Name: metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00
Duration: 10 min 56 s
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यह काम नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंस-NIH (P20GM103499 to r) और पलाश CA555536 एंड CA154664 नेशनल कैंसर इंस्टिट्यूट से P.H.H. को एससी INBRE ग्रांट द्वारा सपोर्ट किया गया था इस कार्यक्रम के भाग में पूर्व के माध्यम से हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान से चार्ल्सटन के कॉलेज के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था कॉलेज और स्नातक विज्ञान शिक्षा कार्यक्रम और राष्ट्रीय अनुसंधान संसाधन के लिए केंद्र से अनुदान द्वारा (5 P20 RR016461) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (8 P20 GM103499) राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से ।

1. संस्कृति और चयापचय लेबलिंग
<ol><li>प्रहार एक बार एक बाँझ १.५ मिलीलीटर की टोपी के केंद्र माइक्रो एक 18-गेज सुई के साथ ट्यूबों के लिए उचित वातन अनुमति देते हैं । लगाना ५०० µ एक स्टार्टर संस्कृति से एम smegmatis के 5 µ एल के साथ पूरक बाँझ 7H9 शोरबा के एल12रातोंरात हो गया । नोट: 7H9 शोरबा के एक लीटर के लिए नुस्खा है: ४.७ g वाणिज्यिक 7H9 पाउडर, 2 मिलीलीटर ग्लिसरॉल, 1 एमएल के बीच ८०, ०.८५ ग्राम NaCl, 5 जी एल्ब्युमिन, 2 जी डेक्सट्रोज, एच2ओ (1 एल के लिए कुल मात्रा लाने के लिए) ।<ol>
<li>
(सावधानी) मानक radioprotection प्रथाओं के बाद, 20 µ ci के साथ संस्कृति मीडिया स्पाइक [३२P] Na2HPO4। ३७ डिग्री सेल्सियस और १,२०० rpm आंदोलन में बैक्टीरिया बढ़ने, एक शेखर एक 9 मिमी मोटी एक्रिलिक शील्ड के पीछे रखा मशीन में ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>midlog चरण में (ओ. डी. 600 एनएम ~ ०.५), एक 2-एमएल भाड़ में पूरी संस्कृति हस्तांतरण टोपी ट्यूब और कमरे के तापमान पर एक गोली रेडियोधर्मी बैक्टीरिया के लिए केंद्रापसारक द्वारा 2 मिनट में १०,००० x g. supernatant में शामिल है उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर ।</li>
</ol>2. कुल RNAs की तैयारी
नोट: कुल RNAs निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन एक वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट (युक्त guanidinium thiocyanate, phenol और क्लोरोफॉर्म) का उपयोग कर बैक्टीरियल छर्रों से निकाले जाते हैं ।
<ol><li>वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट और गोली पर कांच मोतियों की लगभग २०० µ एल के 1 मिलीलीटर जोड़ें । ट्यूब सुरक्षित रूप से कैप और अधिकतम आंदोलन के तहत 2 मिनट के लिए एक homogenizer में बैक्टीरिया को बाधित, (चुना साधन पर नंबर पांच की स्थापना ( सामग्री की तालिकादेखें)).</li>
	<li>4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक । supernatant एक नया 2-एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और मोतियों का उचित त्याग । जोड़ें क्लोरोफॉर्म की ०.२ मिलीलीटर और शेक ट्यूब हाथ से जोरदार 15 एस के लिए १२,००० x g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।</li>
	<li>४५ डिग्री पर ट्यूब angling द्वारा एक नया ट्यूब में नमूना के जलीय चरण लीजिए । किसी भी चरण या कार्बनिक परत के ड्राइंग से बचें । रंगीन precipitant और १००% isopropanol के ०.५ मिलीलीटर के 2 µ एल जोड़ें । 5 एस के लिए हाथ से ट्यूब जोरदार शेक 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १२,००० x जी पर केंद्रापसारक ।</li>
	<li>ट्यूब से supernatant निकालें और उचित रूप में तरल अंश रेडियोधर्मिता के निशान शामिल हो सकते हैं के रूप में छोड़ दें । 5 मिनट के लिए एयर ड्राई गोली तो 2x खारा के २०० µ एल में reसस्पेंड-सोडियम साइट्रेट (एसएससी), ०.१% (डब्ल्यू/वी) सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) अंतिम । नोट: स्टॉक 20 एक्स एसएससी की संरचना ३.० एम NaCl, ०.३ एम सोडियम साइट्रेट, पीएच ७.० है ।</li>
</ol>3. ९६ अच्छी तरह से प्रिंटर प्लेट की तैयारी
नोट: tRNA microarrays मैंयुअल रूप से ४२ ७०-मेर डीएनए oligonucleotides के साथ मुद्रित कर रहे है प्रत्येक एम. smegmatis tRNA (टर्मिनल सीसीए छोड़ दिया) के 3 ' अंत के पूरक एक आठ पिन सरणी का उपयोग कर । डीएनए oligonucleotide जांच के जुगाड़ के साथ-साथ वेल प्लेट में जांच लेआउट और व्यूह रचना (अनुपूरक फाइल 1-शीट 1 से 3 क्रमश) उपलब्ध कराई गई है ।
<ol><li>डिजाइन डीएनए जांच पहले tRNA अनुक्रम या tRNA डेटाबेस से tRNA एंकोडिंग जीन जैसे जीनोमिक tRNA डेटाबेस13के रूप में वापस लाने के द्वारा । ट्रिम कर दीजिए 3 ' अंत सीसीए इनकोडिंग अगर संरक्षित । रिवर्स परिणामस्वरूप अनुक्रम पूरक । प्रथम ७० न्यूक्लियोटाइड के आधार पर आदेश जांच ।</li>
	<li>पानी में सूखे डीएनए जांच को फिर से सस्पेंड । समायोजित जांच एकाग्रता के लिए १०० µ एम । एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट में, ५० µ एम ओलिगोस्पर्मिया के 3x एसएससी में १२० µ एल तैयार, ०.०१% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस अंतिम (शेयर जांच के पतला ६० µ एल µ एसएससी के ६० 6X एल के साथ व्यक्तिगत रूप से, ०.०१% (डब्ल्यू/</li>
