Name: application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Vi tackar Alina El-Khalili och Martina Hajduskova för tekniskt bistånd. Vi tackar medlemmar i gruppen Tursun för synpunkter på manuskriptet. Detta arbete sponsrades av ERC-StG-2014-637530 och ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 och stöds av Max Delbrueck Center för molekylärmedicin i föreningen Helmholtz.

Alla metoderna som beskrivs här när det gäller djurens vård har godkänts av LaGeSo Berlin, Tyskland
1. lösningen förberedelse
<ol>
	<li>NGM-Agar plattor (1 L)
	<ol>
		<li>Tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g pepton media (t.ex. Bacto-pepton) och 20 g agar. Efter autoklavering, tillsätt 1 mL av kolesterol (5 mg/mL i 95% EtOH lager), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL 1 M K2PO4och 1 mL av amfotericin B (2,5 mg/mL lager).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM-Agar RNAi plattor (1 L)
	<ol>
		<li>Tillsätt 3 g NaCl, 2,5 g pepton media och 20 g agar. Efter autoklavering tillsätt, 1 mL av kolesterol (5 mg/mL i 95% EtOH lager), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 25 mL av 1 M K2PO4, amfotericin B (2,5 mg/mL lager) 1 mL, 1 mL 1 m IPTG , och 1 mL carbenicillin (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>Tillsätt 10 g pepton media, 5 g jäst extrakt, 5 g NaCl, 20 g agar, 10 mL 1 M Tris pH 8,0. Lägga till H2O 1 L. Efter autoklavering, tillsätt 1 mL 50 mg/mL carbenicillin och 2,5 mL av 5 mg/mL tetracyklin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB Medium (1 L)
	<ol>
		<li>Tillsätt 10 g pepton media, 5 g jäst extrakt, 5 g NaCl, och 10 mL 1 M Tris pH 8,0. Lägga till H2O 1 L. Efter autoklavering, tillsätt 1 mL 50 mg/mL carbenicillin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-buffert (1 L)
	<ol>
		<li>Lägg till 6,0 g av Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 5 g NaCl och 50 mg av gelatin. Tillsätt 1 mL 1 M MgSO4före användning.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blekning lösning (10 mL)
	<ol>
		<li>Tillsätt 1 mL NaClO och 2 mL 5 N NaOH. Lägga till H2O till 10 mL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. beredning av RNAi plattor
Obs: C. elegans är oftast odlade i laboratoriet på 6 cm Petri plattor som innehåller 7,5 mL av Nematoden tillväxt Medium Agar (NGM-Agar)10,11. Detta protokoll är optimerad för maskar förvaras vid 15 ° C. För att förbereda plattor med NGM, Använd sterila standardtekniker för att förhindra svamp- och bakteriella föroreningar. Följande är protokollet att förbereda NGM plattor kompletteras med reagenser för RNAi.
<ol>
	<li>Laga 6-cm NGM-Agar RNAi plattor som innehåller 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) och 50 µg/mL carbenicillin. Låt dem torka i 24 – 48 timmar vid rumstemperatur i mörka12.
	<ol>
		<li>Hålla RNAi plattor vid 4 ° C i mörker. Använd inte om äldre än 14 dagar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Välj den RNAi bakterier (Escherichia coli HT115) klon som innehåller L4440 plasmiden med lin-53 gen DNA-sekvensen från frysta glycerol lager från de tillgängliga RNAi bibliotek13 på LB-agarplattor som innehåller 50 µg/mL carbenicillin och 12,5 µg/mL tetracyklin med hjälp av tre-fas strimmor mönstret. Odla bakterier vid 37 ° C över natten12. Denna klon tillåter IPTG-beroende produktion av lin-53 dsRNA i bakterierna.
	<ol>
		<li>Dessutom växer RNAi bakterier som innehåller L4440 plasmiden utan någon gensekvens som Tom vector kontroll14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nästa dag, plocka en enda koloni från lin-53 eller tom vektor LB-agar plattor med 200 µL pipett spets och Inokulera dem i ett separat kultur rör innehållande 2 mL flytande LB medium14 kompletteras med 50 µg/mL carbenicillin. Odla kulturer över natten vid 37 ° C tills de når en optisk densitet (OD) på 600 nm på 0,6 – 0,8. Mäta OD med en spektrofotometer15. FÖRSIKTIGHET: Flytande LB media bör inte innehålla tetracyklin i motsats till LB-agar plattan används för strimmor bakterierna från glycerol lager, sedan införandet av tetracyklin under utfodring leder till en minskad RNAi effektivitet 12</li>
	<li>Tillsätt 500 µL av varje bakterieodling (lin-53 eller tom vektor) till 6 cm NGM-Agar RNAi plattor med hjälp av en multipipette. Inkubera plattorna med stängt lock över natten i rumstemperatur i mörkret att torka. Under denna tid kommer IPTG i NGM tallrikar inducera produktion av dsRNA i bakterierna.
	<ol>
		<li>Använd minst 3 plattor per bakterieodling per experiment. Detta kommer att ge 3 tekniska replikat för varje experiment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Förvara torkade NGM-agar RNAi plattor med bakterier vid 4 ° C i mörker i upp till två veckor.</li>
</ol>
3. beredning av C. elegans stam BAT28
<ol>
	<li>Upprätthålla den mask stammen BAT288 som innehåller de transgener otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] och ntIs1 [gcy-5prom::gfp] på OP50 bakterier använder standard NGM-Agar plattor vid 15 ° C. Obs: För detaljerade protokoll på nematoder kultur, se10. Den rol-6(su1006) är en dominerande allel och vanliga fenotypiska injektion markör16 som orsakar de typiska rullande rörelsen. Det används i den otIs305 transgenens för att spåra hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Hålla den BAT28 stammen vid 15 ° C hela tiden för att förhindra försiktighetsprincip aktivering av den hsp-16.2prom::che-1 transgenens. Minska exponering för temperaturer som är högre än 15 ° C vid hantering av stammen som möjligt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ålder-synkronisera maskar, använda den blekning teknik17.
	<ol>
		<li>Tvätta bort 6 cm NGM-Agar plattor som innehåller vuxna och ägg av BAT28 med 900 µL M9 buffert. Pellet maskar genom centrifugering vid 900 x g i 1 min. avlägsna supernatanten.</li>
		<li>Tillsätt 0,5 – 1 mL blekning lösning och skaka röret för ca 1 min tills vuxna maskar börjar brista öppna. Övervakare som använder en standard stereomikroskopet.</li>
		<li>Pellet maskar genom centrifugering vid 900 x g i 1 min. avlägsna supernatanten.</li>
		<li>Tvätta masken pelleten 3 gånger genom att lägga 800 µL av M9 buffert och centrifugering vid 900 x g.</li>
		<li>Placera de rengjorda ägg på färska NGM-plattor som ympats med OP50 bakterier. Växer en blekt befolkning på OP50 bakterier vid 15 ° C tills de når L4 scenen (cirka 4 dagar). L4 larver kan erkännas av en vit fläck ungefär halvvägs längs ventrala sida av masken18 använder en standard stereomikroskopet. Obs: För att uppnå bakteriecellen till neuron konvertering fenotyp vid utarmning av lin-53, det måste vara uttömda i föräldragenerationen (P0).</li></ol></li></ol>Scoring för konvertering fenotypen genomförs i den följande generationen (filial generationen F1). För att uppnå den bryter ned lin-53 redan i P0, utsätts L4 djuren för RNAi.
	
