Name: a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-03-20T12:30:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

ونشكر بهوميك ديبا، آرون ميلر وبوب هيوز للمساعدة التقنية. وقدمت سلالات كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة "برامج الهياكل الأساسية للبحوث" (P40 OD010440). ونحن ممتنون لجورجيا بريتون وودز وأعضاء ليثغو وكابي "معلوف مختبرات" لإجراء مناقشات مفيدة. حركة التحرير أيده AG000266 T32 منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة (NIH) واليسون الطبية مؤسسة/أمريكا الاتحاد للشيخوخة شواغر زمالة بحثية. كان يؤيد هذا العمل بمنحه من "مختبرات بيواجي"، على منحة من مؤسسة هيلبلوم L. لاري، فضلا عن "المعاهد الوطنية للصحة" منح UL1024917، دعم "اتحاد البحوث المتعددة التخصصات" في جيروسسينسي، و 1R01AG029631-01A1 إلى G.J.L.

<ol>
	<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+activation+of+a+food+deprivation+signal+extends+lifespan.">Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span.">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307 (5707), 258-262 (2005).</li><li>Melov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase/catalase+mimetics.">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).</li><li>Benedetti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan.">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).</li><li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Genes+Tied+to+Endocrine,+Metabolic,+and+Dietary+Regulation+of+Lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+Genomic+RNAi+Screen.">New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen.</a> PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li><li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants.">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li><li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).</li><li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+chemicals+that+increase+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).</li><li>Fabian, T. J., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+age-synchronous+mass+cultures+of+Caenorhabditis+elegans.">Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans.</a> J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).</li><li>Greer, E. L., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+dietary+restriction+regimens+extend+lifespan+by+both+independent+and+overlapping+genetic+pathways+in+C.+elegans.">Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans.</a> Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).</li><li>Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+dietary+restriction+for+genetic+epistasis+analysis+and+gene+discovery+in+C.+elegans.">Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans.</a> PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).</li><li>Hamilton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).</li><li>Frankowski, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+and+dimethyl+formamide+increase+lifespan+of+C.+elegans+in+liquid.">Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid.</a> Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genetic+background+and+experimental+reproducibility+on+identifying+chemical+compounds+with+robust+longevity+effects.">Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects.</a> Nat Commun. 8, 14256 (2017).</li></ol>

الكتاب يعلن أن أي كيان التمويل التي تدعم هذا العمل أي مساهمة في جمع البيانات، وتحليل النتائج، أو قرار بنشر.