	<li>टिन पंनी के साथ प्लेट कवर वाष्पीकरण या संदूषण को रोकने के लिए, तुरंत फ्रीज और जरूरत से कम-20 डिग्री सेल्सियस रखें ।</li>
</ol>4. सरणी मुद्रण
<ol><li>गल कमरे के तापमान पर ९६ अच्छी तरह से थाली (लगभग 20 मिनट लेता है) ।</li>
	<li>एक हीरे की कलम के साथ लेबल अमीन-लेपित ग्लास स्लाइड । स्लाइड अनुक्रमण इकाई में रखें । ग्रिड प्लेसमेंट का पालन करें और निंनानुसार है ।<ol>
<li>ध्यान से कुओं में रेप्लिकेटर पिन डुबकी ।</li>
		<li>धीरे गिलास स्लाइड पर सरणी प्रिंट, ंयूनतम दबाव का उपयोग (आप एक छोटे से प्रतिरोध महसूस होगा) । किसी ब्लॉक के साथ पूर्ण होने तक सरणी को साफ़ किए बिना मुद्रण जारी रखें ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>जब अगले ब्लॉक करने के लिए आगे बढ़ने के लिए तैयार है, नीचे वर्णित वाशिंग प्रक्रिया का पालन करें ।<ol>
<li>डुबकी रेप्लिकेटर में 5% ब्लीच और धीरे शेक ।</li>
		<li>प्रेस शोषक कागज में रेप्लिकेटर ।</li>
		<li>आसुत जल में डुबकी रेप्लिकेटर, धीरे से हिला, और कागज में प्रेस । इस चरण को एक बार दोहराएं ।</li>
		<li>isopropanol में डुबकी रेप्लिकेटर, धीरे से हिला, और कागज में प्रेस ।</li>
		<li>९६-वेल प्लेट के अगले ब्लॉक पर जाने से पहले के बारे में 20 एस के लिए पंखे पर रेप्लिकेटर सूखी । प्रिंट की वांछित संख्या जारी रखें ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>स्लाइड् स को शुष्क करने की अनुमति दें २५४-एनएम यूवी crosslinker का उपयोग करके ओलिगोस्पर्मिया को crosslink करें ।<ol>
<li>९९९,९९० µJ/cm2के लिए ऊर्जा स्तर सेट करें ।</li>
		<li>स्लाइडों को crosslinker में साफ सतह पर रखें । प्रेस "प्रारंभ" ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>एक चुंबकीय सरगर्मी पर, कमरे के तापमान पर और धीमी गति से आंदोलन के तहत अवरुद्ध समाधान के ४५० मिलीलीटर में रातोंरात arrays ब्लॉक । इकट्ठा और चार बार करने के लिए समाधान अवरुद्ध पुन: उपयोग । नोट: ब्लॉकिंग समाधान के लिए नुस्खा है: १२५ mm फॉस्फेट बफर (णः2PO4/Na2HPO4-) pH ७.२, २.२५% एसडीएस (w/v), ०.५ mm EDTA, 0.5 x SSC, 1% BSA (w/</li>
	<li>५०० मिलीलीटर के कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए स्लाइड को 2 बार धोकर आसुत जल में रखें । एक microarray केंद्रापसारक में कमरे के तापमान पर 10 एस के लिए केंद्रापसारक द्वारा स्लाइड शुष्क । 6 महीने तक के लिए एक सूखी और अंधेरे जगह में स्टोर arrays ।</li>
</ol>5. सरणी संकरण
<ol><li>पहले उबलते पानी में संकरण कुल्ला स्लाइड और केंद्रापसारक द्वारा सूखी (के रूप में ४.६ में) ।</li>
	<li>एक संकरण कैसेट और लोड radiolabeled आरएनए नमूना अंदर सरणी प्लेस ।</li>
	<li>अधिकतम reproducibility के लिए स्वचालित संकरण-वाशिंग स्टेशन चलाएं ।<ol>
<li>निंन के रूप में प्रोग्राम चरण । ७५ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए शर्त गैसकेट । ६० डिग्री सेल्सियस पर जांच का परिचय । स्वभाव जांच और नमूने ९० डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट । ६० डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए संकरण नमूने ।<ol>
<li>५० डिग्री सेल्सियस पर दो बार 2x एसएससी, ०.१% (डब्ल्यू/वी) एसडीएस, फ्लो 10 एस और 20 एस. धो स्लाइड ४२ डिग्री सेल्सियस पर दो बार 0.1 x ssc, ०.१% एसडीएस, फ्लो 10 एस के साथ और पकड़ 20 s. धो स्लाइड पर ४२ ° c दो बार के साथ ०.१ x ssc , प्रवाह 10 एस और 20 एस पकड़ो ।</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>केंद्रापसारक द्वारा सूखी स्लाइड (के रूप में ४.६ में) ।</li>
</ol>6. सरणी ठहराव
<ol><li>एक पतली प्लास्टिक की फिल्म का उपयोग स्लाइड लपेटें । इसकी सबसे संवेदनशील सेटिंग पर एक Geiger काउंटर का उपयोग रेडियोधर्मी संकेत के लिए स्लाइड की जाँच करें. संकेत शक्ति के आधार पर 10 से ९० एच के लिए कमरे के तापमान पर एक जोखिम कैसेट में एक भंडारण फास्फोरस स्क्रीन पर स्लाइड बेनकाब । नोट: Geiger काउंटर की संवेदनशीलता के रूप में एक उपकरण से दूसरे करने के लिए भिन्न, एक्सपोज़र बार ऑप्टिमाइज़ empirically होना आवश्यक है ।</li>
	<li>५० µm एक phosphorimager का उपयोग कर समाधान पर स्लाइड स्कैन करें । यों तो और पृष्ठभूमि-एक microarray profiler के साथ उंनत मुफ्त छवि जंमू सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक जांच मौके पर रेडियोधर्मिता तीव्रता घटाना ।</li>
	<li>इलेक्ट्रॉनिक स्प्रेडशीट का उपयोग करके डेटा व्यवस्थित और संसाधित करें । सशर्त स्वरूपण उपकरण का उपयोग करके हीट मैप्स जनरेट करें । उदाहरण के लिए कुल जांच संकेत के एक अंश के रूप में प्रत्येक जांच संकेत (‰ में व्यक्त) का प्रतिनिधित्व करते हैं ।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli.">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).</li><li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. 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ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

