Name: a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-03-20T12:30:00
Duration: 8 min 49 s
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हम तकनीकी सहायता के लिए दिपा Bhaumik, हारून मिलर और बॉब ह्यूजेस धंयवाद । उपभेदों CGC द्वारा प्रदान की गई, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है । हम जॉर्जिया वुड्स और उपयोगी विचार विमर्श के लिए वृद्धि, कपाही और Melov लैब्स के सदस्यों के लिए आभारी हैं । एमएल स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) प्रशिक्षण अनुदान T32 AG000266 और एक एलिसन मेडिकल फाउंडेशन/अमेरिकन फेडरेशन ऑफ एजिंग रिसर्च पोस्ट डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । यह काम BioAge लैब्स, एक लैरी एल Hillblom फाउंडेशन अनुदान, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्वास्थ्य अनुदान UL1024917 के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, Geroscience पर अनुशासनात्मक अनुसंधान कंसोर्टियम का समर्थन है, और 1R01AG029631-01A1 G.J.L.

<ol>
	<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+activation+of+a+food+deprivation+signal+extends+lifespan.">Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. 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लेखकों की घोषणा है कि कोई धन इस काम का समर्थन इकाई डेटा के संग्रह पर कोई इनपुट था, परिणामों का विश्लेषण, या प्रकाशित करने का निर्णय ।

यहां हमने 96-वेल प्लेट्स में संवर्धन C. एलिगेंस के लिए एक सरल विधि बताई है । हम रासायनिक स्क्रीनिंग और उंर परख में उपयोग के लिए इन संस्कृतियों का वर्णन है, लेकिन वे परख के कई प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जबकि रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए बहु अच्छी तरह से संस्कृति की स्थिति पहले8सूचना दी गई है, उंर विश्लेषण10के लिए सहित, परख यहां वर्णित कई मायनों में अलग है । उंर परख यहां वर्णित 96 का इस्तेमाल अच्छी तरह से प्लेटें, बाँझ म्यूटेंट पर निर्भर करता है (बजाय रासायनिक नसबंदी के), का प्रयोग करती है संस्कृति की स्थिति, सरल तरल हैंडलिंग कीड़ों को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग करता है, और मैंयुअल रूप से समापन बिंदु पर रन बनाए । विभिंन इस परख में इस्तेमाल दृष्टिकोण जांच तरीकों कि इन शर्तों में शामिल की तलाश में शोधकर्ताओं के लिए मदद की हो सकती है ।
इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण तत्वों परख के लिए उत्पादित प्लेटों की गुणवत्ता पर मुख्य रूप से केंद्र । प्लेटें बनाने के पहले, यह आवश्यक है कि आगर सतह बुलबुले और अन्य खामियों से मुक्त है । आगर सतह में इन परिवर्तनों को लगभग हमेशा burrowing और अच्छी तरह से नुकसान के लिए सीसा । दूसरा, इस प्रोटोकॉल सेटअप और drugging चरणों के दौरान जमा बंद तरल पदार्थ सुखाने पर निर्भर करता है । यह महत्वपूर्ण है कि इन तरल पदार्थ पूरी तरह से हटा रहे हैं, लेकिन आगर सूख नहीं बन जाता है । Anecdotally, यह प्रतीत होता है कि कुओं में कीड़े है कि पूरी तरह से सूख नहीं