هنا لقد قمنا بوصف طريقة بسيطة لاستزراع C. ايليجانس في لوحات 96-جيدا. يمكننا وصف هذه الثقافات لاستخدامها في الكشف عن المواد الكيميائية وفحوصات عمر، ولكن يمكن استخدامها لأنواع عديدة من الاختبارات. بينما سابقا كانت ظروف الثقافة المتعددة جيدا للفحص الكيميائية المبلغ عنها8، بما في ذلك تحليل عمر10، تختلف المقايسة الموصوفة هنا في عدة طرق. مقايسة عمر الموصوفة هنا تستخدم لوحات 96-جيدا ويعتمد على طفرات العقيمة (بدلاً من التعقيم الكيميائي) ويستخدم أجار الثقافة الشروط، ويستخدم السائل بسيطة التعامل مع نقل الديدان وهو سجل يدوياً في نقطة النهاية. قد يكون النهج المختلفة المستخدمة في هذا التحليل لمساعدة الباحثين تبحث عن فحص الأساليب التي تتضمن هذه الشروط.
مركز العناصر الحاسمة لهذا البروتوكول أساسا على نوعية اللوحات المنتجة للانزيم. أولاً، عندما صنع ألواح يتحتم أن السطح أجار مجاني فقاعات وعيوب أخرى. هذه الاختلافات في السطح أجار تؤدي دائماً تقريبا إلى تختبئ وفقدان البئر. ثانيا، وهذا البروتوكول يعتمد على تجفيف قبالة السوائل المودعة خلال مراحل الإعداد والتخدير. من الأهمية بمكان أن تتم إزالة هذه السوائل تماما، ولكن لا تصبح جفت في أجار. الروايات المتناقلة، ويبدو أن الديدان في الآبار التي ليست تماما المجففة (سباحة في السائل) يعيش أطول من الآبار الجافة بشكل صحيح، بينما الإفراط تجفيف اللوحات ويؤدي إلى جفاف وتكسير لاجار، الأمر الذي يؤدي إلى دودة تختبئ والخسارة. عنصر حاسم آخر من هذا البروتوكول هو الحفاظ على ظروف معقمة. كما مع أي عمر المقايسة، وهناك الكثير من العمل تشارك في إعداد لوحة، وهناك العديد من الفرص والوقت للمقايسة تخريب التلوث تسوية وتنمو على اللوحات.
بينما الإنزيم عمر الموصوفة هنا مفيد لفحص المركبات في C. ايليجانس، فيقتصر على الخلفيات الوراثية خاصة، كما أنها لا تعتمد على سلالة عقيمة حساسة (ts) درجة حرارة؛ كنا TJ1060، الذي قد penetrance العقم عالية. وهذا يقيد سلالات متاحة للفحص مع هذا الأسلوب. النهج البديلة بما في ذلك عبور إتس الطفرات العقيمة إلى الخلفية المطلوبة أو استخدام التعقيم الكيميائي. لقد حاولنا عدم التعقيم الكيميائي مع هذا التحليل، ولكن ينبغي أن يكون ممكناً. وتشمل العقبات المحتملة وضع المطهر على الديدان في المرحلة الصحيحة وفي الجرعة الصحيحة. هنا يستخدم بروتوكول وصف موزع سائلة بسرعة، ولكن لا يبدو أن الاستغناء عن البالغين على نحو فعال. لذا، هذه الديدان وضع على اللوحات ولذلك يجب أن تعامل مع التعقيم الكيميائي على اللوحات. تحديد الجرعة المثلى والتوقيت سيكون مهما للنجاح. وتشمل الاستراتيجيات البديلة استخدام أسلوب الاستغناء عن نقل الكبار. في الماضي، وقد وجدنا أن آلات قادرة على تحديد وفرز البالغين عموما أبطأ بكثير من معالجات السائل البسيطة، التي يمكن الاستغناء عن عجائن متجانسة من اليرقة مع وقف التنفيذ.
وبصفة عامة، نستخدم هذا الأسلوب بسرعة الشاشة المواد الكيميائية والعلاجات لآثار إيجابية كبيرة على عمر. الطريقة فعالة بشكل خاص عند استخدامها بجرعات متعددة، وتكرار أرقام عالية، ورصد دقيق لعناصر سلبية دائماً الحفاظ على ويتخلل بين لوحات الاختبار. عناصر إيجابية مفيدة أيضا عند تصميم وتنفيذ الشاشات الموصوفة في هذه المخطوطة. ومع ذلك، يكون إيجابية فعالة، عنصر التحكم سيلزم قوية إلى حد ما و/أو قوية جداً. عندما تم نشر الشاشة أصلاً، تعذر تعريف مركب قوية ومتينة على نحو ملائم. حاليا، هناك العديد من التقارير في الأدب 'الشيخوخة' من المرشحين المحتمل لعناصر إيجابية مفيدة في الشاشات الموصوفة هنا. كما هو موضح في المقطع شاشة مرشح قسم النتائج المتوقعة من هذه المخطوطات، وفي الشكل 2 و الجدول 1, NP1 مجمع عنصر إيجابي فعال لهذه الشاشة. ونؤكد عموما يضرب إيجابية من هذه الشاشات مع فحوصات عمر القياسية على ألواح الثقافة 3 مم.

