксперимента RNAi. В таких случаях следует выращивать свежие полоска из глицерина как описано в разделе 2 протокола. Если есть должны быть выполнены до сих пор не вызвало RNAi плейотропный фенотип видимым, такие, как pvul фенотип вызванные успешных RNAi против Лин-53, затем плазмида ДНК изоляции от соответствующих бактерий и свежие HT115 бактерии должны быть преобразовано с L4400 плазмиды, содержащий последовательность Лин-53 .
Важно отметить, что штамм BAT28 имеет фенотип ролика, вызванные инъекции маркер pRF4, который был использован во время трансгенез животных с hsp-16.2prom::che-1 ДНК конструкции. Иногда животные теряют подвижного фенотип, который может указывать глушителей из hsp-16.2prom::che-1 трансген. Должным образом поддерживать BAT28 штамма, выбрать 10 животных ролик свежие пластины и распространять выбор для трубопрокатного животных.
Применение протокола ограничивается F1 RNAi процедура, которая означает, что животные (P0 поколения), родители которых не были подвержены Лин-53 интерференции не будет показывать зародышевых клеток нейрон преобразования благодаря материнской спасения4. Альтернативная процедура для преобразования зародышевые клетки нейронов был описан Ciosk и коллеги15 с использованием RNAi НОК Даун gld-1 и mex-3 без Гиперэкспрессия транскрипционного фактора. Однако полученные нейроны не принадлежат к определенному типу нейронов и клетки семенозачатка также преобразовать в мышцы подобных клеток после истощения, опосредованного системой РНК-интерференции, ООВ-1 и mex-3-15. Ранее, было продемонстрировано RNAi против Лин-53 допускается преобразование клеток зародыша в ГАМК нейроноподобных клеток после Гиперэкспрессия транскрипционного фактора Pitx типа в homoedomain16 UNC-30 вместо ЧЕ-14 . Для будущих направлений разные судьбы заставить транскрипции, протестированных факторы могут быть ли Лин-53 истощены зародышевые клетки могут быть преобразованы в другие типы клеток, чем конкретные нейронов. В этом контексте Гиперэкспрессия транскрипционного фактора миогенных bHLH HLH-1, дрозофила гомолога млекопитающих мёд17, вызывает преобразование зародышевых клеток мышцы по Лин-53 RNAi5. Установленным перепрограммирования клетки семенозачатка определенного количества соматических клеток типа по Лин-53 RNAi и Гиперэкспрессия соответствующие вызывая судьба транскрипционного фактора может использоваться для целого ряда различных генетических экранов. Такие экраны супрессор или усилитель может помочь рассекает нормативные пути, которые играют роль во время преобразования судьбу клеток.

