Name: on-site molecular detection of soil-borne phytopathogens using a portable real-time pcr system
Uploaded: 2018-02-23T13:30:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System at JoVE.com

Мы благодарны д-р Нил C. Gudmestad в университете штата Северная Дакота для предоставления S. subterranea плазмиды, доктор Hanu Паппу в Вашингтон государственного университета (Вашингтон) для предоставления PMTV РНК и д-р Дебра Инглис в Вашингтон для предоставления R. Солани AG3. Отдельное спасибо доктор Джереми Jewell в Вашингтон для представления замечаний по рукописи и WSU CAHNRS коммуникаций для видео. Это исследование было поддержано консорциум исследований картофеля Северо-Запада и Вашингтон государственного департамента сельского хозяйства - специальность культур блок Грант программы (Грант нет. K1764). PPNS № 0741, Департамент фитопатологии, колледж сельского хозяйства, наук людских и природных ресурсов, сельскохозяйственной научно-исследовательский центр, Люк проекта № WNP00833, Университет штата Вашингтон, Pullman, Вашингтон, США.

<ol>
	<li>Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jim&#233;nez-Gasco, M. d. e. l. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+Host+Plant+Associations+of+Soil-borne+Fungal+Pathogens:+An+Ecological+Perspective.">Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective.</a> Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).</li><li>Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flow+(immuno)assay:+its+strengths,+weaknesses,+opportunities+and+threats.+A+literature+survey.">Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey.</a> Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).</li><li>Hill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+Assay+for+Rapid+Detection+of+Common+Strains+of+Escherichia+coli.">Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli.</a> J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).</li><li>Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Potato+mop+top+virus+and+Tobacco+rattle+virus+Using+a+Multiplex+Real-Time+Fluorescent+Reverse-Transcription+Polymerase+Chain+Reaction+Assay.">Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay.</a> Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).</li><li>Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+a+new+technology+to+detect+and+study+phytopathogenic+and+antagonistic+fungi.">Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi.</a> European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).</li><li>Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+potato+pathogen+DNA+in+soil.">Quantifying potato pathogen DNA in soil.</a> Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).</li><li>Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-Site+DNA+Extraction+and+Real-Time+PCR+for+Detection+of+Phytophthora+ramorum+in+the+Field.">On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).</li><li>Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Powdery+scab+disease+of+potato+-+a+review.">Powdery scab disease of potato - a review.</a> Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).</li><li>Johnson, D. A., Miliczky, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+development+of+black+dot,+Verticillium+wilt,+and+powdery+scab+on+Russet+Burbank+potatoes+in+Washington+State.">Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State.</a> Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).</li><li>Merz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Powdery+Scab+of+Potato-Occurrence,+Life+Cycle+and+Epidemiology.">Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology.</a> Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).</li><li>Jones, R. a. C., Harrison, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+of+potato+mop-top+virus+in+soil,+and+evidence+for+its+transmission+by+Spongospora+subterranea+(Wallr).+Lagerh.">The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh.</a> Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).</li><li>Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+temperature+on+the+transmission+of+Potato+mop-top+virus+from+seed+tuber+and+by+its+vector,+Spongospora+subterranea.">Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea.</a> Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).</li><li>Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+quantitative+real-time+PCR+assay+for+Rhizoctonia+solani+AG3-PT+and+the+detection+of+AGs+of+Rhizoctonia+solani+associated+with+potato+in+soil+and+tuber+samples+in+Great+Britain.">A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain.</a> Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).</li><li>Banville, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield+losses+and+damage+to+potato+plants+caused+by+Rhizoctonia+solani+Kuhn.">Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn.</a> American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).</li><li>Crosslin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Report+of+Potato+mop-top+virus+on+Potatoes+in+Washington+State.">First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State.</a> Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).</li><li>Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Potato+mop+top+virus+(Furovirus)+on+potato+in+southeast+Idaho.">Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho.</a> Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).</li><li>Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Report+of+Potato+mop-top+virus+Infecting+Potato+in+Oregon.">First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon.</a> Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).</li><li>Doyle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+plant+DNA+from+fresh+tissue.">Isolation of plant DNA from fresh tissue.</a> Focus. 12, 13-15 (1990).</li><li>Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plant+DNA+minipreparation:+Version+II.">A plant DNA minipreparation: Version II.</a> Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).</li><li>Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+plant+genomic+DNA+for+PCR+analysis.">A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.</a> Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).</li><li>Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloropicrin+Soil+Fumigation+Reduces+Spongospora+subterranea+Soil+Inoculum+Levels+but+Does+Not+Control+Powdery+Scab+Disease+on+Roots+and+Tubers+of+Potato.">Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato.</a> Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).</li><li>van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+Spongospora+subterranea+in+Soil,+Water+and+Plant+Tissue+Samples+Using+Real-Time+PCR.">Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR.</a> European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).</li><li>Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spongospora+subterranea+root+infection+assessed+in+two+potato+cultivars+differing+in+susceptibility+to+tuber+powdery+scab.">Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab.</a> Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).</li><li>Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+PCR+inhibitors+from+soil+DNA+by+chemical+flocculation.">Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation.</a> Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).</li><li>Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+conventional+and+quantitative+real-time+PCR+assays+for+the+detection+and+identification+of+Rhizoctonia+solani+AG-3+in+potato+and+soil.">Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil.</a> Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).</li><li>Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+infected+seed+tuber+and+soil+inoculum+in+transmitting+Potato+mop-top+virus+to+potato+plants.">The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants.</a> Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).</li><li>Boonham, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+virus+diagnostics:+From+ELISA+to+next+generation+sequencing.">Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing.</a> Virus Research. 186, 20-31 (2014).</li><li>Mohan, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactivity+of+antiserum+raised+against+Phytophthora+fragariae+with+other+Phytophthora+species+and+its+evaluation+as+a+genus-detecting+antiserum.">Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum.</a> Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).</li><li>Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+routine+DNA-based+testing+service+for+soil-borne+diseases+in+Australia.">Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia.</a> Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).</li><li>Woodhall, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+large-scale+soil+DNA+extraction+procedure+and+real-time+PCR+assay+for+the+detection+of+Sclerotium+cepivorum+in+soil.">A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil.</a> Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).</li><li>Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Rapid+Isothermal+Amplification+Assays+for+Detection+of+Phytophthora+spp+in+Plant+Tissue.">Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue.</a> Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).</li><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).</li><li>Narayanasamy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , (2016).</li><li>Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberh&#228;nsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+lateral-flow+immunoassay+for+phytosanitary+detection+of+Erwinia+amylovora+and+on-site+fire+blight+diagnosis.">A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).</li></ol>