बीटा कण उत्सर्जन बैक्टीरियोस्टेटिक और जीवाणुनाशक एजेंटों14जाना जाता है, लेकिन परीक्षण रेंज में विकिरण सेल फिटनेस पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव है । जुटाना गिनती से पता चला है कि रेडियोधर्मिता कुल के 25% में शामिल किया गया है-सेल निष्कर्षों और बाद में, शुद्ध कुल RNAs का 1%.
जांच ' समान आकार, पिघलने तापमान और GC सामग्री, macroarray खोलना के लिए एक समान प्रोटोकॉल के साथ तुलना, संकरण और ठहराव स्पॉट संकेतों से सीधे tRNA स्तर के निष्पक्ष माप के लिए अनुमति देता है ।
स्पॉट प्रतिलिपि व विशिष्ट आहे. इसकी बड़ी गतिशील रेंज और आसानी से समायोज्य दहलीज इस तरह के polysomes के साथ जुड़े tRNAs के रूप में कम प्रचुर मात्रा में प्रजातियों, की अनुमति देता है, बस सरणी जोखिम बार9लंबे समय तक । आवश्यक उपकरणों के लिए प्रारंभिक निवेश के बाद प्रति नमूना चलित लागत, उपभोग्य सामग्रियों सहित, औसत $१५ प्रति नमूने.
स्पॉट किसी भी जीव पर लागू होता है जिसका जीनोम जांच डिजाइन के लिए उपलब्ध है । मॉडल जीवों कि इन विट्रो में बड़े हो रहे हैं चयापचय लेबलिंग के लिए आदर्श उम्मीदवार हैं. के रूप में स्तनधारी जीनोम अक्सर कई isodecoders सांकेतिक शब्दों में बदलना (tRNAs कि शेयर समान anticodons, लेकिन उनके शरीर के दृश्यों में छोटे मतभेदों को प्रदर्शित) जांच के लिए आंशिक रूप से बंद समरूप प्रजातियों के संकरण tRNA के संरक्षण के लिए पतित होने की जरूरत है । अंत में, अनुयाई स्तनधारी कोशिकाओं को आम तौर पर कुल आरएनए का कम मात्रा में ऐसे एम. smegmatisजैसे निलंबन में हो जीवों की तुलना में उपज है, तो संस्कृतियों को काफी पैमाने पर किया जाना चाहिए ।