	
	<li>Manuellt överföra 50 L4 scenen maskar per replikat använder en platina tråd till ett NGM som inte innehåller några bakterier och låt maskar flytta bort från eventuella överförda OP50-bakterier. Låt maskar flytta på plattan i ca 5 minuter. Användning bakterier från NGM-Agar RNAi plattorna seedade tidigare med lin-53 RNAi bakterier (eller tom vector kontroll) att överföra till respektive RNAi plattorna.
	<ol>
		<li>Undvika att överföra OP50 bakterier till de faktiska RNAi-plattorna. Arbeta snabbt för att minimera exponeringstid på stammen vid temperaturer som är högre än 15 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubera maskar på NGM-Agar RNAi tallrikar vid 15 ° C i cirka 7 dagar tills F1 avkomma av maskarna når L3-L4 scenen. De kan tydligt skiljas från P0 djur eftersom de är större och tjockare än på F1-avkomman.
	<ol>
		<li>Visuellt kontrollera under ett standard stereomikroskop om F1 avkommor worms Visa den utskjutande vulva (pvul)-fenotypen som visas i figur 1. RNAi mot lin-53 har pleiotropiska effekter och orsakar den pvul fenotyp som kan användas för att bedöma om RNAi mot lin-53 har varit framgångsrik. Obs: RNAi mot lin-53 kan också orsaka dödlighet av F1 embryon. Denna effekt ökar om plattorna exponeras för högre grader än 15 ° C innan djur skede L3-L4. Döda embryon kan kännas igen av arrested development och brist på kläckning.</li>
		<li>Inkubera plattorna i mörkret eftersom IPTG är ljuskänsligt.</li>
	</ol>
	</li>