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Как показано в таблице 1, последние технологические достижения в молекулярной идентификации возбудителей увеличили эффективность, точность и скорость диагностики, которые способствовали обнаружению предварительно симптоматической инфекции27. Относительно занятия диагноз лампа бокового потока используются и методы часто потому, что они являются портативными и предоставлять немедленные результаты по более низкой цене. Однако в случае серологических методов, поставляемому обнаружения может быть трудно достичь. Это иногда вызывает я мимо микробов как общей почвы жителей. Например может существовать перекрестная реактивность между серологических тестов фитофторозом spp. и Pythium spp. в случае картофеля патогенов28, указывая, что иногда трудности выявления целевых завод патогенов.
В настоящем исследовании мы разработали оптимизированный протокол для занятия молекулярной обнаружения почвообитающих картофельных патогенов, используя портативные системы PCR реального времени, сравнивая его возможности с этим обычных лаборатории-системы на основе реального времени PCR. Мы обнаружили, что на месте метод специально обнаруживает картофельных патогенов в образце почвы, хотя чувствительность ~ 10 раз меньше, чем эквивалентный лабораторного анализа. Также стоит учесть, что в этом случае лабораторных и полевых испытаний не использовать биологически соответствующей выборки. Большие выборки необходимы для использования в регулярно скрининг поля почвы как описано29,30, где обрабатываются размеры образца от 250 г до 1 кг, хотя эти методы требуют квалифицированных операторов и сложные Оборудование для извлечения ДНК. Как правило крупномасштабные почвы, извлечь ДНК берется из одного совокупных почвы образца представителя многочисленных проб свыше 1 до 4 га6,29,30. Однако протокол, разработанный здесь быстрый, легкий в использовании для пользователей без предварительного опыта в молекулярной диагностики и могут использоваться за пределами лаборатории. Как метод является быстрым и относительно дешевым по сравнению с добычи крупномасштабные почвы, он может использоваться для многих небольших образцов, взятых из аналогичной области выборки для крупномасштабных статистических выборок. Это может преодолеть некоторые из недостатков небольшой размер выборки и определить дополнительную информацию о пространственном распределении возбудителя в поле. Кроме того, мобильность и скорость метода означает, что он может также использоваться в демонстрационных мероприятий для производителей для образовательных и целей участия.
Еще одним фактором является, что многие в реальном времени анализы ПЦР уже были опубликованы для широкого круга растения патогенов5. Эта система может сделать использовать этих существующих анализов, без необходимости для разработки новых лампа Праймеры для включения в полевых испытаний. Частые критика лампа анализов является, что они могут быть трудно разработать31. Портативный PCR, таким образом, позволяет сравнительно легко реализовать широкий спектр легко доступны возбудителя тесты для тестирования на месте.
Традиционные методы могут быть часто дорогостоящих, кропотливая, неточными и длительным. Простота метода на месте, которое мы разработали позволяет производителей и работников промышленности для выполнения обнаружения возбудителя самостоятельно и возможно генерировать результат гораздо быстрее, чем отправлять диагностические лаборатории, которые могут быть на некотором расстоянии. Оперативность и чувствительность портативный метода ПЦР может помочь фермерам избежать потенциальных вторичных инфекций, которые могут еще больше увеличить патогена населения и непреднамеренное распространение (через оборудование или людей). В заключение на месте метод, разработанный в настоящем исследовании позволяет точную и относительно чувствительных обнаружение важных почву патогенов в поле. Мы надеемся, что на месте метод, разработанный в этом исследовании будет способствовать в текущей диагностики трубопроводов (рис. 6), не только предоставляя быстрые и точные ответы на эпидемиологических вопросы о болезни растений в поле, но и предоставляя возросшее понимание биологии и эпидемиологии патогенов растений.