هنا هو وصف بروتوكول تم تطويره لفحص إنتاجية عالية من المركبات الكيميائية للآثار على عمر ايليجانس كاينورهابديتيس . البروتوكول نفسه سهولة التكيف للشاشات المظهرية الأخرى، بما في ذلك دراسات استخدام سلالات C. ايليجانس المراسل. هذا البروتوكول واستخدمت بنجاح لتحديد مركب نشيطة بيولوجيا رواية، NP1 (نيتروفينيل-الببرازين، 1)، الذي يمتد بقوة عمر C. ايليجانس من خلال إليه قيود غذائية. NP1 ووصف لأثر ذلك على عمر، بما في ذلك وصف للمسارات الجينية في اللعب، وكان سابقا في أماكن أخرى ووصف1. أن يتضمن التقرير أيضا وصفاً للنتائج من تطبيق على نطاق واسع من الشاشة. هنا يصف لنا بالكثير من التفصيل أكبر المنهجية والإعداد للشاشة نفسها، وقابلة للتطوير للتطبيقات الصغيرة والكبيرة الحجم.
وكان الهدف الذي أدى إلى إنشاء البروتوكول هو موضح هنا لتطوير منصة ثقافة C. ايليجانس يسمح بالفحص السريع للمكتبات الكيميائية الكبيرة للمركبات النشيطة بيولوجيا رواية. بينما الشاشات الكيميائية قد أجريت قبل وضع هذا البروتوكول، هذه كانت أساسا الصغيرة و/أو نوع مرشح النهج2،3. في الواقع، تستخدم معظم الشاشات أداؤها في المختبر على عشرات مركبات فحوصات مقاومة الإجهاد، مع يجري فرزهم لطول العمر آثار4مرات. هذه الدراسة تسعى بدلاً من ذلك إلى الشاشة مباشرة للآثار عمر. بشكل ملحوظ، كانت هناك بعض الأوصاف في الكتابات العلمية في وقت أداء شاشات كيميائية واسعة النطاق مع C. ايليجانس. في الواقع، مقارنة بالأنواع الأخرى من شاشات5،،من67، الفحص الكيميائية على نطاق واسع استخدام C. ايليجانس ويبدو أن العمالة الناقصة.
وهناك أوصاف اثنين من شاشات كيميائية واسعة النطاق في C. ايليجانس التي استخدمت كأساس لتطوير هذا النهج. وكان أول هذه دراسة أنيقة من بيتر روي المختبر باستخدام شاشات الكيميائية للتعرف على المركبات التي يمكن التشويش تنمية الحيوانات. ثم تابعت الدراسة مع شاشة الطفرات إلى الأمام لتحديد أهداف هذه المواد الكيميائية8الوراثية. استخدام البروتوكول الموصوفة في هذه الدراسة باتيس 24-جيدا، وهو ببساطة غير قابلة للتطبيق لتلبية الاحتياجات المحددة لهذه الدراسة (كميات محدودة من المادة الكيميائية في مكتبة ومساحة حاضنة المتاحة محدودة). وكانت الدراسة الأخرى الشاشة مايكل بيتراشيك جزيء صغير المبتكرة والطموحة لتوسيع نطاق المواد الكيميائية9،10عمر. هذه الدراسة تستخدم لوحات 384-جيدا والثقافات السائل. وكان السمة الرئيسية الأخرى لهذه الشاشة استخدام فودر (5-فلوروديوكسيوريديني) تمنع إنتاج ذرية كيميائيا. بعد كبير النظر في البروتوكول، المذكورة في هذه الدراسة، تم تفادي التعقيم الكيميائي والثقافات السائل من C. ايليجانس .
على الرغم من أن فودر يستخدم على نطاق واسع في تجارب عمر C. ايليجانس ، كانت هناك مخاوف أن فودر قد يسبب تفاعلات العقاقير غير متوقعة، أو أن فودر نفسها قد يكون له بعض التأثير على عمر. مؤخرا هذا القلق الأخير تم التحقق من، على الأقل في بعض التركيزات وخاصة في 25 درجة مئوية11. للالتفاف على مشكلة التلوث بذرية، تم استخدام سلالة C. ايليجانس TJ1060، التي تؤوي اثنين من الطفرات حساسة مستقلة في درجات الحرارة (جمعية مهندسي البترول-9 (hc88) الأول؛ rrf-3(b26)II) أن إلغاء إنتاج الحيوانات المنوية، ولقد ثبت أن تكون