4. induktion av bakteriecellen omprogrammering
<ol>
	<li>Inkubera undersökta RNAi plattor som innehåller lin-53 och Töm vektor RNAi-behandlade F1 avkommor under 30 minuter vid 37 ° C i mörker att aktivera CHE-1. Använd en ventilerad inkubator eftersom det möjliggör en effektivare värme-chock.</li>
	<li>Låt värme-chockade djur att återhämta sig i 30 min i rumstemperatur i mörkret och sedan Inkubera plattorna vid 25 ° C över natten i mörkret.</li>
	<li>Använda en standard stereomikroskopet kopplat till en ljuskälla som fluorescens, undersöka djuren under GFP filtrera för gcy-5prom::gfp-härledda signaler i området mitten av kroppen i maskar som visas i figur 2. Ställ in mikroskopet för god Jordbrukarsed signaler: excitation maximum vid 488 nm med utsläpp maximum vid 509 nm.</li>
	<li>Utvärdera graden av bakteriecellen till neuron konvertering av montering djur med GFP signaler i området halva kroppen på agar pad-innehållande mikroskopi bilder19.
	<ol>
		<li>Räkna antalet djur som visar bakteriecellen till neuron konvertering vs. mörka djuren att bedöma den fenotyp penetrans. Cirka 30% av djuren visar vanligtvis diskreta GFP signaler i könsceller vid lin-53 utarmning, inte mer än 5% av djuren visar diffusa GFP signaler i könsceller vid tom vektor RNAi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li><li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+barriers+and+enhancers:+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency.">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li><li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-Dependent+Heterochromatin:+Barrier+to+Cell+Fate+Changes.">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li><li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types.">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li><li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types.">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li><li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron.">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653 (2007).</li><li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li><li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons.">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity.">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100 (2017).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenorhabditis+Elegans.">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).</li><li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li><li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein.">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li><li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm.">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li><li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++.">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+biology.">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li></ol>

Författarna har deklarerat att ingen konkurrerande intressen finns.

