Name: metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק SC INBRE מ הלאומית המכון כללי רפואי למדע - NIH (P20GM103499 כדי R.G.), מעניקה CA555536 & CA154664 מן המכון הלאומי לסרטן P.H.H. תוכנית זו נתמכה בחלקו על ידי מענק מכללת צ'רלסטון הווארד יוז מכון רפואי דרך ה מכללה קדם & לתואר ראשון במדעי החינוך תוכנית על ידי מענקים של המרכז הארצי עבור משאבים למחקר (5 P20 RR016461) הלאומית המכון כללי רפואי למדעים (8 P20 GM103499) מ המכונים הלאומיים לבריאות.

1. תרבות, תיוג מטבולית
<ol><li>לתקוע פעם למרכז הכיפה של צינורות מיקרו-צנטריפוגה mL 1.5 סטרילי עם מחט אל תדאגי כדי לאפשר אוורור נאות. לחסן µL 500 של שהושלם סטרילי 7 שעות 9 מרק עם 5 µL של smegmatis מ מ starter תרבות מבוגר לילה12. הערה: את המתכון ליטר אחד של 7 שעות 9 הוא ציר: 4.7 g מסחרי H 7 9. אבקה, 2 מ ל גליצרול, 1 מ"ל Tween 80, g 0.85 NaCl, 5 g אלבומין, 2 גרם דקסטרוז, H2O (להביא את הנפח הכולל עד 1 ליטר).<ol>
<li>
(זהירות) בעקבות שיטות המכון להגנת סטנדרטי, ספייק התקשורת תרבות עם µCi/mL 20 [32P] נה2HPO4. לגדול חיידקים על העצבנות 37 ° C ו- 1,200 סל ד, ב חממה שאכר מאחורי מגן אקרילי בעובי 9 מ מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בשלב midlog (O.D.600 ננומטר ~ 0.5), להעביר את תרבות שלמה לתוך צינור 2-mL בורג-קאפ ואת הצניפה חיידקים רדיואקטיבי בטמפרטורת החדר על ידי צריך שתוציאו במשך 2 דקות ב- 10,000 x ג לאסוף supernatant האורטו רדיואקטיבי המכיל טריטוריה ב פח אשפה המתאים.</li>
</ol>2. הכנת RNAs סה
הערה: RNAs הכולל המחולצים כדורי חיידקי באמצעות ריאגנט החילוץ RNA מסחרי (מכיל guanidinium thiocyanate, פנול, כלורופורם) ע פ הפרוטוקול של היצרן.
<ol><li>להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט החילוץ RNA מסחרי ו כ-200 µL של חרוזי זכוכית על גבי בגדר. קאפ הצינור בצורה מאובטחת, לשבש את בקטריאלי ב מהמגן למשך 2 דקות תחת עצבנות המרבי, (קביעת מספר חמש על המכשיר שבחרת (ראה את הטבלה של חומרים)).</li>
	<li>צנטריפוגה מדגם ב g x 12,000 10 דקות ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע צינור 2-mL וזורקים את החרוזים כראוי. להוסיף 0.2 מ של כלורופורם, לנער צינור נמרצות על ידי יד צנטריפוגה ס' 15 ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>לאסוף את פאזה מימית של המדגם לתוך צינור חדש על ידי לדוג את הצינור ב- 45 מעלות. להימנע מהדפסת לאטמוספרה או שכבה אורגני. להוסיף 2 µL של precipitant בצבע ו- 0.5 מ ל אלכוהול איזופרופיל 100%. לנער את הצינור נמרצות על ידי יד צנטריפוגה ס' 5 ב 12,000 x g 10 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע מהצינור ולמחוק כראוי כפי השבר נוזלי עשוי להכיל עקבות של קרינה רדיואקטיבית. אוויר יבש גלולה עבור 5 דקות ואז resuspend ב 200 µL של 2 X תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס), 0.1% (w/v) dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) הסופי. הערה: ההרכב של המניה 20 X האס הוא 3.0 M NaCl, 0.3 M סודיום ציטרט, pH 7.0.</li>
</ol>3. הכנת לוחות מדפסת טוב 96
הערה: מיקרו-מערכים tRNA מודפסים באופן ידני עם ארבעים ושניים 70-מר דנ א משלים 3' בסוף כל tRNA smegmatis מ' (מסוף המרכז לאמנות עכשווית נכלל) באמצעות arrayer 8 פינים של oligonucleotides. מסדרות את הגששים oligonucleotide דנ א, כמו גם את הפריסה החוקרת את הצלחת-. ובכן, את המערך מסופקים (1 קובץ משלים - גיליון 1 עד 3 בהתאמה).
<ol><li>עיצוב ה-DNA רגשים הראשון רצפים tRNA איחזור או גנים קידוד tRNA ממסדי tRNA כגון tRNA גנומית מסד הנתונים13. לקצץ שנשמרת 3' סוף המרכז לאמנות עכשווית, אם מקודד. הפוך משלים הרצף שנוצר. . בדיקת סדר בהתבסס על נוקלאוטידים תחילה 70</li>
	<li>Resuspend יבש DNA הגששים במים. להתאים את הגששים ריכוז 100 מיקרומטר. ב- 96 טוב-צלחת, להכין µL 120 של 50 מיקרומטר oligos ב 3 X האס, 0.01% (w/v) מרחביות הסופי (שתדללו 60 µL של הגששים מניות בודדות היטב עם 60 µL של 6 X האס, 0.01% (w/v) מרחביות.</li>
	<li>מכסים בצלחת בנייר כסף כדי למנוע אידוי או זיהום, להקפיא מיידית ולשמור ב-20 ° C עד שהוא נדרש.</li>
</ol>4. מערך ההדפסה
<ol><li>להפשיר את הצלחת 96-ובכן בטמפרטורת החדר (לוקח בערך 20 דקות).</li>
	<li>תווית שקופיות זכוכית מצופים אמין עם עט יהלום. במקום מגלשות לתוך יחידה יצירת אינדקס. בצע את מיקומי רשת, לעשות כדלקמן.<ol>
<li>בזהירות טובלים הפינים משכפל הבארות.</li>
		<li>הדפס בעדינות את המערך בשקופיות זכוכית, באמצעות לחץ מינימלי (אתם תרגישו התנגדות קטנה). להמשיך בהדפסה ללא ניקוי את arrayer עד גמר עם בלוק א</li>
	</ol>
</li>
	<li>כשתהיה מוכן להמשיך הלאה הבלוק הבא, בצע את ההליך כביסה המתוארים להלן.<ol>
<li>טובלים משכפל לבן 5% ומנערים בעדינות.</li>
		<li>לחץ משכפל לנייר סופג.</li>
		<li>טובלים משכפל במים מזוקקים, לנער בעדינות, והקש לתוך נייר. חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
		<li>טובלים משכפל ב אלכוהול איזופרופיל, לנער בעדינות, והקש לתוך העיתון.</li>