مفيدة للثقافات الجماعية للسكان متزامن12. هذه السلالة عقيمة تماما عند 25 درجة مئوية، ولكن سوف تنتج ذرية عند مثقف في 15-20 درجة مئوية. استخدمت هذه الدراسة ظروف الثقافة التقليدية، مع الديدان الزحف على سطح أجار، النتائج التي تم الحصول عليها مع الثقافات السائلة ليست دائماً استنساخه بلوحات أجار التقليدية. في حين أن هذه الظاهرة ليست مفهومة تماما، فإنه قد ثبت أن الديدان مثقف في الاستجابة السائل للدكتور (تقييد الغذائية) بطريقة مختلفة من الديدان مثقف في وسائل الإعلام القياسية13،14. ولذلك فمن المعقول أن السائل وسائل الإعلام يمكن أن تخفي بعض mimetics الدكتور خلاف ذلك سوف يتم تحديدها مع الشاشة.
وقد استقر على شروط الثقافة أجار، اعتبرت خيارات مختلفة لتسجيل أداء الآبار في هذا التحليل. بينما تتوفر فحوصات استناداً إلى مختلف الآلي أو التصوير، أنها استلزمت حيازة ونشر تحديا من الناحية التقنية الأجهزة، معظمها باهظ التكلفة. حين النظر في هذه الخيارات، من الضروري الرجوع إلى السابق عمر الشاشات من جميع الأنواع. وفي النهاية، استخدمت هذه الدراسة أسلوب التهديف مقتبس من الجينوم كله [رني] الشاشة مختبر لي سيلفيا سيو ل تعمل عمر15. على وجه التحديد، تم إعداد جميع عمر لوحات بنفس الطريقة، ولكن تم رصد الضوابط السلبية فقط. متى تأكدت لوحات التحكم السلبي قرب وفيات كاملة، قد سجل لوحات الاختبار باليد. في هذه الشاشة على نطاق واسع، أكدتها إيجابيات إعادة الاختبار مع المواد الكيميائية الطازجة باستخدام تكرار ثلاث نسخ من إيجابيات الأولية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1311px;" width="1311">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">LB Broth Miller Granules</td>
			<td style="width:363px;">VWR</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Unispense&#160;</td>
			<td>Wheaton Science Products</td>
			<td></td>
			<td>automated fluid dispensing apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96 well assay plate; COSTAR 3370</td>
			<td style="width:363px;">Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multidrop 384; automated 8 channel dispenser</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manufactored worm pick</td>
			<td style="width:363px;">Genesee Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Belly Dancer Orbital Shaker</td>
			<td>Stovall Life Science inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">microplate shaker; MTS 2/4 Digital</td>
			<td>IKA Works, inc.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler</td>
			<td>&#160;Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor&#160;</td>
			<td>Sorenson Bioscience, inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manual 8 or 12 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:363px;">we use rainin&#8230;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film&#160;</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">table top centrifuge; Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans

ايليجانس كاينورهابديتيس كائن مفيدة لاختبار تأثيرات المواد الكيميائية على علم وظائف الأعضاء. الكائن الحي كله جزيء صغير شاشات عرض مزايا هامة لتحديد الهياكل الكيميائية النشيطة بيولوجيا التي يمكن تعديلها تعمل معقدة مثل عمر. الموصوفة هنا بروتوكول بسيط لإنتاج مئات لوحات الثقافة 96-جيدا مع أرقام متسقة إلى حد ما من C. ايليجانس في كل بئر. المقبل، ونحن تحديد كيفية استخدام هذه الثقافات إلى الشاشة الآلاف من المواد الكيميائية للآثار على عمر ديدان أسطوانية C. ايليجانس. هذا البروتوكول يجعل استخدام سلالات عقيمة حساس درجة الحرارة وظروف بلايت أجار والحيوان بسيطة التعامل مع تيسير إنتاج الثقافات الحيوان متزامنة للفحص السريع وارتفاع الإنتاجية.

نبدأ بدراسة نتائج تمثيلية من استخدام هذا البروتوكول لفحوصات عمر 96-جيدا. في المثال الأول، واستخدمت الأسلوب الشاشة من خلال المواد الكيميائية 30,000 بنجاح تحديد المواد الكيميائية أن تمديد عمر C. ايليجانس، ويشمل أيضا نتائج من شاشة متابعة إعادة اختبار أفضل أداء باستخدام المواد الكيميائية البروتوكول نفسه. وكانت هذه النتائج هو موضح سابقا1. يستخدم المثال الثاني نفس البروتوكول في شاشة أصغر حجماً من المركبات المرشحة.
الشاشة على نطاق واسع وإعادة اختبار: الشاشة على نطاق واسع اختبار المركبات 30,000 أجريت في جرعة واحدة، في تكرار. ولذلك تم اختبار كل مادة كيميائية في بئرين مع مجموع سكان حيوانية المتوقعة من 20. لتحقيق هذا الهدف، تم فحص ثلاث مجموعات منفصلة من مركبات 10,000 (بالتكرار) على مدى فترة ~ 3 أشهر لتغطية المركبات 30,000 كامل. هذا كان عمله في جزء منه، لضمان مبلغاً معقولاً التهديف اليدوية في نهاية المقايسة والمطلوبة ما مجموعة 260 ألواح المقايسة 96-جيدا في كل مجموعة من المجموعات. في لوحات مكتبة المخزون، والوارد فقط 80 بئرا المجمع؛ تكرار واحد من مركبات 10,000 يجعل 125 فحص الصفائح. استخدمت هذه الدراسة 2 replicates مع 10 لوحات التحكم السلبي في كل مجموعة. لزيادة الإنتاجية، ولوحات كانت سجل عندما قيمت السكان السيطرة السلبية التي شهدت وفيات ~ 99%. اختبار جميع الآبار ثم بحثت للديدان الحية.
المواد الكيميائية في الآبار مع دودة حية واحدة كانت تسمى يضرب. المواد الكيميائية في الآبار التي تحتوي على أكثر من 1 دودة على قيد الحياة كانت أيضا يسمى يضرب، وعلاوة على ذلك جميع الديدان في هذه الآبار (حيا وميتا) أحصى لتوليد نقاط بسيطة (نسبة إلى النتيجة على قيد الحياة؛ عدد الديدان حيا مقسوماً على عدد القتلى الديدان). كل مادة كيميائية في المكتبة يمكن لذلك أن يسمى ضرب مرتين ويمكن أن تلك الزيارات، ولكن قد لا يكون عشرات المرتبطة بها. تم استدعاء المواد الكيميائية المميزة 512 مرات (مرة واحدة على الأقل) من شاشة مركبات 30,000. وقد أجرى الشاشة قصد تحديد الآثار المؤيدة طول العمر (استنساخه) قوية و/أو قوية. هاتين الخاصيتين مختلفة قد آثاراً متميزة. يمكن زيادة المواد الكيميائية القوية كبيرة عمر، في هذه الحالة فإننا نتوقع نسبة عالية من الديدان على قيد الحياة بشكل جيد تلك المادة الكيميائية. لمواد كيميائية قوية، يتوقع كلا replicates قد الديدان الحية. كان مرتبة في القائمة على أساس هذه المعايير. 179 من المواد الكيميائية أسفرت عن ارتفاع نسبة عشرات على قيد الحياة، أو أصيبت في كلا replicates واختيرت لذلك لإعادة الاختبار. معظم المواد الكيميائية المتبقية التي كانت تسمى يضرب، لكن لم يتم تحديدها لإعادة الاختبار، قد لا يتضمن إلا دودة واحدة على قيد الحياة في أحد الآبار نسخ متماثل.
