Name: metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays at JoVE.com

وأيد هذا العمل بمنحه "إينبري اتفاقية استكهولم" من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم-المعاهد الوطنية للصحة (P20GM103499 للنمو الحقيقي) ويمنح CA555536 & CA154664 من المعهد الوطني للسرطان ل P.H.H. هذا البرنامج كان دعما جزئيا بمنحه لكلية تشارلستون من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال كلية قبل & برنامج تعليم العلوم الجامعية والمنح المقدمة من المركز الوطني "بحوث الموارد" (5 P20 RR016461) وفي المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (8 P20 GM103499) من المعاهد الوطنية للصحة.

1-الثقافة والوسم الأيضية
<ol><li>كزة مرة وسط الغطاء من أنابيب الصغير-الطرد المركزي معقم 1.5 مل بإبرة عيار 18 للسماح بالتهوية المناسبة. تطعيم 500 ميليلتر لتستكمل العقيمة 7 ح 9 مرق مع 5 ميليلتر من سميجماتيس م. من كاتب الثقافة12نمت بين عشية وضحاها. ملاحظة: وصفه للتر واحد من 7 ح 9 مرق: مسحوق 4.7 ز التجاري 7 ح 9، 2 مل والغليسيرول، 1 مل توين 80، ز 0.85 كلوريد الصوديوم، 5 ز الزلال، 2 غ سكر العنب، ح2س (إعادة التخزين الإجمالية إلى 1 لتر).<ol>
<li>
(تحذير) في أعقاب الممارسات القياسية تصاحبها، سبايك وسائط الثقافة مع 20 µCi/mL [32ف] نا2هبو4. تنمو البكتيريا في الانفعالات 37 درجة مئوية و 1,200 دورة في الدقيقة، في حاضنة شاكر وضعها خلف درع اكريليك سميك عيار 9 ملم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>في المرحلة مدلج (O.D.600 نانومتر ~ 0.5)، نقل ثقافة كاملة في أنبوب 2 مل ملولبة وبيليه البكتيريا المشعة في درجة حرارة الغرفة التي سينتريفوجينج لجمع 2 دقيقة في غ. س 10,000 طافية المحتوية على الديامونيوم المشعة غير مسجلة في حاوية النفايات المناسبة.</li>
</ol>2-إعداد الكشف الكلي
ملاحظة: يتم استخراج الكشف التام من الكريات البكتيرية استخدام تجاري كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (التي تتضمن ثيوسيانات جوانيدينيوم والفينول كلوروفورم) يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
<ol><li>أضف 1 مل كاشف استخراج الحمض النووي الريبي التجارية وحوالي 200 ميليلتر من الزجاج الخرز على بيليه. كاب الأنبوب بشكل أمن، وتعطيل البكتيريا في الخالطون لمدة 2 دقيقة تحت الانفعالات كحد أقصى، (وضع رقم خمسة في الصك الذي تم اختياره (انظر الجدول للمواد)).</li>
	<li>عينة للطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. نقل المادة طافية إلى أنبوب 2 مل جديدة وتجاهل الخرز على نحو ملائم. إضافة 0.2 مل كلوروفورم ويهز الأنبوبة بقوة باليد للطرد المركزي س. 15 في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>جمع المرحلة مائي من العينة في أنبوب جديد بزيارة خاطفة الأنبوب في 45°. تجنب رسم أي من الطور البيني أو الطبقة العضوية. إضافة 2 ميليلتر مرسب الملونة و 0.5 مل من الكحول 100%. اهتز الأنبوب بقوة باليد للطرد المركزي س. 5 في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>إزالة المادة طافية من الأنبوب وتجاهل على نحو ملائم كما الكسر السائل قد تحتوي على آثار من النشاط الإشعاعي. الهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق ثم ريسوسبيند في 200 ميليلتر من 2 × سترات الصوديوم المالحة (SSC)، 0.1% (w/v) دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) النهائي. ملاحظة: تكوين المخزون 20 X SSC هو 3.0 م كلوريد الصوديوم، سترات الصوديوم 0.3 متر، ودرجة الحموضة 7.0.</li>
</ol>3-إعداد لوحات الطابعة جيدا 96
ملاحظة: يتم طباعة [ميكروارس] الحمض الريبي النووي النقال يدوياً مع اثنين وأربعين 70-مير النوكليوتيد الحمض النووي التكميلية إلى النهاية 3 ' لكل سميجماتيس م. الحمض الريبي النووي النقال (باستثناء محطة التقييم القطري المشترك) باستخدام أررايير ثمانية دبوس. ترد في تسلسل المسابير اليغنوكليوتيد الحمض النووي، فضلا عن تخطيط التحقيق في لوحة جيدا والمصفوفة (تكميلية الملف 1-الورقة 1 إلى 3 على التوالي).