Samtidigt protokollet beskrivs med hjälp av transgena C. elegans stam BAT28 och RNAi mot lin-53 är enkel, ett antal steg är avgörande för att säkerställa det förväntade resultatet av bakteriecellen till neuron omprogrammering. Det är viktigt att stammen BAT28 hålls vid 15 ° C hela tiden innan experimenten. Under hantering och underhåll av stammen måste tiden vid temperaturer över 15 ° C minimeras så mycket som möjligt. Ordentlig värme-chock villkor är viktiga eftersom otillräcklig induktion av che-1 överuttryck inte resulterar i bakteriecellen till ASE neuron konvertering. Detta kan upptäckas genom att mäta den fenotyp penetrans som beskrivs i protokollet. Omfattande värme-chock kan leda till dödlighet av djuren. Exempelvis upplever plattor som har placerats nära innerväggar eller på botten marken av en statisk luft inkubator ofta omfattande värmebehandling. Därför är det rekommenderat att använda en ventilerad värme inkubator. Dessutom är tidpunkten för heat-shock induktion kritiska sedan över uttrycket av che-1 vid larval arrangerar tidigare då L3 kan leda till ektopisk gcy-5prom::gfp induktion i olika organ regioner såsom vulva (figur 3) 9. dessutom omfattande värme-chock kan upptäckas genom den fenotyp penetrans tom vektor RNAi djur som inte bör omfatta 5% och ökad auto-fluorescens av andra vävnader, nämligen tarmen.
Sporadiskt, kan RNAi bakterier förlora sin verksamhet för att effektivt producera dsRNA av målgenen. Tyvärr kan detta inte vara upptäckta före RNAi experimentet. I sådana fall bör en färsk strimma från glycerol odlas som beskrivs i avsnitt 2 i protokollet. Om det finns fortfarande ingen RNAi-orsakade pleiotropiska fenotyp synliga som den pvul fenotypen orsakas av framgångsrika RNAi mot lin-53, sedan en plasmid DNA isolering från respektive bakterier bör utföras och färska HT115 bakterier behöver vara förvandlade med L4400 plasmiden som innehåller sekvensen lin-53 .
Viktigt, den BAT28 stammen har en rulle fenotypen orsakas av den injektion markör pRF4, som användes under genmodifiering av djur med de hsp-16.2prom::che-1 DNA konstruktion. Ibland djur förlorar den rullande fenotypen, vilket kan tyda på Tystande av den hsp-16.2prom::che-1 transgenens. För att underhålla den BAT28 stammen, pick 10 roller djur till en färsk platta och propagera att välja för rullande djur.
Tillämpningen av protokollen som är begränsat till F1 RNAi förfarandet, vilket innebär att djur vars föräldrar (P0 generationen) inte har utsatts för lin-53 RNAi inte visas bakteriecellen till neuron omvandling på grund av moderns rescue4. Ett alternativt förfarande för att konvertera könsceller till nervceller har beskrivits av Ciosk och kollegor15 med hjälp av RNAi knock-down av gld-1 och mex-3 utan över uttryck för en transkriptionsfaktor. Men de erhållna nervcellerna tillhör inte en särskild typ av nervceller och könsceller också konvertera till muskel-liknande celler vid RNAi-medierad utarmning av gld-1 och mex-315. Tidigare har det visats att RNAi mot lin-53 tillåtna bakteriecellen omvandling till GABAerga neuron-liknande celler på över uttryck av Pitx-typ homoedomain Transkriptionfaktorn UNC-3016 istället för CHE-14 . För framtida inriktningar, kan olika öde-inducerande transkription faktorer kan testas om lin-53 utarmat könsceller konverteras till andra celltyper än specifika nervceller. I detta sammanhang inducerar överuttryck av myogenic bHLH Transkriptionfaktorn HLH-1, homolog av däggdjur MyoD17, konvertering av bakteriecellen till muskler vid lin-53 RNAi5. Etablerade omprogrammering av könsceller att en viss somatisk celltyp vid lin-53 RNAi och över uttryck för en lämplig öde-inducerande transkriptionsfaktor kan användas för ett antal olika genetiska skärmar. Sådan suppressor eller enhancer skärmar kan hjälpa till att dissekera reglerande vägar som spelar en roll under cell öde konvertering.