وكان إعادة الاختبار من الزيارات المؤداة، مشابهة للشاشة الرئيسية ما عدا مع replicates 3 (السكان الحيوانية الإجمالية المتوقعة من 30)، والقياس الكمي الدقيق لإعمار الحيوانات في لوحات التحكم غير المعالجة. وأضيفت هذه التغييرات للمساعدة في المقارنة بين آبار الاختبار والمراقبة. أمرت بإعادة 179 مرات الكيميائية، تضعف إلى 10 ملم، واقتحمت 96 لوحات جيدا. استخدمت الآبار 24 الداخلية فقط للمقايسة إعادة اختبار (الإصدارات الحالية من هذا البروتوكول قد استخدمت الآبار 32 الداخلية كما هو موضح في المقطع بروتوكول لإعادة اختبار شاشات) والمركبات كانت إعادة اختبارها في ثلاث نسخ بست لوحات المقايسة المراقبة السلبية تعامل مع المذيب [دمس]. لوحة التحكم سلبية واحدة سجلت بشكل دوري لبقاء مجموع (الشكل 1أ). عند حوالي 95% من مراقبة الحيوانات قد لقوا حتفهم، وسجل جميع لوحات كانت تماما (كل معاملة العيش واحصى القتلى الديدان).
لاستدعاء يضرب من نتائج إعادة الاختبار، تم وقف في النقاط على قيد الحياة نسبة متوسط الانحرافات القياسية السلبية السيطرة + 2 (SD). لاختبار الآبار، بلغ في المتوسط % على قيد الحياة (وقت التسجيل) حسبت العشرات بمتوسط نقاط النسبة المئوية على قيد الحياة من replicates ثلاثة لكل بئر. لهذا التحليل خاصة، حسبت العشرات على قيد الحياة نسبة متوسط آبار المراقبة السلبية كمتوسط replicates ثلاثة آبار 48 (2 مجموعات من لوحات التحكم سلبية ثلاث). وكان SD المستخدمة في استدعاء عدد من مجموعة المواد الكيميائية إعادة اختبار SD عبر المراقبة السلبية 48 بلغ متوسط النسبة المئوية العشرات على قيد الحياة. باستخدام هذه الاستراتيجية، وجدت هذه الدراسة تبلغ 57 من المكتبة إعادة اختبار المركبات 179، مما يدل على أن ما مجموعة 32% من المواد الكيميائية إعادة اختبار اختبار إيجابي (الشكل 1ب). Binning من عشرات حيا متوسط النسبة المئوية لمراقبة واختبار الآبار السلبية أشارت إلى أن اختبار الآبار تفوقت الآبار التحكم (الشكل 1ج).
مرشح الشاشة: شاشات صغيرة الحجم يمكن أن يؤديها بطريقة مماثلة لإعادة اختبار الموصوفة أعلاه. هنا، يمكننا وصف النتائج من شاشة مرشح مع مركبات 139. تم تجميع هؤلاء المرشحين كالهياكل المحتمل لتعزيز طول العمر. على هذه الشاشة، أجرينا replicates 5 لوحات الاختبار على جرعتين مختلفة (50 ميكرون و 100 ميكرومتر). بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا 8 لوحات التحكم السلبي، مع لوحة تحكم إيجابي واحد (NP1) التي تحتوي على جرعتين مختلفة؛ ميكرومتر 50 و 100 ميكرومتر.