		<li>יבש המשכפלים על המאוורר עבור 20 s לפני שהמשכנו הבלוק הבא של צלחת 96-ובכן. להמשיך מספר הדפסים הרצוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאפשר את השקופיות להתייבש ואז crosslink oligos אל השקופית באמצעות crosslinker UV של 254 ננומטר.<ol>
<li>הגדר את רמת האנרגיה µJ/cm 999,9902.</li>
		<li>לשים את הפנים שקופיות על משטח נקי ב crosslinker. לחץ על "התחל".</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחסום את מערכי לילה ב 450 מ של חסימת פתרון על פגים, בטמפרטורת החדר ותחת עצבנות איטי. לאסוף ולהשתמש פתרון חסימה עד פי ארבעה. הערה: המתכון עבור הפתרון החסימה היא: 125 מ מ פוספט מאגר (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25% מרחביות (w/v), 0.5 מ מ EDTA, האס X 0.5, 1% BSA (w/v).</li>
	<li>לשטוף את השקופיות פי 2 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר 500 מ ל מים מזוקקים. יבש את השקופיות על-ידי צריך שתוציאו בשביל 10 s בטמפרטורת החדר ומפרידה microarray. מאגר מערכי במקום חשוך ויבש עד 6 חודשים.</li>
</ol>5. מערך הכלאה
<ol><li>לפני הכלאה השקופיות במים רותחים, שוטפים ומייבשים על ידי צנטריפוגה (כמו 4.6).</li>
	<li>במקום מערך בתוך קלטת הכלאה וטען radiolabeled מדגם ה-RNA.</li>
	<li>להפעיל תחנת הכלאה-כביסה אוטומטיים הפארמצבטית המרבי.<ol>
<li>תוכנית השלבים להלן. אטמים תנאי למשך 2 דקות ב 75 º C. להציג את המכשיר ב 60 מעלות צלזיוס. Denature הגששים ודוגמאות 5 דקות ב- 90 ° C. Hybridize דוגמאות עבור h 3 ב 60 מעלות צלזיוס.<ol>
<li>לשטוף שקופיות ב 50 מעלות צלזיוס פעמיים עם 2 X האס, 0.1% (w/v) מרחביות, זרימה 10 s והחזק 20 ס' שטיפת שקופיות ב 42 ° C פעמיים עם 0.1 X SSC, 0.1% מרחביות, זרימה 10 s והחזק שקופיות שטיפת ס' 20-42 ° C פעמיים עם 0.1 X האס , זרימה 10 s ו- s להחזיק 20.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>יבש שקופיות על ידי צנטריפוגה (כמו 4.6).</li>
</ol>6. מערך כמת
<ol><li>גלישת טקסט שקופיות באמצעות סרט פלסטיק דק. בדוק שקופיות לאות רדיואקטיבי בעזרת מונה גייגר על ההגדרה הרגישים ביותר שלה. חושפים את השקופיות על מסך פוספור אחסון במגרה חשיפה בטמפרטורת החדר במשך 10-90 h בהתאם עוצמת האות. הערה: כפי הרגישות של מוני גייגר משתנים בין מכשיר אחד למשנהו, פעמים חשיפה חייב להיות מותאם מדעית.</li>
	<li>סריקת שקופיות ברזולוציה 50 מיקרומטר, באמצעות phosphorimager. לכמת ולחסר רקע-עוצמות קרינה רדיואקטיבית בנקודה כל בדיקה באמצעות תוכנה J תמונה חופשית משודרג עם פרופיילר microarray.</li>
	<li>לארגן, לעבד נתונים באמצעות גיליון אלקטרוני אלקטרונית. צור מפות חום באמצעות כלי עיצוב מותנה. מייצגים לדוגמה כל אות בדיקה כשבר (המתבטא וניתן) של האות הכולל בדיקה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli.">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).</li><li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences.">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li><li>Gieg&#233;, R., J&#252;hling, F., P&#252;tz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+transfer+RNAs:+similarity+and+variability.">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li><li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs.">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li><li>Torres, A. G., Pi&#241;eyro, D., Rodr&#237;guez-Escrib&#224;, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-L&#233;ger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+modifications+in+human+tRNAs+are+incorporated+at+the+precursor+tRNA+level.">Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level.</a> Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).</li><li>Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Mar&#233;chal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes.">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li><li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing.">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOt:+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels.">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).</li><li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST,+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases.">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-&#946;-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression.">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-&#946;-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li><li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis.">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li><li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GtRNAdb:+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence.">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li><li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli.">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li></ol>