<ol><li>تصميم الحمض النووي يسبر بأول تسلسل الحمض الريبي النووي النقال أثناء استرداد أو الحمض الريبي النووي النقال ترميز الجينات من قواعد الحمض الريبي النووي النقال مثل الحمض الريبي النووي النقال الجينوم قاعدة بيانات13. تقليم حفظت 3 ' نهاية التقييم القطري المشترك إذا كان ترميز. تكملة عكس التسلسل الناتج عن ذلك. أمر التحقيق استناداً إلى النيوكليوتيدات 70 أولاً.</li>
	<li>ريسوسبيند الجاف المسابير الحمض النووي في الماء. ضبط تركيز التحقيقات إلى 100 ميكرومتر. في صفيحة جيدا 96، إعداد ميليلتر 120 من 50 ميكرومتر أوليجوس في 3 X SSC, 0.01% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي النهائي (تمييع 60 ميليلتر من المسابر الأسهم في بئر الفردية مع 60 ميليلتر من 6 X SSC, 0.01% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي.</li>
	<li>وتغطي اللوحة برقائق القصدير لمنع التبخر أو التلوث، وتجمد فورا والحفاظ في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة.</li>
</ol>4-مجموعة الطباعة
<ol><li>ذوبان الجليد لوحة 96-جيدا في درجة حرارة الغرفة (يستغرق حوالي 20 دقيقة).</li>
	<li>قم بتسمية الشرائح الزجاجية المغلفة بأمين بقلم الماس. ضع الشرائح في وحدة الفهرسة. اتبع مواضع الشبكة، والقيام على النحو التالي.<ol>
<li>وتراجع بعناية أطراف النسخ المتماثل بالآبار.</li>
		<li>بلطف طباعة الصفيف على الشرائح الزجاجية، باستخدام ضغط الحد الأدنى (ستشعر بمقاومة صغيرة). متابعة الطباعة دون تنظيف أرايير حتى تنتهي مع كتلة أ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>عندما تكون جاهزاً للانتقال إلى الكتلة التالية، اتبع الإجراء الغسيل الموصوفة أدناه.<ol>
<li>النسخ المتماثل في المبيض 5 في المائة وتراجع وهزه برفق.</li>
		<li>اضغط وحدة النسخ المتماثل إلى ورقة ماصة.</li>
		<li>تراجع وحدة النسخ المتماثل في الماء المقطر وهزه برفق واضغط في ورقة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.</li>
		<li>تراجع وحدة النسخ المتماثل في الايزوبروبانول وهزه برفق واضغط في الورقة.</li>
		<li>جاف وحدة النسخ المتماثل على المروحة لحوالي 20 ثانية قبل الانتقال إلى كتلة التالي من لوحة 96-جيدا. تواصل العدد المطلوب من المطبوعات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>السماح للشرائح لتجف ثم التشعب أوليجوس إلى الشريحة استخدام كروسلينكير الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر.<ol>
<li>تعيين مستوى الطاقة إلى 999,990 µJ/سم2.</li>
		<li>طرح على وجه الشرائح على سطح نظيف في كروسلينكير. اضغط على "ابدأ".</li>
	</ol>
</li>
	<li>كتلة في الصفيف بين عشية وضحاها في 450 مل من عرقلة الحل في محرض مغناطيسي، في درجة حرارة الغرفة وتحت تحريض بطيئة. جمع وإعادة استخدام حل حظر يصل إلى أربعة إضعاف. ملاحظة: وصفه لعرقلة الحل: 125 ملم الفوسفات المخزن المؤقت (نة2بو4/Na2هبو4-) الرقم الهيدروجيني 7.2، الحزب الديمقراطي الصربي 2.25% (w/v)، يدتا 0.5 مم، 0.5 X SSC، جيش صرب البوسنة 1% (w/v).</li>
	<li>يغسل الشرائح 2 مرات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في 500 مل ماء المقطر. الجاف للشرائح التي سينتريفوجينج لمدة 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة في أجهزة الطرد مركزي ميكرواري. تخزين الصفائف في مكان جاف ومظلم لمدة تصل إلى 6 أشهر.</li>
</ol>5-مصفوفة التهجين
<ol><li>قبل التهجين شطف الشرائح في الماء المغلي والجاف باستخدام الطرد المركزي (كما هو الحال في 4.6).</li>
	<li>ضع الصفيف داخل كاسيت تهجين وتحميل عينات الحمض النووي الريبي راديولابيليد.</li>
	<li>تشغيل محطة التهجين والغسل الآلي لإمكانية تكرار نتائج الحد الأقصى.<ol>
<li>برنامج الخطوات كما يلي. حشيات الشرط لمدة 2 دقيقة في 75 درجة مئوية. إدخال التحقيق في 60 درجة مئوية. تؤذي المسابير وعينات دقيقة 5 عند 90 درجة مئوية. هجن عينات ح 3 في 60 درجة مئوية.<ol>