Клетки, судьба перепрограммирования внематочная TF выражением таких миогенных TF мёд, который, когда оверэкспрессировали, фибробласты преобразует непосредственно в мышцы подобных клеток1, был фокус исследования на протяжении десятилетий. Однако дифференцированных клеток часто являются тугоплавкие в этот процесс, за счет механизмов, которые защищают их клеточных личности. Зародышевые клетки показывают ту же степень защиты и есть основные механизмы, которые часто выступают как барьер, чтобы предотвратить зародышевых клеток преобразование в другие типы клеток после гиперэкспрессия вызывая судьба-TF. Как правило эпигенетических регулирование, например изменения гистона и структура хроматина налагает препятствием для преобразования клеток судьбы2,3. Мы ранее применяется обратной генетики с помощью РНК-интерференции стук Даунс в C. elegans и были выявлены факторы, гарантирующие сотовой тождества и таким образом противодействовать перепрограммирования клетки семенозачатка в нейроны4. В частности, polycomb репрессивных комплекс 2 (PRC2) и высоко сохранены гистона шаперонов Лин-53 (СПП-1/RBBP/4/7 в организме человека) предотвратить прямое преобразование зародышевых клеток в конкретные соматических клеток типа глутаматергические вкус нейронов в C. elegans 4 , 5. для выявления этих клеток зародыша, перепрограммирование барьер факторов, мы использовали трансгенных животных, перевозящих теплового шока индуцибельной Zn палец TF CHE-1. ЧЕ-1 обычно выражается в две головы нейронов C. elegans, где он указывает, что судьба глутаматергические вкус нейронов называются ASE6. Судьба нейрон ASE могут быть визуализированы выражением флуоресцентные репортер ASE-специфических gcy-5prom::gfp. GCY-5 это Хеморецепция, только выраженные в ASE правый нейрон7. После истощения Лин-53 , RNAi и индукции широкого внематочная выражения ЧЕ-1 теплового шока зародышевые клетки могут быть преобразованы в нейронов в естественных условиях4,5. Важно отметить, что сроки лечения RNAi имеет решающее значение, как только взрослых червей (P0 поколения) подвергается Лин-53 RNAi порождают F1 потомства животных с микрофлорой, разрешительной для перепрограммирования в нейроны4.
Описанные выше зародышевых клеток для процедуры преобразования нейрон в C. elegans может использоваться для изучения различных биологических вопросов, как последствия сигнальные пути в ячейке судьба перепрограммирования. Например мы использовали перепрограммирования в ASE нейроны при интерференции против Лин-53 для того, чтобы изучить последствия паз, сигнальный путь в процессе перепрограммирования8клеток зародыша клетки семенозачатка ЧЕ-1-индуцированной. Выполняя двойной RNAi совместно истощать Лин-53 и гистонов деметилазы кодирование гена utx-1 мы показали, что сигнальный путь противодействует сайленсинга генов PRC2-опосредованной, активировав выражение UTX-1 в микрофлорой8 паз . Этот вывод показывает, что преобразование клеток зародыша нейронов, указанных в настоящем Протоколе может использоваться для изучения сложный биологический процесс, например сотовой перепрограммирование организма нетронутыми и в контексте различных развития и окружающей среды условий. Кроме того он предоставляет точки зрения бросить вызов клетки семенозачатка чрезмерно выразить разные судьбы заставить TFs изучить их роль в ограничении сотовой пластичности9, или оценить их потенциал для стимулирования перепрограммирования клетки семенозачатка другие клетки видов в естественных условиях.
Хотя млекопитающих культур тканей также позволяют изучать различные аспекты клеток судьба перепрограммирования, выросли в культуре клетки имеют ограниченные возможности для имитации сигнальный путь условия по сравнению с организма нетронутыми. Таким образом C. elegans является универсальная модель для изучения роли различных биологических процессов, например Notch сигнализации во время перепрограммирования в естественных условиях. Кроме того это мощная модель для генетических экранов, относительно легко поддерживать и генетически модифицировать для низких затрат.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone&#160;</td>
			<td>A. Hartenstein GmbH</td>
			<td>211 677</td>
			<td>Peptone Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1552,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck Biosciences</td>
			<td>208290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8866.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4275.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T875.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25,163,364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (5 N)</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>KK71.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>634412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2371.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick Scientific C24</td>
			<td>M1247-0052</td>
			<td>for heat-shock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>Sanyo MIR-5</td>
			<td>5534210</td>
			<td>for maintenance of worm strains at 15 &#176;C or 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Sensicam</td>
			<td>PCO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 
			promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse 
			III minus).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uracil auxotroph E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 
			3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lin-53</td>
			<td>SourceBioscience</td>
			<td>ID I-4D14</td>
			<td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>empty vetor: L4440</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>#1654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

Изучение биологических процессов клетки во время преобразования идентификаторов типов конкретных клеток обеспечивает важные выводы в механизм, которые поддерживают и защищают сотовой тождества. Преобразование зародышевых клеток в определенных нейронов в нематоды Caenorhabditis elegans (C. elegans) является мощным инструментом для выполнения генетических экраны для того, чтобы вскрыть нормативные пути, которые сохранить самобытность установленных клеток. Перепрограммирования клетки семенозачатка определенного типа нейронов, называют ASE требует трансгенных животных, которые позволяют широкий гиперэкспрессия Zn палец транскрипции фактор (TF) ЧЕ-1. Эндогенные ЧЕ-1 выражается исключительно в две головы нейронов и требуется для определения судьбы глутаматергические ASE нейронов, которые легко могут быть визуализированы корреспондента gcy-5prom::gfp . Транс генов, содержащих построить выражение гена теплового шока промоутер driven ЧЕ-1 позволяет широкий неправильное выражение ЧЕ-1 в всего животного после лечения теплового шока. Сочетание RNAi против хроматина регулирующий фактор Лин-53 и тепло шок индуцированной ЧЕ-1 гиперэкспрессия приводит к перепрограммирования клетки семенозачатка в ASE нейроноподобных клеток. Мы здесь описывают конкретные процедуры RNAi и надлежащих условий для лечения теплового шока трансгенных животных для того, чтобы успешно стимулировать клетки семенозачатка нейрон преобразования.