Точного и быстрого выявления причинных патогенов значительно влияет на решения, касающиеся управления болезней растений. Почвы-болезней особенно трудно диагностировать, потому что окружающей среде почвы очень велика по отношению к заводе массы и сложным, что делает его трудно понять все аспекты заболеваний, передающихся через почву. Кроме того почвообитающих заболевания могут быть бессимптомная во время ранних стадиях инфекции, зависит от экологических стрессоров, а некоторые имеют длительного латентного, которые приводят к задержки диагноз1. Многие почву патогенов разработали выживания структуры, такие как специализированные споры или melanized гифы, на которых можно выжить в почве на протяжении многих лет даже в отсутствие их узлов. Используемые подходы для болезней, передающихся через почву управления включают в себя: избежать известных зараженных полей, используя патогеном бесплатно сертифицированные семена и саженцы, сохраняя оборудования санитарных и ограничение движения почвы и воды, когда это возможно. Знание присутствия возбудителя через стратегии молекулярной обнаружения могут также играть полезную роль, информируя своевременные решения относительно лечения ранней стадии или предварительно растений оценки полей. На месте тестирования обеспечивает дополнительные преимущества обеспечивая быстрый результат без отправки образца диагностическая лаборатория что возможно некоторое расстояние от отеля, а также могут участвовать садовод если такой диагностики выполняются «стороне поля» в их присутствии.
Для занятия диагноз, основанный на молекулярных обнаружения, чувствительность, специфичность, надежность (повторяемость и воспроизводимость) и эффективности (т.е., простота и производительность) являются важнейшими факторами для рассмотрения. Боковой поток устройства (LFDs) как Immunostrip и PocketDiagnostic, популярные методы обнаружения возбудителя на месте из-за их простоты как одношаговый пробирного. Однако LFDs не может быть право диагностический инструмент во всех ситуациях, потому что они не имеют чувствительность и специфичность и иногда дает неоднозначные результаты, если целевой возбудителя в низких концентрациях и может cross-react с аналогичных видов или родов 2. цикл опосредованной изотермической амплификация (лампа) применяется также для обнаружения на месте возбудителя и особенно недорогой благодаря лоу кост реагентов, условий реакции, которые остаются постоянными и простой колориметрические визуального анализа. Однако как LFDs, так и лампы обычно используются качественно, хотя оба подхода могут использоваться количественно с более дорогих оборудования3. Полимеразной цепной реакции (ПЦР) предлагает высокую специфичность, высокая чувствительность и количественного потенциала по сравнению с вышеупомянутыми методами обнаружения. Однако обычные технологии на базе лаборатории ПЦР требует дорогих лабораторного оборудования и квалифицированного персонала, который является основным недостатком в принятии этой технологии как метод обнаружения для целей занятия.
В этом протоколе продемонстрировал на месте диагностический метод, с помощью инструмента портативный ПЦР в реальном времени. Реальном масштабе времени PCR технология дает преимущества перед другими методами с точки зрения количественных точность, чувствительность и универсальность и широко используется для обнаружения широкого круга растения патогенов4,5, включая различные картофельных патогенов в почве6. Из-за последних тенденций рынка быстро растущих, конкурентоспособной оборудования для ПЦР технологии продолжает развиваться, чтобы быть более компактной и менее дорогим7. Протокол состоит из следующих шагов: извлечение магнитный шарик на основе нуклеиновых кислот, портативные ПЦР в реальном времени (fluorogenic на основе проб пробы) и анализа количественных данных, которые можно все сделать удаленно, используя портативный компьютер (Рисунок 1).
С помощью переносных протокол постановки ПЦР разработан здесь, были проанализированы образцы почвы для выявления возбудителя почвообитающих, Spongospora subterranea. Spongospora был выбран как это важным картофеля возбудителя в качестве возбудителя порошистой8. В последние десятилетия наличие этого заболевания считается распространилась на многие регионы, где картофель выращивается9,10. Порошистой парши, благодаря присутствию прыщ как поражения клубней может привести к значительным качественным урожайности производителей картофеля. Кроме того S. subterranea может вектор картофеля Mop Топ вирус (PMTV), который может вызвать симптомы внутреннего поражения клубней (известный как spraing)11,12. Таким образом важно знать, если S. subterranea присутствует в областях до посадки6. Мы также продемонстрировать полезность настоящего протокола для обнаружения ризоктониоза Солани анастомоза Группа 3 (AG3) и PMTV. Хотя несколько групп анастомоза ризоктониоза Солани вызывают заболевания в картофель, AG3, возможно наиболее важным во всем мире13, вызывая стволовых язвы и войлочная, что приводит к потери товарного урожая до 30%14. PMTV вызывает некротические поражения внутри клубней, которые обычно называются spraing. Этот вирус недавно сообщалось в первый раз в нескольких государствах в Тихоокеанском северо-западе15,16,17и имеет большую озабоченность фермеры, в растущем регионе этот важный картофеля. Помимо определения эффективности портативный ПЦР для этих важных заболеваний, оптимального ДНК извлечения методологии и почвы размер выборки также были исследованы в этом исследовании.