אין ניגוד אינטרסים הכריז.

פליטת חלקיקי ביתא ידועים סוכנים אחרים bacteriostatic14, אולם קרינה בטווח שנבדקו יש השפעה משמעותית על כושר התא. נצנוץ ספירת הראה כי הרדיואקטיביות הוא שולב 25% סה כ- cell תמציות ובהמשך, 1% של RNAs הכולל מטוהרים.
את הגששים בגדלים זהים, טמפרטורת ההיתוך דומה ותוכן GC, יחד עם פרוטוקול אחיד לאיתור macroarray, הכלאה, כימות מאפשר למדידת רמות tRNA ישירות מן האותות ספוט לא משוחדת.
המקום הספציפי הדירים. שלה טווח גדול ודינמי, סף מתכוונן בקלות מאפשר יצירת פרופיל נמוך שופע מינים, כגון tRNAs הקשורים polysomes, פשוט על-ידי הארכת מערך החשיפה פעמים9. לאחר ההשקעה הראשונית עבור הציוד הנדרש, הפעלה עלות לדוגמה, כולל מתכלים, הממוצע של 15 דולר לכל דגימות.
ספוט חל כל אורגניזם הגנום של מי זמין עבור עיצוב המכשיר. אורגניזמים דוגמנית מגודלים במבחנה הם מועמדים אידיאליים עבור תיוג מטבולית. כמו הגנום יונקים לעתים קרובות לקודד רבים isodecoders (tRNAs לשתף anticodons זהה, אך הצגת הבדלים קטנים ברצפים הגוף שלהם) הגששים צריך להיות חלקית מנוונת לשמר הומוגנית הכלאה של מינים קרובים tRNA. לבסוף, תאים בתרבית של חסיד תשואה נמוכה יותר בדרך כלל כמויות של RNA הכולל לעומת אורגניזמים גדל ההשעיה כגון smegmatis מ', כך תרבויות צריך להיות קנה המידה באופן משמעותי.