Cell öde omprogrammering av ektopisk TF uttrycket den myogenic TF MyoD, som, när, i ökad utsträckning omvandlar fibroblaster direkt i muskel-liknande celler1, har varit en forskningsinriktning i decennier. Differentierade celler finns dock ofta refraktära mot denna process, på grund av mekanismer som säkerställer deras cellulära identitet. Könsceller visar en liknande skyddsnivå och det finns bakomliggande mekanismer som ofta fungerar som en barriär för att förhindra bakteriecellen omvandling till andra celltyper vid över uttryck för en öde-inducerande TF. Typiskt, epigenetisk reglering såsom Histon ändringar och kromatinstruktur medför ett hinder för omvandling av cell öden2,3. Vi har tidigare tillämpas omvänd genetik med hjälp av RNAi knock-downs i C. elegans och identifierat faktorer som skydda cellulära identiteter och därmed motverka omprogrammering av könsceller i nervceller4. Specifikt, polycomb repressiva complex 2 (PRC2) och mycket Histon förkläde LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 i människor) förhindra direkt omvandling av könsceller till specifika somatiska celltyper såsom glutamatergic smak nervceller i C. elegans 4 , 5. för att identifiera dessa bakteriecellen omprogrammering barriär faktorer, vi använde transgena djur som bär den värme-chock inducerbara Zn-finger TF CHE-1. CHE-1 uttrycks normalt i två huvud nervceller i C. elegans, där den anger öde glutamatergic smak nervceller kallas ASE6. ASE neuron öde kan visualiseras av uttryck av den ASE-specifika fluorescerande reporter gcy-5prom::gfp. GCY-5 är en chemoreceptor endast uttryckt i ASE rätt neuron7. Vid lin-53 utarmning av RNAi och induktion av breda ektopisk uttryck av CHE-1 heat-shock, kan könsceller omvandlas till nervceller i vivo4,5. Ännu viktigare, är tidpunkten för RNAi behandling avgörande eftersom endast vuxna maskar (P0 generationen) utsätts för lin-53 RNAi ge upphov till F1 avkommor djur med en könsceller som är tillåtande för omprogrammering i nervceller4.
Ovan beskrivna bakteriecellen neuron konvertering förfarandet i C. elegans kan användas för att studera en mängd biologiska frågor såsom implikationen av signalering utbildningsavsnitt i cell öde omprogrammering. Till exempel använde vi bakteriecellen CHE-1-inducerad omprogrammering till ASE nervceller vid RNAi mot lin-53 för att studera konsekvenserna av skåran signalering utbildningsavsnitt i processen bakteriecellen omprogrammering8. Genom att utföra dubbel RNAi för att tillsammans bryter lin-53 och Histon demethylase-encoding gene utx-1 vi visade att skåran signalering utbildningsavsnitt motverkar PRC2-medierad nedtystning genom att aktivera uttryck för UTX-1 i könsceller8 . Detta fynd visar att bakteriecellen omvandlingen till nervceller som beskrivs i detta protokoll kan användas för att studera en komplex biologisk process såsom cellulär omprogrammering i en intakt organism och i samband med olika utvecklings- och miljömässiga villkor. Det ger dessutom perspektiv att utmana könsceller över uttrycka olika öde-inducerande TFs att studera deras roll i begränsning av cellulär plasticitet9eller att bedöma deras potential för att inducera omprogrammering av könsceller att andra cell typer i vivo.
Däggdjur vävnadskulturer tillåter också att studera olika aspekter av cell öde omprogrammering, har celler odlade i kultur begränsad kapacitet att efterlikna signalering utbildningsavsnitt villkor jämfört med en intakt organism. C. elegans är därför en mångsidig modell för undersökning av olika biologiska processer såsom Notch signalering under omprogrammering i vivoroller. Dessutom är det en kraftfull modell för genetiska skärmar som är relativt lätt att underhålla och genetiskt modifiera för låga kostnader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5210.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactopeptone&#160;</td>
			<td>A. Hartenstein GmbH</td>
			<td>211 677</td>
			<td>Peptone Media&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1552,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>USBiological</td>
			<td>A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck Biosciences</td>
			<td>208290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8866.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4275.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15502-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T875.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25,163,364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P030.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (5 N)</td>
			<td>Roth&#160;</td>
			<td>KK71.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>634412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2371.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>New Brunswick Scientific C24</td>
			<td>M1247-0052</td>
			<td>for heat-shock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>Sanyo MIR-5</td>
			<td>5534210</td>
			<td>for maintenance of worm strains at 15 &#176;C or 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Imaging) + camera</td>
			<td>Sensicam</td>
			<td>PCO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 
			promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse 
			III minus).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Uracil auxotroph E. coli strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 
			3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lin-53</td>
			<td>SourceBioscience</td>
			<td>ID I-4D14</td>
			<td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>empty vetor: L4440</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>#1654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm pick&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

Studera biologiska processer i cellen under konvertera identiteterna för specifika celltyper ger viktiga insikter i mekanism som upprätthåller och skydda cellulära identiteter. Omvandling av könsceller till specifika nervceller i de nematoder Caenorhabditis elegans (C. elegans) är ett kraftfullt verktyg för att utföra genetiska skärmar för att dissekera rättsliga vägar att skydda etablerade cell identiteter. Omprogrammering av könsceller till en viss typ av nervceller som kallas ASE kräver transgena djur som tillåter bred över uttryck av Zn-finger transkription faktorn (TF) CHE-1. Endogena CHE-1 uttrycks enbart i två huvud nervceller och är skyldig att ange glutamatergic ASE nervceller ödet, som kan enkelt visualiseras av gcy-5prom::gfp reporter. En trans gen som innehåller den värme-chock arrangör-driven che-1 genen uttryck konstruktionen tillåter bred mis uttryck av CHE-1 i hela djuret vid värme-chock behandling. Kombinationen av RNAi mot kromatin-reglerande faktor LIN-53 och värme-chock-inducerad che-1 över uttryck leder till omprogrammering av mutagenitet i ASE neuron-liknande celler. Vi beskriver här särskilt RNAi förfarande och lämpliga villkor för heat-shock behandling av transgena djur för att framgångsrikt förmå bakteriecellen till neuron konvertering.