<li>تغسل شرائح عند 50 درجة مئوية مرتين مع 2 s تدفق 10 X التعاون بين بلدان الجنوب، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% (w/v)، وعقد 20 س. شرائح المياه والصرف الصحي في 42 درجة مئوية مرتين مع 0.1 s تدفق 10 X SSC، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، وعقد الشرائح يغسل س. 20 في 42 درجة مئوية مرتين مع 0.1 X التعاون بين بلدان الجنوب ، تدفق 10 ق وق عقد 20.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>الجاف للشرائح باستخدام الطرد المركزي (كما هو الحال في 4.6).</li>
</ol>6-مصفوفة القياس الكمي
<ol><li>لف الشرائح باستخدام طبقة رقيقة من بلاستيك. تحقق من الشرائح لإشارة المشعة باستخدام عداد غايغر على الإعداد الأكثر حساسية لها. عرض شرائح على شاشة تخزين فوسفور في كاسيت تعرض في درجة حرارة الغرفة عن 10 إلى 90 ح اعتماداً على قوة الإشارة. ملاحظة: كما تختلف حساسية عدادات جيجر صك واحد إلى آخر، مرات التعرض يجب أن يكون الأمثل تجريبيا.</li>
	<li>مسح الشرائح في 50 ميكرومتر قرار استخدام فوسفوريماجير. تحديد حجم وخلفية طرح كثافة النشاط الإشعاعي في كل بقعة التحقيق باستخدام البرمجيات الحرة "ي الصورة" ترقية مع التعريف ميكرواري.</li>
	<li>تنظيم ومعالجة البيانات باستخدام جدول بيانات إلكترونية. توليد خرائط الحرارة باستخدام أداة التنسيق الشرطي. تمثل على سبيل المثال كل إشارة مسبار ككسر (معبراً عنه في الألف) من إشارة مسبار مجموع.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli.">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).</li><li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences.">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li><li>Gieg&#233;, R., J&#252;hling, F., P&#252;tz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+transfer+RNAs:+similarity+and+variability.">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li><li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs.">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li><li>Torres, A. G., Pi&#241;eyro, D., Rodr&#237;guez-Escrib&#224;, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-L&#233;ger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+modifications+in+human+tRNAs+are+incorporated+at+the+precursor+tRNA+level.">Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level.</a> Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).</li><li>Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Mar&#233;chal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes.">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li><li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing.">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOt:+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels.">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).</li><li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST,+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases.">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-&#946;-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression.">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-&#946;-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li><li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis.">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li><li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GtRNAdb:+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence.">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li><li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli.">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li></ol>