कर रहे है (तरल में तैराकी) से अधिक ठीक से सूखे कुओं रहते हैं, जबकि अधिक प्लेटों के सूखने की ओर जाता है और सुखाना के खुर, जो कीड़ा burrowing और नुकसान की ओर जाता है । इस प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण तत्व बाँझ स्थितियों को बनाए रखने है । किसी भी उंर परख के साथ के रूप में, वहां की थाली सेटअप के साथ शामिल काम का एक बहुत कुछ है, और कई अवसरों और समय संदूषण बर्बाद कर व्यवस्थित और प्लेटों पर बढ़ने के लिए परख के लिए मौजूद हैं ।
जबकि उंर परख यहां वर्णित सी. एलिगेंसमें यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है, यह विशेष आनुवंशिक पृष्ठभूमि तक ही सीमित है, के रूप में यह एक तापमान संवेदनशील (टीएस) बाँझ तनाव पर निर्भर करता है; हम TJ1060, जो उच्च बाँझ penetrance है इस्तेमाल किया । यह इस विधि के साथ स्क्रीनिंग के लिए उपलब्ध उपभेदों को प्रतिबंधित करता है । वांछित पृष्ठभूमि में टीएस बाँझ उत्परिवर्तनों को पार करने या रासायनिक नसबंदी का उपयोग सहित वैकल्पिक दृष्टिकोण. हमने इस परख के साथ रासायनिक नसबंदी की कोशिश नहीं की है, लेकिन यह संभव होना चाहिए । संभावित बाधाओं को सही मंच पर और उचित खुराक में कीड़े पर बंध्याकरण रखने शामिल हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक तरल मशीन है कि तेजी से है का उपयोग करता है, लेकिन करने के लिए वयस्कों को प्रभावी ढंग से वितरण प्रकट नहीं होता । तो, इन कीड़ों प्लेटों पर विकसित और इसलिए प्लेटों पर नसबंदी रासायनिक के साथ इलाज किया जाना चाहिए । इष्टतम खुराक और समय का निर्धारण सफलता के लिए महत्वपूर्ण होगा । वैकल्पिक रणनीतियों एक वितरण विधि है कि वयस्कों को स्थानांतरित कर सकते है का उपयोग शामिल है । अतीत में, हमने पाया है कि मशीनों की पहचान करने और तरह वयस्कों आम तौर पर बहुत सरल तरल संचालकों, जो निलंबित लार्वा के समरूप slurries वितरण कर सकते है की तुलना में धीमी कर रहे हैं ।
सामांय में, हम तेजी से उंर पर बड़े सकारात्मक प्रभाव के लिए रसायनों और उपचार स्क्रीन के लिए इस विधि का उपयोग करें । विधि विशेष रूप से प्रभावी है जब एकाधिक खुराक, उच्च दोहराने की संख्या के साथ प्रयोग किया जाता है, और नकारात्मक नियंत्रण है कि हमेशा बनाए रखा और परीक्षण प्लेटों के बीच interspersed के करीब निगरानी । इस पांडुलिपि में वर्णित स्क्रीन को डिजाइन और कार्यान्वित करते समय सकारात्मक नियंत्रण भी उपयोगी होते हैं । हालांकि, एक प्रभावी सकारात्मक होने के लिए, नियंत्रण के लिए काफी शक्तिशाली और/ जब स्क्रीन मूल रूप से लागू किया गया था, एक उपयुक्त प्रबल और मजबूत यौगिक पहचाना नहीं जा सका । वर्तमान में, यहां वर्णित स्क्रीन में उपयोगी सकारात्मक नियंत्रण के लिए संभावित उंमीदवारों के ' बुढ़ापे ' साहित्य में कई रिपोर्टों रहे हैं । इस पांडुलिपि के अपेक्षित परिणाम खंड के उंमीदवार स्क्रीन अनुभाग में वर्णित के रूप में, और चित्रा 2 और तालिका 1में, यौगिक NP1 इस स्क्रीन के लिए एक प्रभावी सकारात्मक नियंत्रण है । हम आम तौर पर 3 mm संस्कृति प्लेटों पर मानक उंर परख के साथ इन स्क्रीन से सकारात्मक हिट की पुष्टि करें ।