Som visas i figur 1, illustrera F1-djur som uppvisar pvul fenotypen framgångsrik tillämpning av lin-53 RNAi. Dessa djur är benägna att möjliggöra omvandling av deras könsceller i ASE neuron-liknande celler vid heat-shock induktion av che-1 över uttryck som illustreras i figur 2. I motsats till maskar som växte på kontroll tom vektor RNAi lin-53 RNAi behandling kommer att ge djur som visar ektopisk GFP-signaler i området halva kroppen efter värme-chock och 25 ° C inkubering över natten som beskrivs tidigare4, 8. närmare granskning under ett epifluorescensmikroskop av dessa maskar avslöjar att de celler som visar god Jordbrukarsed signaler också Visa neuron-liknande prognoser (figur 2B, vita pilarna) som är typiska för neuronala celler. Om RNAi mot lin-53 lyckades inte eller heat-shock villkorar var olämpligt kommer att GFP signaler likna dem i kontroll RNAi behandlade djur (figur 2). Ännu viktigare, undvika inducerande över uttryck för che-1 genom Värmeinduktion innan djur når mitten av L3 scenen. Djur som var alltför unga på che-1 överuttryck induktion kan visa ektopisk gcy-5prom::gfp uttryck i andra delar av kroppen såsom framkallande vulva som visas i figur 313.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Figur 1: Pvul fenotyp orsakas av RNAi mot lin-53. (Överst) DIC bild av L4/ung vuxen skede F1 avkommor maskar härrör från kontroll eller lin-53 RNAi behandlade mödrar. Skala barer = 20 µm. (nederst) djur som behandlats med lin-53 RNAi displayen den utskjutande vulva (pvul) fenotypen (svart pil-huvuden). Pvul fenotypen bekräftar att RNAi mot lin-53 var framgångsrik. Skala barer = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Figur 2: Maskar med framgångsrikt omprogrammerade bakteriecellen till nervceller. (A) BAT28 stam djur odlas på tom vektorn inte visar god Jordbrukarsed signaler i könsceller efter heat-shock induktion av che-1 överuttryck. Streckad vit linje konturer mask. Skala barer = 20 µm. (B) i motsats till BAT28 stam djur odlas på tom vector kontroll RNAi djur odlas på lin-53 RNAi display gcy-5prom::gfp signaler i mitten av kroppen. Bilder av avsnittet halva kroppen med GFP signaler tas vid 63 X förstoring avslöja GFP-positiva celler visar utbuktningar (vit pil-huvuden). Morfologiska funktionen anger att könsceller genomgick omvandling till ASE neuron-liknande celler. Vita asterisker Markera tarmen-derived auto-fluorescens. Alla bilder har förvärvats med ett epifluorescensmikroskop med 20 X förstoring och 63 X förstoring. Streckad vit linje beskriver maskar. Skala barer = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Figur 3: Tidiga skede mask med ektopisk GFP. BAT28 stam djur odlas på tom vektor RNAi bakterier som var heat-shock inducerad för che-1 överuttryck tidiga larval skeden såsom L2 visar god Jordbrukarsed signaler i området halva kroppen (vit asterisker). Dessa signaler är inte på grund av bakteriecellen omprogrammering. Streckad vit linje konturer mask. Skala barer = 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Tillämpningen av RNAi och värme-chock-inducerad transkription faktorn uttryck att omprogrammera könsceller att nervceller i C. elegans

Det här protokollet beskriver hur man studera cellulära processer under cell öde konvertering i Caenorhabditis elegans invivo. Med hjälp av transgena djur, så att värme-chock arrangören-driven överuttryck av neuron öde-inducerande Transkriptionfaktorn CHE-1 och RNAi-medierad utarmning av kromatin-reglerande faktor LIN-53 bakteriecellen till neuron omprogrammering kan observeras in-vivo.

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Tillämpning av Ogenomträngliga hinder Kombinerat med kandidat faktor Fuktiga pärlor att studera Induktiva signaler i Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumsliga och tidsmässiga analys av aktiva ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; arvslinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Uppskatta cardiomyocyte Subtyper Efter transkriptionsfaktor-medierad Omprogrammering av mus embryonala fibroblaster

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

En standardiserad tillvägagångssätt för multispecies Rening av mammaliska manliga cellceller genom mekanisk vävnadsdissociation och flödescytometri

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

C. elegans Excretory kanalen som en modell för intracellulära Lumen morfogenes och In Vivo polariserade membran biogenes i en enda Cell: märkning av GFP-fusions, RNAi interaktion skärm och Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans att analysera intracellulära Transport i nervceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hemogena Endotelium differentiering från mänskliga pluripotenta stamceller i en feeder-och Xeno-fritt definierade villkor

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Bedömning av oxidativ skada i de primära musokulära ytcellerna/stamcellerna som svar på ultraviolett-C (UV-C) Skada

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...