Результаты показывают, что метод ПЦР портативный универсальный и применяется для обнаружения различных возбудителей. Метод на месте обнаружения, которую мы разработали может позволить прифронтовыми работников в сельском хозяйстве (например, производителей), чтобы сделать ранее решения, касающиеся управления болезни, такие как разнообразие выбора, или ротации и можно количественно завод патогена в образце во время проведения обследования на местах, до посадки, чтобы избежать потенциальных вспышек заболеваний.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1073">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">White shell PCR plate</td>
			<td style="width:183px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:195px;">HSP9601</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">CFX Manager</td>
			<td style="width:183px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:195px;">1845000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">SsoAdvanced Universal Probes Supermix&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:195px;">1725280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">CFX96 Touch qPCR instrument</td>
			<td style="width:183px;">Bio-Rad&#160;</td>
			<td style="width:195px;">1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ethylalcohol, pure 200 proof</td>
			<td style="width:183px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:195px;">04-355-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Masterclear cap strips &#38; real&#8209;time PCR tube strips</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td>9510222109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:195px;">BP118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Phenol, Saturated&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:195px;">BP1750I-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:195px;">BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">q16 real-time PCR machine</td>
			<td style="width:183px;">genesig</td>
			<td style="width:195px;">MBS486001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:183px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:195px;">15525-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">2-Propanol (Isopropanol)</td>
			<td style="width:183px;">JT Baker</td>
			<td style="width:195px;">67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Chloroform</td>
			<td style="width:183px;">JT Baker</td>
			<td style="width:195px;">9180-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl)</td>
			<td style="width:183px;">JT Baker</td>
			<td style="width:195px;">9535-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">iso-Amyl Alcohol</td>
			<td style="width:183px;">JT Baker</td>
			<td style="width:195px;">9038-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">FastDNA Spin kit&#160;</td>
			<td style="width:183px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:195px;">6560-200</td>
			<td>Silica-based DNA extraction kit #1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:195px;">E3005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes</td>
			<td style="width:183px;">Phenix Research</td>
			<td style="width:195px;">MPC-100LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Easy DNA/RNA Extraction Kit&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Primerdesign</td>
			<td style="width:195px;">genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">genesig Easy 1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:183px;">Primerdesign</td>
			<td style="width:195px;">genesigEASY-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Magnetic tube rack</td>
			<td style="width:183px;">Primerdesign</td>
			<td style="width:195px;">genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit</td>
			<td style="width:183px;">Primerdesign</td>
			<td style="width:195px;">Path-S.subterranea-EASY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H6269-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Pellet pestles</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">12-141-364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:451px;">DNA Miniprep kit&#160;</td>
			<td style="width:183px;">ZymoBIOMICS</td>
			<td style="width:195px;">D4300</td>
			<td>Silica-based DNA extraction kit #2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