यहाँ एक प्रोटोकॉल वर्णित है कि Caenorhabditis एलिगेंस उम्र पर प्रभाव के लिए रासायनिक यौगिकों के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए विकसित किया गया था । प्रोटोकॉल ही आसानी से अंय phenotypic स्क्रीन के लिए अनुकूल है, अध्ययन के उपयोग रिपोर्टर सी एलिगेंस उपभेदों सहित । इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक एक उपंयास जैविक रूप से सक्रिय यौगिक की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया था, NP1 (nitrophenyl-पिपेराजीन 1), कि दृढ़ता से एक आहार प्रतिबंध तंत्र के माध्यम से सी. एलिगेंस की उंर का विस्तार । NP1 और जीवन पर इसके प्रभाव का एक लक्षण वर्णन, खेल में आनुवंशिक रास्ते का विवरण सहित, पहले कहीं1बताया गया था । उस रिपोर्ट में स्क्रीन के बड़े पैमाने पर कार्यांवयन से परिणामों का वर्णन भी शामिल है । यहां हम बहुत अधिक विस्तार में वर्णन पद्धति और स्क्रीन ही है, जो दोनों छोटे और बड़े पैमाने पर अनुप्रयोगों के लिए स्केलेबल है की स्थापना ।
लक्ष्य है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल के निर्माण के लिए नेतृत्व के लिए एक C. एलिगेंस संस्कृति मंच है कि उपंयास के लिए बड़े रासायनिक पुस्तकालयों के तेजी से जांच के लिए अनुमति दी जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों विकसित किया गया था. जबकि रासायनिक स्क्रीन इस प्रोटोकॉल के विकास से पहले किया गया है, ये मुख्य रूप से छोटे पैमाने पर थे और/या उंमीदवार प्रकार2,3दृष्टिकोण । वास्तव में, स्क्रीन के अधिकांश यौगिकों का उपयोग तनाव प्रतिरोध परख के दसियों पर प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया, लंबी उंर के प्रभाव के लिए जांच की जा रही है4। इस अध्ययन के बजाय सीधे उंर के प्रभाव के लिए स्क्रीन की मांग की । उल्लेखनीय है कि सी. एलिगेंसके साथ बड़े पैमाने पर रासायनिक स्क्रीन के प्रदर्शन के समय वैज्ञानिक साहित्य में कुछ वर्णन थे. दरअसल, स्क्रीन के अंय प्रकारों की तुलना में5,6,7, बड़े पैमाने पर रासायनिक स्क्रीनिंग का उपयोग कर एलिगेंस के अधीन होने लग रहा था ।
इस दृष्टिकोण को विकसित करने के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया गया था कि सी. एलिगेंस में बड़े पैमाने पर रासायनिक स्क्रीन के दो विवरण थे । इनमें से पहले पीटर रॉय की प्रयोगशाला से एक सुरुचिपूर्ण अध्ययन के लिए रासायनिक स्क्रीन का उपयोग करने यौगिकों कि पशुओं के विकास perturb सकता है की पहचान । अध्ययन तो एक आगे mutagenesis स्क्रीन के साथ पीछा करने के लिए इन रसायनों के आनुवंशिक लक्ष्य8की पहचान । प्रोटोकॉल है कि अध्ययन में वर्णित 24 अच्छी तरह से खोपड़ी है, जो इस अध्ययन के विशिष्ट जरूरतों (पुस्तकालय और सीमित उपलब्ध मशीन अंतरिक्ष में रासायनिक की सीमित मात्रा) के लिए बस के लिए काम कर रहा था इस्तेमाल किया । अंय अध्ययन था माइकल Petrascheck अभिनव और महत्वाकांक्षी छोटे-अणु के लिए स्क्रीन रसायन9विस्तार,10। कि अध्ययन 384-अच्छी तरह से प्लेटें और तरल संस्कृतियों का इस्तेमाल किया । संतति उत्पादन को बाधित करने के लिए इस स्क्रीन की अन्य मुख्य विशेषता FUDR (5-fluorodeoxyuridine) का प्रयोग था । उस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल के काफी विचार के बाद, दोनों रासायनिक नसबंदी और सी. एलिगेंस की तरल संस्कृतियों को टाल दिया गया.
हालांकि FUDR व्यापक रूप से ग. एलिगेंस उंर के प्रयोगों में प्रयोग किया जाता है, वहां चिंता है कि FUDR अप्रत्याशित दवा बातचीत का कारण हो सकता है, या कि FUDR ही उंर पर कुछ असर हो सकता है । हाल ही में इस बाद चिंता का विषय मांय किया गया है, कम से कम कुछ सांद्रता पर और विशेष रूप से 25 डिग्री सेल्सियस में11। संतान संदूषण की समस्या को दरकिनार करने के लिए, C. एलिगेंस तनाव TJ1060 इस्तेमाल किया गया था, जो दो स्वतंत्र तापमान संवेदनशील उत्परिवर्तनों बंदरगाह (एसपीई-9 (hc88) मैं; rrf-3 (b26) द्वितीय) कि शुक्राणु उत्पादन को समाप्त करने और करने के लिए उपयोगी हो प्रदर्शन किया गया है तुल्यकालिक आबादी12की जन संस्कृतियों के लिए । यह तनाव 25 डिग्री सेल्सियस पर पूरी तरह से बाँझ था, लेकिन जब 15-20 डिग्री सेल्सियस पर कल्चरित संतति पैदा करेगा । इस अध्ययन के साथ पारंपरिक संस्कृति की स्थिति का इस्तेमाल किया, आगर की सतह पर रेंगने कीड़े, के रूप में तरल संस्कृतियों के साथ प्राप्त परिणाम हमेशा पारंपरिक आगार प्लेटों के साथ reproducible नहीं कर रहे हैं । हालांकि इस घटना को पूरी तरह समझ नहीं है, यह दिखा दिया गया है कि तरल में प्रसंस्कृत कीड़े डॉ (आहार प्रतिबंध) मानक मीडिया13,14पर संस्कृतिकेकीड़े से एक अलग तरीके से जवाब । इसलिए यह प्रशंसनीय है कि तरल मीडिया कुछ DR mimetics कि अंयथा स्क्रीन के साथ की पहचान की जाएगी मुखौटा सकता है ।