وأعلن عدم تضارب المصالح.

انبعاثات جسيمات بيتا معروفة وكلاء والاريثروسين وجراثيم14، بيد أن الإشعاعات في نطاق اختبار لا تأثير كبير على الخلية اللياقة البدنية. عد التﻷلؤ أظهرت أن إدماج النشاط الإشعاعي في 25 في المائة من مجموع الخلية مقتطفات وفي وقت لاحق، 1% من الكشف الكامل المنقي.
المسابير أحجام متطابقة ودرجة حرارة ذوبان قابلة للمقارنة ومحتوى GC، جنبا إلى جنب مع بروتوكول موحد لاكتشاف ماكرواراي، يسمح التهجين والتحديد الكمي لقياس مستويات الحمض الريبي النووي النقال مباشرة من إشارات موضعية غير متحيزة.
بقعة استنساخه ومحددة. في مجموعة دينامية كبيرة وقابل للتعديل بسهولة عتبة يسمح التنميط الأنواع وفيرة منخفضة، مثل ترنس المرتبطة بوليسوميس، ببساطة عن طريق إطالة الصفيف التعرض مرات9. بعد الاستثمارات الأولية للمعدات اللازمة، المتوسطات إدارة التكلفة لكل عينة، بما في ذلك المواد الاستهلاكية، 15 دولار كل العينات.
بقعة ينطبق على أي كائن حي المجين الذي يتوفر لتصميم التحقيق. نموذج الكائنات الحية التي تزرع في المختبر بالمرشحين المثالي لوسم الأيضية. كما ترميز الجينوم الثدييات غالباً العديد من إيسوديكوديرس (ترناس أن حصة أنتيكودونس متطابقة ولكن عرض الاختلافات الصغيرة في تسلسل هذه الهيئة) يلزم المسابير تحولت جزئيا الحفاظ على التهجين متجانس وثيق الحمض الريبي النووي النقال الأنواع. وأخيراً، تعطي خلايا الثدييات ملتصقة كميات أقل عادة من الحمض النووي الريبي مجموع الكائنات الحية التي نمت في تعليق مثل م. سميجماتيس، حيث الثقافات بحاجة إلى الارتقاء إلى حد كبير بالمقارنة مع.