सेलुलर tRNA स्तर सेल प्रकार, पर्यावरण, और तनाव1,2,3जैसे स्थितियों के अनुसार बदलेंगी । हाजिर, tRNA अवलोकन के लिए सुव्यवस्थित मंच, एक मूल, विश्वसनीय, और सरल तकनीक है कि प्रयोगशाला में स्थानांतरण आरएनए स्तरों के तेजी से और सटीक ठहराव-उगाया जीवों की अनुमति देता है.
tRNAs उल्लेखनीय स्थिर माध्यमिक और तृतीयक संरचनाओं4है । उंहोंने यह भी कई पोस्ट transcriptional संशोधन5प्रदर्शन । ये विशेषताएं महत्वपूर्ण संरचनात्मक और अनुक्रम बाधाओं पक्षपातपूर्ण या कभी-कभार मानक बेंचमार्क आरएनए ठहराव तकनीकों का उपयोग करते हुए प्रत्यक्ष और प्रतिलिपि tRNA को रोकने का प्रतिनिधित्व करती हैं6. दुनिया भर के अनुसंधान समूहों को रचनात्मक लेकिन अक्सर जटिल तकनीक सेलुलर tRNA स्तर का आकलन करने के लिए विकसित करने के लिए मजबूर किया गया । इन तरीकों में से कुछ में शामिल हैं: (1) चयापचयी लेबल tRNAs के दो आयामी electrophoretic जुदाई उत्तरी दाग1द्वारा व्यवस्थित स्थान असाइनमेंट के साथ संयुक्त; (2) उत्तरी ब्लाट द्वारा व्यक्तिगत ठहराव ध्यान मानकीकृत रेडियोधर्मी डीएनए जांच7का उपयोग; (3) के बाद cyanine fluorochromes के साथ निष्कर्षण लेबलिंग microarray विश्लेषण के द्वारा पीछा किया3, और (4) इन विट्रो tRNA संयोजक संशोधन रिवर्स प्रतिलेखन और बाद के साथ संयुक्त एंजाइमों का उपयोग संशोधनों के अलग करना उच्च-प्रवाह sequencing8।
स्पॉट दो मानक और सीधा दृष्टिकोण का एक सरल और मूल संयोजन है: (1) आरएनए बॉडी लेबलिंग, जो संश्लेषण में होते हैं, जीवों को उगाने में, रेडियोधर्मी कुल RNAs की और (2) tRNA macroarrays, एक व्यवस्थित और लघुकृत जीनोमिक उपकरण tRNA अलगाव के लिए अनुकूलित ।
नमूनों में रहने वाले जीवों से ठहराव प्लेटफार्म को सुव्यवस्थित कर रहे हैं. वे सीधे निष्कर्षण के बाद का विश्लेषण कर रहे है और किसी भी आगे जो काफी सीमा के बाद निष्कर्षण प्रवर्धन या एंजाइमी उपचार की आवश्यकता तकनीक की तुलना में पूर्वाग्रह सीमाएं सीमित नहीं है । स्पॉट बहुमुखी है और आसानी से polysome भिन्नीकरण करने के लिए संयुक्त किया जा सकता है की पहचान करने और tRNA उपजनसंख्या कि शारीरिक रूप से ribosomes अनुवाद के साथ जुड़े रहे हैं यों तो ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल माइकोबैक्टीरियम smegmatisके लिए अनुकूलित है, और यह भी सफलतापूर्वक ई कोलाई9, Saccharomyces cerevisiae10, माउस, और मानव कोशिका संस्कृतियों11 में प्रोफ़ाइल tRNAs के लिए इस्तेमाल किया गया था .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass slide indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide arrayer replicator</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate indexing system</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash and blot station</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replicator pin dryer</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc.</td>
			<td>VP 474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine coated slides</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>K2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridizer / Automated hybridization and washing station</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>Hyb10022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker incubator</td>
			<td>Eppendorf Themomixer</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap 2 ml tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21-403-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[32P] Na2HPO4</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEX011001MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm glass beads</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>9831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini bead mill</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage phosphore screen</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP SR 0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Typhoon FLA7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>Select series 254 nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray centrifuge</td>
			<td>Arrayit Corporation</td>
			<td>MHC110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>700084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use needles</td>
			<td>BD (Becton Dickinson)</td>
			<td>305185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml centrifuge tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-666-317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precipitant (GlucoBlue)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 X SSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridisation cassette</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>63-0035-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>M126-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>A3611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Phosphate buffer pH 7.2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ63974AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays

स्थानांतरण RNAs (tRNA) प्रचुर मात्रा में कम गैर कोडिंग आरएनए प्रजातियों है कि आम तौर पर कर रहे है ७६ ९० न्यूक्लियोटाइड लंबाई में । tRNAs एमिनो एसिड अनुक्रम में mRNA में codons अनुवाद द्वारा प्रोटीन संश्लेषण के लिए सीधे जिंमेदार हैं । tRNAs लंबे समय से घर के रूप में विचार कर रहे थे अणुओं है कि विनियामक कार्यों का अभाव रखते हुए । हालांकि, सबूत के एक बढ़ती शरीर इंगित करता है कि सेलुलर tRNA स्तर जैसे सेल प्रकार, पर्यावरण, और तनाव के रूप में बदलती स्थितियों के लिए पत्राचार में उतार चढ़ाव । tRNA अभिव्यक्ति का उतार चढ़ाव सीधे जीन अनुवाद को प्रभावित करता है, एहसान या विशेष रूप से प्रोटीन की अभिव्यक्ति का दमन । अंततः प्रोटीन संश्लेषण के गतिशील समझने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले tRNA प्रोफाइल देने में सक्षम तरीकों के विकास की आवश्यकता है । विधि है कि हम यहां मौजूद नाम स्थान है, जो tRNA देख के लिए सुव्यवस्थित मंच के लिए खड़ा है । स्पॉट तीन रेडियोधर्मी orthophosphate के साथ कोशिका संस्कृतियों के लेबलिंग के साथ शुरू चरणों के होते हैं, रेडियोधर्मी कुल क्लोरोफॉर्म के guanidinium thiocyanate-phenol-RNAs निष्कर्षण द्वारा पीछा किया और अंत में संकरण पर मुद्रित घर macroarrays । tRNA स्तरों प्रत्येक जांच के मौके पर रेडियोधर्मिता तीव्रता को बढ़ाता द्वारा अनुमानित हैं । प्रोटोकॉल में यहां प्रस्तुत हम माइकोबैक्टीरियम smegmatis mc2१५५ में प्रोफ़ाइल tRNAs, एक रोगजनक जीवाणु अक्सर एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल के लिए तपेदिक का अध्ययन ।