وتم رصد لوحات التحكم السلبي حتى ~ 90% حيوانات قد لقوا حتفهم. في ذلك الوقت، وقد سجل الآبار عد الديدان الحية والميتة في كل مراقبة الآبار، ومن آبار الاختبار يحتوي على الديدان الحية. واستخدمت نسبة حيا في الوقت سجل لحساب متوسط الدرجات على قيد الحياة النسبة المئوية لكل بئر. كان 32 بئرا للضوابط السلبية، وعشرات على قيد الحياة نسبة من 8 replicates. لعناصر إيجابية، كانت هناك 4 درجات جيدا في المتوسط عبر replicates 4 لكل جرعة. ودعي يضرب الآبار مع نقاط على قيد الحياة نسبة متوسط ما يزيد متوسط نقاط المراقبة السلبية في المئة على قيد الحياة + 2 التنمية المستدامة. قطع هذا ترك يضرب 14 من الشاشة مرشح واستبعاد كل من آبار المراقبة السلبية. أن قطع وشملت أيضا كل من عنصر التحكم إيجابية تعامل الآبار تعامل في 100 ميكرومتر و 50% من عناصر إيجابية في 50 ميكرومتر. وترد هذه النتائج هنا كإهمال بلغ متوسط نسبة عشرات حيا 50 ميكرومتر (الشكل 2أ) والشاشات الاختبار 100 ميكرومتر (الشكل 2ب).
أخيرا، كانت جميع لوحات سجل جديد في نقطة وقت متأخر، التي تناظر وقت عندما تعامل أكبر من 99 ٪ السيطرة السلبية الحيوانات قد لقوا حتفهم. تلك النتائج أشارت إلى أن آبار مراقبة إيجابية يقوم الآن خارج آبار المراقبة والاختبار السلبي (الشكل 2-ج). وفي حين اختبار الآبار التي كانت أفضل قليلاً من عناصر سلبية. هذه النتيجة الأخيرة منحازة بالإشارة إلى أن العديد من الآبار الاختبار يبدو معرض سمية مقارنة بمعاملة السيطرة (الجدول 1)، وبالتالي الخلط هذا التفسير البسيط. وهذا كان متوقعا، نظراً للمكتبة مرشح كان شاشة حقيقية من المواد الكيميائية ذات النشاط البيولوجي غير معروف في C. ايليجانس، بينما الشاشة إعادة اختبار أساسا فرزهم للمركبات غير سامة. نظراً لهذه الشاشة الرئيسية للمركبات التي تطول عمر، إلى حد كبير المواد الكيميائية السامة يجب أن لا في إعادة اختبار تم.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig1.jpg"> الشكل 1 : الممثل ناتجة عن ارتفاع الشاشة الإنتاجية وإعادة الاختبار حالة البقاء على الحياة (أ) منحنى من لوحة تحكم سلبي ممثل المستخدمة في التحليل إعادة اختبار. وقد شيد هذا المنحنى من سجل جميع الديدان الحية والميتة في الآبار 24 المستخدمة في هذا التحليل 4 مرات على مدى 18 يوما من المقايسة. في يوم 18 من مرحلة البلوغ، تم تقييم الضوابط أن يكون بقاء ~ 5% وقد سجل كل اختبار عنصر التحكم ولوحات ثم أيضا. (ب) جدول يلخص نتائج الشاشة وإعادة اختبار. (ج) بينينج من عشرات الآبار في المتوسط على قيد الحياة نسبة لشروط مراقبة واختبار من شاشة إعادة اختبار. لعناصر التحكم، عشرات هي من آبار 48 كل يتألف من متوسط 3 replicates. نتائج الاختبار هي من 179 بئرا كل منها تتألف من درجة متوسطة من replicates ثلاثة. يرد الرقم 1 من منشور سابق1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig2.jpg"> الشكل 2 : الممثل النتائج من شاشة مرشح (أ) بينينج من النتائج من الشاشة المرشح 50 ميكرومتر. تمثل نتائج اختبار الآبار 139 نقاط على قيد الحياة نسبة متوسط من 5 replicates. نتائج المراقبة السلبية 32 تتكون من متوسط الدرجات على قيد الحياة نسبة من 8 replicates. 4 نتائج إيجابية تحكم تتألف من عشرات على قيد الحياة نسبة متوسط من 4 replicates (إجمالي 16 آبار NP1 تحتوي على 50 ميكرومتر). (ب) بينينج من النتائج من الشاشة المرشح 100 ميكرومتر. كل ما هو نفسه كما في (أ)، إلا أن اختبار الآبار وعناصر إيجابية يعاملون تركيزات 100 ميكرومتر. تظهر لوحات التحكم السلبي نفسه في على حد سواء (A و B). (ج) ممثل ناتجة عن إعادة تسجيله اللوحات عند نقطة وقت تأخر الشديد نسبيا. عناصر إيجابية هائلة تفوقت جميع الآخرين، وإذا كانت المحاسبة فقط للنسبة المئوية من الآبار مع الديدان حية عند هذه النقطة الزمن، الذي هو متحيز ضد آبار الاختبار كما هو موضح في النص الرئيسي و الجدول 1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="6">Binning متوسط النسبة المئوية عشرات على قيد الحياة</td>