وتتقلب مستويات الحمض الريبي النووي النقال الخلوي وفقا لظروف مثل نوع الخلية، والبيئة، والإجهاد1،،من23. بقعة، "منهاج مبسط" لمراقبة الحمض الريبي النووي النقال، هو الأصلي، ويمكن الاعتماد عليها، وتقنية واضحة تسمح الكمي سريع ودقيق لمستويات نقل الجيش الملكي النيبالي في الكائنات الحية التي نمت في المختبر.
وقد ترناس استقرارا ملحوظا هياكل التعليم الثانوي والتعليم العالي4. كما أنها تعرض العديد من التعديلات بوستترانسكريبشونال5. وتمثل هذه الميزات الهيكلية الكبيرة وحواجز التسلسل يتحامل أو في بعض الأحيان منع التنميط الحمض الريبي النووي النقال المباشر واستنساخه باستخدام تقنيات القياس الكمي المعيار القياسي رنا6. المجموعات البحثية العالم اضطر إلى تطوير التقنيات الإبداعية ولكن غالباً معقدة لتقييم مستويات الحمض الريبي النووي النقال الخلوي. وتشمل بعض هذه الطرق: فصل ترناس أيضي المسمى الغرواني الكهربي ثنائي الأبعاد (1) جنبا إلى جنب مع منهجية الإحالة بقعة بوصمة عار شمال1؛ (2) القياس الكمي الفردية بالشمالية لطخة استخدام موحدة بعناية المشعة الحمض النووي المسابير7؛ (3) بعد استخراج العلامات مع فلوروتشروميس سينين تليها ميكرواري تحليل3، و (4) في المختبر تجريد تعديلات الحمض الريبي النووي النقال باستخدام الإنزيمات ديموديفيكيشن المؤتلف جنبا إلى جنب مع النسخ العكسي واللاحقة 8من التسلسل الفائق.
بقعة تركيبة بسيطة والاصلي من النهجين موحدة وواضحة: هيئة الجيش الملكي النيبالي (1) وضع العلامات، الذي يتكون في التوليف، في نمو الكائنات الحية، المشعة الكشف التام والحمض الريبي النووي النقال (2) ماكروارايس، أداة منهجية والمنمنمة الجينوم الأمثل لعزل الحمض الريبي النووي النقال.
نماذج مبسطة من الكائنات الحية إلى منصة التقدير الكمي. ويتم تحليل مباشرة بعد استخراج، ولم تتم معالجة أي المزيد مما يحد بشكل كبير التحيزات مقارنة بالتقنيات التي تتطلب استخراج بعد التضخيم أو علاجات الانزيمية. بقعة تنوعاً ويمكن دمجها بسهولة لوجود بوليسومي لتحديد وتقدير حجم الحمض الريبي النووي النقال الفئات السكانية الفرعية المرتبطة فعلياً بترجمة ريبوسوم.
البروتوكول المعروضة هنا هو الأمثل بكتريا سميجماتيس، وأنها استخدمت أيضا بنجاح في ترنس الشخصية في الإشريكيّة القولونية9 Saccharomyces cerevisiae10، والماوس، والثقافات الخلية البشرية11 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass slide indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide arrayer replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash and blot station</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replicator pin dryer</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>K2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizer / Automated hybridization and washing station</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>Hyb10022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Eppendorf Themomixer</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap 2 ml tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21-403-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[32P] Na2HPO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX011001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm glass beads</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>9831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini bead mill</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphore screen</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP SR 0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Typhoon FLA7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>Select series 254 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray centrifuge</td>
			<td>Arrayit Corporation</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>700084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use needles</td>
			<td>BD (Becton Dickinson)</td>
			<td>305185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-666-317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precipitant (GlucoBlue)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridisation cassette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>63-0035-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M126-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>A3611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Phosphate buffer pH 7.2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ63974AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays

نقل الكشف (الحمض الريبي النووي النقال) هي وفيرة قصيرة غير الترميز الحمض النووي الريبي الأنواع التي تكون عادة من 76 إلى 90 النيوكليوتيدات في الطول. ترناس مسؤولة مباشرة عن تخليق البروتين بترجمة codons في مرناً في تسلسل الأحماض الأمينية. واعتبرت ترنس طويلة كبيت حفظ الجزيئات التي تفتقر إلى الوظائف التنظيمية. بيد أن مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى أن مستويات الحمض الريبي النووي النقال الخلوي تتقلب في المراسلات لظروف مختلفة مثل نوع الخلية، والبيئة، والإجهاد. تقلب التعبير الحمض الريبي النووي النقال يؤثر تأثيراً مباشرا ترجمة الجينات، تفضل أو قمع التعبير عن البروتينات خاصة. في نهاية المطاف فهم دينامية تخليق البروتين يتطلب تطوير أساليب قادرة على تقديم لمحات الحمض الريبي النووي النقال عالية الجودة. الطريقة التي نقدم هنا يسمى البقعة، التي تقف على "منصة مبسطة" لمراقبة الحمض الريبي النووي النقال. بقعة يتكون من ثلاث خطوات بدءاً بوسم الأيضية للثقافات الخلية مع الديامونيوم المشعة، تليها جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم استخراج الكشف الإجمالي المشعة وأخيراً طبع التهجين في المنزل ماكروارايس. وتقدر مستويات الحمض الريبي النووي النقال بقياس كثافة النشاط الإشعاعي في كل بقعة التحقيق. في البروتوكول المعروضة هنا لنا صورة ترنس في بكتريا سميجماتيس mc2155، nonpathogenic بكتيريا غالباً ما تستخدم ككائن نموذج لدراسة مرض السل.