רמות tRNA הסלולר משתנים בהתאם לתנאים כגון סוג התא, הסביבה מתח1,2,3. ספוט, פלטפורמה יעילה להתבוננות tRNA, הוא המקורי, אמין, טכניקה פשוטה המאפשר כימות מהיר ומדויק של העברת RNA רמות אורגניזמים שגודלו במעבדה.
tRNAs יש מבנים משניות ושלישוניות יציב4. הם גם מציגים שינויים post-transcriptional מספר5. תכונות אלה מייצגים מבני משמעותי והמחסומים רצף ממתח או לפעמים מניעת לשחזור הישירים tRNA פרופיל משתמש ביצוע סטנדרטיים RNA כימות טכניקות6. קבוצות מחקר ברחבי העולם נאלצו לפתח טכניקות יצירתי אך לעיתים קרובות מפותל כדי להעריך את רמות tRNA הסלולר. כמה שיטות אלו כוללים: (1) הפרדת tRNAs סמויה שכותרתו electrophoretic דו-ממדית בשילוב עם הקצאה ספוט שיטתי על-ידי חשופה צפון1; (2) כימות בודדים על ידי צפון למחוק משתמש בזהירות מתוקננת רדיואקטיבי DNA הגששים7; (3) לאחר החילוץ תיוג עם cyanine fluorochromes ואחריו microarray ניתוח3ו (4) במבחנה בנוכחות אחר של tRNA ייודע אנזימים demodification רקומביננטי, אשר בשילוב עם שעתוק במהופך רצף תפוקה גבוהה8.
המקום פשוט ומקורי בשילוב של שתי הגישות רגילה וישירה: גוף (1) RNA תיוג, אשר מורכב ב הסינתזה, גדל אורגניזמים, רדיואקטיבי RNAs סה כ ו (2) tRNA macroarrays, כלי גנומית שיטתית, ולמחקר אופטימיזציה עבור tRNA סגרגציה.
דוגמאות בנויים אווירודינמית של אורגניזמים פלטפורמת כמת. הם מנותחים ישירות לאחר החילוץ, לא מעובד רחוק יותר אשר מגביל משמעותית את הטיות לעומת טכניקות הדורשות החילוץ שלאחר הגברה או טיפולים אנזימטיות. מקום רב תכליתי, ניתן לשלב בקלות כדי polysome fractionation כדי לזהות ולכמת subpopulations tRNA המשויכות פיזית לתרגם את הריבוזומים.
פרוטוקול המובאת כאן ממוטבת עבורו Mycobacterium smegmatis, גם בהצלחה שהשתמשו tRNAs פרופיל ב- Escherichia coli9 האפייה10, עכבר, תרביות תאים אנושיים11 .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass slide indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide arrayer replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash and blot station</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replicator pin dryer</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>K2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizer / Automated hybridization and washing station</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>Hyb10022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Eppendorf Themomixer</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap 2 ml tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21-403-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[32P] Na2HPO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX011001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm glass beads</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>9831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini bead mill</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphore screen</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP SR 0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Typhoon FLA7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>Select series 254 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray centrifuge</td>
			<td>Arrayit Corporation</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>700084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use needles</td>
			<td>BD (Becton Dickinson)</td>
			<td>305185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-666-317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precipitant (GlucoBlue)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridisation cassette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>63-0035-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M126-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>A3611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Phosphate buffer pH 7.2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ63974AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays

העברת RNAs (tRNA) נמצאים בשפע קצר ללא קידוד RNA מינים שהם בדרך כלל 76 ל-90 נוקלאוטידים אורך. tRNAs אחראים ישירות על סינתזת החלבון על ידי מתרגם codons ב mRNA לתוך רצפים של חומצות אמיניות. tRNAs נחשבו זמן כמו מולקולות משק בית חסר פונקציות רגולטוריות. עם זאת, גוף גדל והולך של ראיות מציין כי רמות tRNA הסלולר משתנים בהתכתבות לתנאים משתנים כגון סוג התא, הסביבה מתח. התנודות של tRNA ביטוי השפעות ישירות ג'ין תרגום, העדפה או מדחיק את הביטוי של חלבונים מסוימים. בסופו של דבר בדיוק את הדינמיקה של סינתזת חלבונים מחייב בפיתוח שיטות מסוגל לספק פרופילים tRNA באיכות גבוהה. השיטה שבה אנו מציגים כאן נקרא המקום, אשר מייצג עבור פלטפורמה יעילה Observing tRNA. ספוט בנויות משלושה שלבים החל תיוג מטבולית של תרביות תאים עם האורטו רדיואקטיבי, ואחריו guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם החילוץ של RNAs הכולל רדיואקטיבי והודפס סוף סוף הכלאה-ללא צורך במיקור חוץ macroarrays. רמות tRNA מוערך על ידי לכימות עוצמות קרינה רדיואקטיבית בנקודה כל בדיקה. בפרוטוקול המובאת כאן אנחנו פרופיל tRNAs Mycobacterium smegmatis mc2155, חיידק nonpathogenic משמש לעתים קרובות כאורגניזם מודל כדי ללמוד שחפת.

שלושה ביולוגית עצמאית משכפל מראים כי, בכפוף לתנאים צמיחה שנבדקו, כל מ smegmatis tRNAs באים לידי ביטוי מעל פני רקע (איור 1). בניסוי מסוים זה, נצפתה סטיית התקן עבור כל בדיקה מורכבת בין 2% (Arg (TCT)) 22% (Cys (GCA)) עם חציון ב-5% (איור 1). שינויים שווא בין משכפל מושפעים באופן משמעותי גורמים כמו הכלאה והכנה של מערך. הפארמצבטית גבוהה מושגת באמצעות מערך זהיר ועקבית הדפסה, כמו גם אוטומטי מדגם הכלאה. יש הבדל 5-fold בין סינתזת איל (גת) ו- tRNA (Val (עיגול), המין הגבוה ביותר ושופע הנמוך ביותר בהתאמה. המקום מראה כי הביטוי של tRNA isoacceptors אינה אחידה. Isoacceptors הם מינים להחזיק את חומצת אמינו אותו אבל להציג רצפים שונים anticodon ופענוח ולכן שונים codons על mRNAs. לדוגמה, כל isoacceptors אלנין באים לידי ביטוי ברמות דומות, ואילו ארגינין הגבוהים והנמוכים ביותר tRNAs מקבל נבדלים מקופלים ל- 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> איור 1: נציג tRNA macroarray תוצאות. (א) שנסרקו בקטריאלי, העכבר, macroarrays האנושית. מ smegmatis מערכים להשתמש רק 43 הגששים במקום 48 על העכבר ועל האדם. כתוצאה מכך, המערך חיידקי מציג כתמים ריקים 40 (הגששים משוכפלים שמונה פעמים על כל מערך) כי להתמזג עם הרקע. רובם מקובצים בפינה השמאלית העליונה. (B) ייצוגים היסטוגרמה, heatmap פרופילי tRNA smegmatis מ בתנאים מיטביים לצמיחה. אותות לווין הממוצע של 3 ניסויים עצמאית (כולל התפתחות חיידקים, תיוג מטבולית, הכלאה החילוץ ית), באים לידי ביטוי לפי אלף ערכים של tRNAs הכולל. סטיות תקן עבור שלושה משכפל מסומנים קווי שגיאה, גוונים של כתום על ההיסטוגרמה, heatmap בהתאמה. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays at JoVE.com

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

אנו מתארים פלטפורמה ניתוח העברה RNA המקורי בשם ספוט (פלטפורמה יעילה להתבוננות tRNA). המקום בו זמנית מודד רמות התאית של כל tRNAs בדגימות ביולוגיות, רק שלושה צעדים, פחות מ-24 שעות.

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

תא המבוסס על מבחני של SINEUP ללא קידוד RNAs זה במיוחד יכולה לשפר את התרגום mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing RNAs Noncoding זמן באמצעות הפעלת גנים CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...