आगर संस्कृति की स्थिति पर बसे होने के लिए, इस परख में कुओं के प्रदर्शन को स्कोरिंग के लिए विभिंन विकल्पों पर विचार किया गया । जबकि विभिंन स्वचालित या इमेजिंग आधारित परख उपलब्ध थे, वे अधिग्रहण आवँयक और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण उपकरणों की तैनाती, जिनमें से ज्यादातर नकारात्मक स्तर तक महंगे थे । इन विकल्पों पर विचार Whilst, यह सभी प्रकार के पिछले जीवन स्क्रीन का उल्लेख आवश्यक था । अंत में, इस अध्ययन के एक स्कोरिंग विधि सिउ सिल्विया ली है लैब पूरे जीनोम RNAi स्क्रीन phenotypes15के लिए से अनुकूलित करने के लिए इस्तेमाल किया । विशेष रूप से, सभी आयु प्लेट एक ही तरीके से स्थापित किया गया था, लेकिन केवल नकारात्मक नियंत्रण पर नजर रखी गई । एक बार जब नकारात्मक नियंत्रण प्लेटें पूर्ण मृत्यु दर के पास होने की पुष्टि की थी, परीक्षण प्लेट हाथ से बनाए गए थे । इस बड़े पैमाने पर स्क्रीन में, सकारात्मक नए सिरे से तैयार रसायनों के साथ पुनः परीक्षण द्वारा पुष्टि की गई, प्राथमिक सकारात्मक के तपसिल दोहराता का उपयोग कर ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1311px;" width="1311">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">LB Broth Miller Granules</td>
			<td style="width:363px;">VWR</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Unispense&#160;</td>
			<td>Wheaton Science Products</td>
			<td></td>
			<td>automated fluid dispensing apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96 well assay plate; COSTAR 3370</td>
			<td style="width:363px;">Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multidrop 384; automated 8 channel dispenser</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manufactored worm pick</td>
			<td style="width:363px;">Genesee Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Belly Dancer Orbital Shaker</td>
			<td>Stovall Life Science inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">microplate shaker; MTS 2/4 Digital</td>
			<td>IKA Works, inc.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler</td>
			<td>&#160;Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor&#160;</td>
			<td>Sorenson Bioscience, inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">manual 8 or 12 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:363px;">we use rainin&#8230;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film&#160;</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">table top centrifuge; Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis एलिगेंस शरीर क्रिया विज्ञान पर रासायनिक प्रभाव के परीक्षण के लिए एक उपयोगी जीव है । पूरे जीव छोटे अणु स्क्रीन जैविक रूप से सक्रिय रासायनिक संरचनाओं कि ऐसी उम्र के रूप में जटिल phenotypes को संशोधित कर सकते हैं की पहचान के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं । यहां वर्णित 96 के सैकड़ों के उत्पादन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से सी एलिगेंस के काफी सुसंगत संख्या के साथ संस्कृति प्लेट है । अगले, हम निर्दिष्ट कैसे इन संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए निमेटोड सी एलिगेंसकी उंर पर प्रभाव के लिए रसायनों के हजारों स्क्रीन । इस प्रोटोकॉल तापमान संवेदनशील बाँझ उपभेदों, आगर प्लेट शर्तों का उपयोग करता है, और सरल पशु हैंडलिंग स्क्रीनिंग के लिए सिंक्रनाइज़ पशु संस्कृतियों के तेजी से और उच्च प्रवाह उत्पादन की सुविधा के लिए ।

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

यहां हम तेजी से निमेटोड विकास मीडिया आगार के सैकड़ों उत्पादन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन, 96-अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से Caenorhhabditis एलिगेंस के अनुरूप संख्या के साथ संस्कृति प्लेटों. ये संस्कृतियां संपूर्ण जीवों की phenotypic स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हैं । हम इन संस्कृतियों का उपयोग कर समर्थक दीर्घायु प्रभाव के लिए रसायन स्क्रीन पर यहां ध्यान केंद्रित ।

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए वीवो हाइड्रोक्सिल रेडिकल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग में

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

एंजाइम लक्षण वर्णन से उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग तक एपोलिपोप्रोटीन एन-एसाइलट्रांसफेरेज़ के लिए क्लिक-रसायन विज्ञान आधारित फ्लोरोमेट्रिक परख

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

न्यूनतम नमूना लेकिन अधिकतम स्वचालन मोड में एनएमआर-आधारित टुकड़ा स्क्रीनिंग

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

सक्रिय Caenorhabditis elegans परमाणु निकालें और इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए पुनर्गठन के अलगाव

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...