Как показано на рисунке 1, F1 животных, которые демонстрируют pvul фенотип демонстрируют успешное применение Лин-53 RNAi. Эти животные подвержены разрешить преобразование их клетки семенозачатка в ASE нейроноподобных клеток после теплового шока индукции гиперэкспрессия ЧЕ-1 , как показано на рисунке 2. В отличие от червей, которые росли на элементе пустой вектор RNAi Лин-53 RNAi лечение даст животных, отображающие внематочная GFP-сигналов в области середины тела после теплового шока и 25 ° C инкубации на ночь как описано ранее в4, 8. тщательного изучения этих червей под помощью эпифлуоресцентного микроскопа показывает, что клетки показывая GFP сигналы также отображать нейроноподобных прогнозы (Рисунок 2B, белые стрелки), которые являются типичными для нейрональные клетки. Если RNAi против Лин-53 не был успешным или теплового шока условия неуместны GFP сигналы будет напоминать тем управления RNAi обработанных животных (рис. 2). Главное Избегайте, вызывая гиперэкспрессия ЧЕ-1 по индукции тепла животных до середины L3 стадии. Животных, которые были слишком молоды, в то время ЧЕ-1 гиперэкспрессия индукции можно отображать внематочная gcy-5prom::gfp выражение в других регионах тела, такие как развивающихся вульвы, как показано на рисунке 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Рисунок 1: Pvul фенотип, вызванные RNAi против Лин-53. (Вверху) DIC картину L4/молодых взрослой стадии F1 потомства червей производный от control или Линь-53 RNAi лечение матерей. Масштаб баров = 20 мкм. (внизу) животных с Лин-53 RNAi отображение выступающих фенотип вульвы (pvul) (чёрный стрел). Pvul фенотип подтверждает, что RNAi против Лин-53 было успешным. Масштаб баров = 20 мкм. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Рисунок 2: Черви с успешно перепрограммировать клетки семенозачатка в нейроны. (A) BAT28 штамм животных, выращенных на пустой вектор не показывают GFP сигналов в микрофлорой после теплового шока индукции гиперэкспрессия ЧЕ-1 . Пунктирная линия белые контуры червя. Масштаб баров = 20 мкм. (B) в отличие от BAT28 штамм животных, выращенных на пустой вектор управления RNAi животных, выращенных на Линь-53 RNAi отображения сигналов gcy-5prom::gfp в районе середине тела. Фотографии раздела середине тела с GFP сигналов на 63 X увеличение раскрыть GFP-положительных клеток показаны выступы (белая стрелка головки). Это морфологическая особенность указывает, что клетки семенозачатка претерпела преобразование в ASE нейроноподобных клеток. Белые звездочки которые отмечают кишечника производные auto флуоресценции. Все фотографии были приобретены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с 20-кратным увеличением и 63 крат. Прерывистая белая линия излагаются червей. Масштаб баров = 20 мкм. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Рисунок 3: Ранней стадии червя с внематочной GFP. BAT28 штамма животных, выращенных на пустой вектор RNAi бактерии, которые были теплового шока индуцированной для ЧЕ-1 гиперэкспрессия на ранних личиночных стадиях таких L2 Показать GFP сигналов в области середины тела (белыми звездочками). Эти сигналы являются не за счет перепрограммирования клетки семенозачатка. Пунктирная линия белые контуры червя. Масштаб баров = 20 мкм. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Этот протокол описывает изучение клеточных процессов клетки судьба в процессе преобразования Caenorhabditis elegans в естественных условиях. Использование трансгенных животных, позволяя теплового шока промоутер driven гиперэкспрессия нейрон вызывая судьба транскрипционного фактора ЧЕ-1 и опосредованного системой РНК-интерференции истощение хроматина регулирующий фактор Лин-53 зародышевых клеток для перепрограммирования нейрон может наблюдаться в естественных условиях.

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Применение непроницаемых барьеров в сочетании с Factor кандидат замачивают шариков для изучения индуктивные сигналы в Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Пространственный и временной анализ активного ERK в<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Половые

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Оценка кардиомиоцитов подтипов После Транскрипция фактор опосредованного перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Стандартизованный подход к многовидовой очистке клеток мужского германия млекопитающих с помощью механической диссоциации тканей и проточной цитометрии

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

В C. elegans Excretory канал как модель для внутриклеточного люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза в одной ячейке: маркировка GFP-расплавы, RNAi взаимодействие экрана и изображений

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Иммобилизация Caenorhabditis elegans для анализа внутриклеточного транспорта в нейроны

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Гемогенная дифференциация эндотелия от стволовых клеток человека в Feeder- и Ксено-свободноопределенное состояние

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Оценка окислительного повреждения в первичной мыши глазной поверхностных клеток / стволовых клеток в ответ на ультрафиолет-C (UV-C) Ущерб

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...