يتطابق البيولوجية المستقلة الثلاثة تبين أن ظروف النمو المختبرة، جميع سميجماتيس م. ترنس يعبر عن أعلى مستوى الخلفية (الشكل 1). في هذه التجربة خاصة، تتألف لاحظ الانحراف المعياري لكل مسبار بين 2% (Arg (TCT)) و 22% (Cys (الائتلاف)) بمتوسط قدرة 5% (الشكل 1). تغييرات خاطئة بين replicates كبيرة تتأثر بعوامل مثل إعداد مصفوفة والتهجين. إمكانية تكرار نتائج عالية ويتحقق من خلال الطباعة الصفيف دقيقة ومتسقة، فضلا عن الآلي التهجين عينة. هناك فرق 5 إضعاف بين الحمض الريبي النووي النقال إيل (غات) والحمض الريبي النووي النقال (Val (TAC)، أعلى وأدنى وفرة الأنواع على التوالي. بقعة يظهر أن التعبير عن إيسواكسيبتورس الحمض الريبي النووي النقال ليست موحدة. إيسواكسيبتورس هي الأنواع التي عقد نفسه من الأحماض الأمينية ولكن عرض تسلسل anticodon مختلفة وذلك فك codons مختلفة في مرناس. على سبيل المثال، أعرب جميع ألانين إيسواكسيبتورس مستويات مماثلة، بينما ارجينين أعلى وأدنى قبول ترنس تختلف حسب 3-fold.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> رقم 1: النتائج ماكرواراي الممثل الحمض الريبي النووي النقال. (أ) البكتيريا الممسوحة ضوئياً والماوس وماكروارايس البشرية. استخدام صفائف سميجماتيس م. المسابير 43 فقط بدلاً من 48 للفأر والإنسان. نتيجة لذلك، يعرض الصفيف البكتيرية بقع فارغة 40 (المسابر تتكرر ثماني مرات في كل مجموعة) التي تمتزج مع الخلفية. تتركز معظمها في الزاوية اليسرى العليا. (ب) تمثيل الرسم البياني و heatmap من التشكيلات الجانبية للحمض الريبي النووي النقال في سميجماتيس م. تحت ظروف النمو المثلى. إشارات مسبار متوسط ثلاث تجارب مستقلة (بما في ذلك النمو البكتيرية، ووسم الأيضية، التهجين الاستخراج والمصفوفة) ويعبر عنها وفقا لقيم ألف من إجمالي ترنس. يتم الإشارة إلى الانحرافات المعيارية ل replicates ثلاثة أشرطة الخطأ وظلال من اللون البرتقالي على الرسم البياني و heatmap على التوالي. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays at JoVE.com

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

يصف لنا منصة تحليل الحمض النووي الريبي نقل الأصلي المسمى بقعة (منهاج مبسط لمراقبة الحمض الريبي النووي النقال). بقعة في الوقت ذاته تدابير الخلوية مستويات ترنس جميع العينات البيولوجية وفي ثلاث خطوات فقط، وفي أقل من 24 ساعة.

وسم الأيضية والتنميط لنقل الكشف باستخدام ماكروارايس

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

في الموقع وصفها من الحمض النووي النسخ المتماثل في ذبابة الفاكهة الكبار المبايض عن طريق ايدو تلطيخ

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

منهجية للكشف عن دقة مثلايشن الحمض النووي

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين في الموقع

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae الأيضية وسم مع 4-ثيوراسيل والتحديد الكمي حديثا توليفها مرناً كوكيل للنشاط الثاني رنا بوليميراز

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

الخلية على أساس فحوصات للكشف التي يمكن أن تعزز على وجه التحديد مرناً الترجمة غير الترميز سينيوب

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing الكشف فضله منذ فترة طويلة باستخدام الجينات-تفعيل كريسبر

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...