तीन स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति बताते है कि, परीक्षण वृद्धि की स्थिति के तहत, सभी एम smegmatis tRNAs पृष्ठभूमि स्तर (चित्रा 1) के ऊपर व्यक्त कर रहे हैं । इस विशेष प्रयोग में, प्रत्येक जांच के लिए मनाया मानक विचलन 2% (Arg (TCT)) और 22% (Cys (जीसीए)) के बीच 5% पर एक औसत के साथ (चित्रा 1) शामिल है । प्रतिकृति के बीच False परिवर्तन उल्लेखनीयतया सरणी तैयारी और संकरण जैसे कारकों से प्रभावित होते हैं । उच्च reproducibility सावधान और सुसंगत सरणी मुद्रण के माध्यम से प्राप्त की है और साथ ही स्वचालित नमूना संकरण । tRNA इले (गात) और tRNA (वैल (टीएसी), क्रमशः उच्चतम और निम्नतम प्रचुर प्रजातियों के बीच 5 गुना अंतर है । स्पॉट से पता चलता है कि tRNA isoacceptors की अभिव्यक्ति वर्दी नहीं है । Isoacceptors प्रजातियों है कि एक ही एमिनो एसिड पकड़ लेकिन विभिंन anticodon दृश्यों प्रदर्शन और इसलिए mRNAs पर विभिंन codons समझाना है । उदाहरण के लिए, सभी Alanine isoacceptors समान स्तर पर व्यक्त किए जाते हैं, जबकि उच्चतम और निंनतम Arginine स्वीकार tRNAs 3-गुना से भिंन होते हैं ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> चित्र १: प्रतिनिधि tRNA macroarray परिणाम. (क) स्कैन किए गए जीवाणु, माउस और मानव macroarrays. M. smegmatis arrays माउस और मानव के लिए ४८ के बजाय केवल ४३ जांच का उपयोग करें । एक परिणाम के रूप में, बैक्टीरियल सरणी प्रदर्शित करता है ४० खाली धब्बे (जांच प्रत्येक सरणी पर आठ बार दोहराया जाता है) कि पृष्ठभूमि के साथ मिश्रण । उनमें से ज्यादातर ऊपरी बाएं कोने में संकुल रहे हैं । (ख) M. smegmatis में tRNA प्रोफाइल के हिस्टोग्राम और heatmap निरूपण इष्टतम वृद्धि की स्थिति में । जांच संकेतों में तीन स्वतंत्र प्रयोगों का औसत है (बैक्टीरियल विकास, चयापचय लेबलिंग, निष्कर्षण और सरणी संकरण सहित) और कुल tRNAs के हजार मूल्यों के अनुसार व्यक्त कर रहे हैं । तीन के लिए मानक विचलन त्रुटि पट्टियों और क्रमशः हिस्टोग्राम और heatmap पर नारंगी रंग के रूप में इंगित कर रहे हैं । <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

हम स्थान (मेटाबॉलिज्म tRNA के लिए सुव्यवस्थित प्लेटफ़ॉर्म) नामक एक मूल स्थानांतरण आरएनए विश्लेषण प्लेटफ़ॉर्म का वर्णन करते हैं. स्पॉट एक साथ केवल तीन चरणों में जैविक नमूनों में सभी tRNAs के सेलुलर स्तर, और 24 घंटे से कम समय में उपाय ।

चयापचय लेबलिंग और स्थानांतरण RNAs Macroarrays का उपयोग कर की रूपरेखा

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Research

JoVE Journal

Genetics

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