on-site molecular detection of soil-borne phytopathogens using a portable real-time pcr system

На месте диагноз заболеваний растений может быть полезным инструментом для производителей для своевременного принятия решений, включение ранее осуществления стратегий управления болезней, которые уменьшают воздействие этой болезни. В настоящее время во многих диагностических лабораториях, полимеразной цепной реакции (ПЦР), особенно в реальном масштабе времени PCR, считается наиболее чувствительным и точным методом для обнаружения патогенов растений. Однако на основе лабораторные PCR обычно требуют дорогих лабораторного оборудования и квалифицированного персонала. В этом исследовании почву патогенов картофеля используются для демонстрации возможности для занятия молекулярных обнаружения. Это было достигнуто, используя быстрый и простой протокол, включающий добычи магнитный шарик на основе нуклеиновых кислот, портативные ПЦР в реальном времени (fluorogenic на основе выборки проба). Портативный реального времени PCR подход выгодно по сравнению с всего лишь 100 копий ДНК из системы на базе лаборатории, обнаружения Spongospora subterranea. Портативный реального времени метод ПЦР разработанных здесь может служить альтернативой подходы на основе лабораторных и полезным инструментом на месте для диагностики патогенов.

Watch this Scientific Journal Video about On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System at JoVE.com

On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System

Быстрого и точного обнаружения патогенов растений на местах, особенно почвообитающих патогенных микроорганизмов, имеет решающее значение для предотвращения дальнейшего производства посевным материалом и распространения заболеваний растений в поле. Разработанный метод здесь, с помощью портативной системы обнаружения ПЦР в реальном времени позволяет на месте диагноз в полевых условиях.

На месте молекулярной обнаружение почвообитающих фитопатогенов, используя систему портативный ПЦР в реальном времени

On-site diagnosis of plant diseases can be a useful tool for growers for timely decisions enabling the earlier implementation of disease management ...

Research

JoVE Journal

Environment

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Одновременная ДНК-РНК Извлечение из прибрежных отложений и Количественная 16S-рРНК и транскриптов с помощью ПЦР в реальном времени

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Измерение и сопоставление моделей осаждения, относящиеся к концентрации карбоната почвы под управление сельским хозяйством и эрозии почвы

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Конкретные и точного обнаружения цитрусовых озеленение возбудителя Candidatus liberibacter spp. Использование обычных ПЦР на цитрусовые образцы тканей листа

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Самостоятельный электрохимических Set-up обогатить анод дышащие бактерий на месте

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

Measuring Stolons and Rhizomes of Turfgrasses Using a Digital Image Analysis System

Измерения столонов и корневищ Turfgrasses с помощью системы анализа цифровых изображений

Length and diameter of stolons or rhizomes are usually measured using simple rulers and calipers. This procedure is slow and laborious, so it is often ...

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

Обнаружение вирусов от биоаэрозоли, используя анион обмен смолы

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Точные и автономной системы для обнаружения насекомых появление моделей

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

Detection of 3-Nitrotyrosine in Atmospheric Environments via a High-performance Liquid Chromatography-electrochemical Detector System

Обнаружение 3-Нитротирозин в атмосферных условиях через высокую производительность системы жидкого хроматографии электрохимический детектор

3-nitrotyrosine (3-NT) is generated from the tyrosine residue in atmospheric bio-aerosol proteins via a reaction with ozone (O3) and nitrogen dioxide ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Обнаружение тилапии озеро вирус с помощью обычных RT-PCR и SYBR зеленый RT-ПЦР

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Новый портативный в Vitro экспозиции кассета для аэрозольных проб

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...