		</tr>
<tr>
<td>عشرات مجمعة</td>
			<td>جميع القتلى (0)</td>
			<td>1-10</td>
			<td>11-20</td>
			<td>21-30</td>
			<td>31-40</td>
			<td>> 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>إعادة اختبار</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td># (-) لعنصر التحكم</td>
			<td>16</td>
			<td>31</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># اختبار الآبار (50µM)</td>
			<td>46</td>
			<td>69</td>
			<td>50</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مرشح الشاشة</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td># (-) لعنصر التحكم</td>
			<td>0</td>
			<td>11</td>
			<td>21</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># (+) التحكم (50µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># (+) التحكم (100µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td># اختبار الآبار (50µM)</td>
			<td>94</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># اختبار الآبار (100µM)</td>
			<td>86</td>
			<td>25</td>
			<td>21</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: يؤدي الممثل من binning شاشات مختلفة نقدم هنا binning عشرات حيا متوسط النسبة المئوية من الشاشتين (إعادة اختبار والمرشح). في شاشة إعادة اختبار، الذروة مماثلة لمراقبة سلبية مع اختبارات إعادة متجاوزا مراقبة سلبية هائلة على الحق الجانب (المعمرة) من الجدول. وهذا يدل على وجود عدة مركبات المؤيدة طول العمر موجودة في مجموعة إعادة اختبار. في شاشة المرشح، أننا نرى أن الذروة في الفئة جميع القتلى، بينما هناك أيضا إشارة واضحة من الجانب الأيمن من الجدول. هذا يشير إلى وجود المركبات المؤيدة طول العمر في تعيين مرشح، ولكن أيضا يدل على وجود سمية كبيرة بين المجموعة المرشحة للمركبات.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط لسرعة إنتاج مئات من وسائط النمو السلكية أجار، لوحات الثقافة 96-جيدا مع أرقام متسقة من ايليجانس كاينورهابديتيس لكل بئر. هذه الثقافات مفيدة لفحص الكائنات كله المظهرية. نحن نركز هنا على استخدام هذه الثقافات إلى شاشة المواد الكيميائية للآثار المؤيدة طول العمر.

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

العرض الداخلية غشاء البكتيريا لفحص مكتبة من الأجسام المضادة شظايا

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

توليف معيار مبتور للكم من 2-Arashidonoylglycerol في Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

الفحص الفلوري القائم على كيمياء النقر ل Apolipoprotein N-acyltransferase من توصيف الإنزيم إلى الفحص عالي الإنتاجية

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

فحص الأجزاء القائم على الرنين المغناطيسي النووي في الحد الأدنى من العينة ولكن وضع الأتمتة الأقصى

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...